CC BY
57
ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 577.21
А. И. Гогинашвили, К. В. Волков, Л. Н. Миронова
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКСПРЕССИОННОЙ БИБЛИОТЕКИ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОВ, СВЕРХЭКСПРЕССИЯ КОТОРЫХ ПРИВОДИТ К ИНДУКЦИИ ПРИОНОПОДОБНОГО ДЕТЕРМИНАНТА [ISP+] У ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CERE-VISIAE *
Введение
Прионы — стабильные конформационные изомеры белков, характеризующиеся способностью к автокаталитическому поддержанию этого состояния за счет однонаправленных конформационных переходов из нативной формы белка в прионную [20]. Возникновение и накопление прионной формы некоторых белков является причиной нескольких неизлечимых нейродегенеративных заболеваний млекопитающих. К таким болезням относятся, в частности, болезни Крейцфельдта—Якоба и куру у человека, скрепи у овец, а также губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота. При этих заболеваниях накопление в тканях центральной нервной системы особых амилоидных бляшек — отложений агрегированной и устойчивой к действию протеаз прионной формы клеточного белка PrP приводит к летальному исходу.
Помимо млекопитающих, прионы обнаружены и у низших эукариот — дрожжей Saccharomyces cerevisiae и плесневого гриба Podospora anserina. У этих организмов прионы представляют собой нехромосомные наследственные детерминанты, имеющие белковую природу (см. [4]). В настоящее время идентифицированы и исследованы (хотя и в разной степени) три дрожжевых приона: [PSI+], [URE3] и [PIN] (см. [28]). Исследование феномена прионного наследования и теоретическая возможность разработки относительно простых моделей для диагностики и лечения прионных заболеваний млекопитающих и человека делают актуальной задачу поиска и идентификации новых прионов у дрожжей S. cerevisiae.
В нашей лаборатории обнаружен нехромосомный детерминант, проявляющий анти-супрессорный эффект по отношению к некоторым нонсенс-супрессорным мутациям в гене SUP35. Этот детерминант обозначен как [ISP+]. Исследование его свойств показало, что он, возможно, представляет собой прион [26].
Для того чтобы подтвердить прионную природу [ISP+], необходимо выявить структурный ген, кодирующий белок, прионная форма которого идентифицируется как детерминант [ISP+]. Такой ген может быть найден среди генов, контролирующих возникновение, фенотипическое проявление и поддержание [ISP+]. Возможно несколько
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант №08-4-00353), а также CRDF BP3C12, НШ-197.2008.4, ГК 02.512.12.2009 и ГК 02.512.12.2012.
© А.И.Гогинашвили, К.В.Волков, Л.Н.Миронова, 2009
подходов для идентификации таких генов. Проведенный в наших работах скрининг центромерной и инсерционной библиотек генов позволил выявить несколько генов, играющих ту или иную роль в проявлении и поддержании [ISP+] [1, 3, 5, 7].
Задача настоящей работы — идентификация генов, сверхэкспрессия которых приводит к индукции [ISP+]. Теоретически среди таких генов может быть и структурный ген [ISP+], поскольку известно, что увеличение количества молекул прионогенного белка увеличивает вероятность появления его прионной формы (см. [29]). В качестве инструмента использовали библиотеку кДНК дрожжей, гены которой находятся под контролем промотора гена GAL1 [16]. Трансформация этой библиотекой штамма, несущего мутацию sup35-25, должна выявить гены, активация экспрессии которых на среде с галактозой приводит к изменению фенотипа штамма с супрессорного, His+Lys+(Sup+) на несупрессорный, His-Lys-(Sup-), характерный для штаммов [ISP+].
Материалы и методы исследования
Штаммы и условия культивирования. В работе использовали штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae Петергофских Генетических Линий (ПГЛ), генотипы которых приведены в таблице, а также штамм Escherichia coli XL1-Blue [22].
Штаммы, использованные в работе
Штамм Генотип
5Б-П4513 МАТо, a,del-14 his7-l lys2-87 игаЗА 1еи2-1 metl3-Al sup35-25 sup45-400 [JSP+] и [isp-]
25-25-2В-П3982 MATa adel-14 his7-l lys2-87 игаЗА leu2-l thr4~B15 sup35-25 sup45-400 [JSP+] и [isp-]
Примечание. Аллели ade1-14, lys 2-87, thr4-B15 содержат нонсенс-мутацию UGA; аллель his7-1 содержит нонсенс-мутацию UAA; ura,3A — делеция гена URA3; met13-A1 —миссенс-мутация и сдвиг рамки считывания; leu2-1 —мутация, молекулярная природа которой неизвестна; sup35-25 — рецессивная омнипотентная супрессорная мутация в гене SUP35; sup45-400 —криптическая миссенс-мутация в гене SUP45.
Использовали стандартные культуральные среды, применяемые при работе с дрожжами: полную среду YAPD, среду YPGly, содержащую все компоненты полной среды за исключением глюкозы, замененной на глицерин (24 мл/л), минимальную (MD), синтетическую минимальную среду (SMM), селективные среды на основе SMM [13, 23].
Для элиминации [ISP+] использовали среду YAPD с хлоридом гуанидина (GuHCl) в концентрации 5 мМ; для индукции галактозного промотора — среду SMM без ура-цила, содержащую галактозу (2%) и раффинозу (2%), вместо глюкозы. Добавление раффинозы в среду обусловлено тем, что дрожжи ПГЛ не могут использовать галактозу в качестве источника углерода, поэтому раффиноза служит источником углерода, а галактоза — индуктором регулируемого промотора. Для отбора и выращивания трансформантов плазмидой pCORE брали среду SMM с генетицином в концентрации 100 мкг/мл.
Для выращивания бактерий использовали среду LB [22]. Селекцию устойчивых к ампициллину трансформантов проводили на среде LB с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл. Для трансформации бактерий использовали среды SOB и SOC [22].
Дрожжи выращивали при температуре 25-26°С, бактерии — при температуре 37°С.
Плазмиды. В процессе работы пользовались экспрессионной библиотекой кДНК, созданной на основе плазмиды pRS316-GAL1-cDNA [16]. Для получения делеций использовали плазмиду pCORE [24].
Методы. В работе применяли стандартные генетические и молекулярные методы, используемые при работе с дрожжами [2, 22, 23]. Для элиминации [ISP+] штаммы пассировали 5 раз на среде YAPD, содержащей хлорид гуанидина, затем клонировали их на YAPD и анализировали фенотип полученных клонов [25]. Амплификацию фрагментов ДНК производили путем ПЦР, используя Taq-полимеразу («Sybenzyme») и термоциклер «Crocodile III» (Appligene). Для замещения хромосомных генов HSP150 и APD1 в качестве матрицы использовали плазмиду pCORE. В качестве праймеров использовали олигонуклеотиды HSP150_D_F и HSP150_D_R (для гена HSP150) и APD1_D_F и APD1_D_R (для гена APD1 ). Состав праймеров:
HSP150_D_F:
5/CATATTCCTTTTCTAGTACAATAATAATAATATAGAGCTCGTTTTCGACACTGG3/
HSP150_D_R:
5' AAAAGTCATCAGGATAAAAGAACTAATAGTTTTCTGCTTATCCTTACCATTAAG TTGATC3/
APD1_D_F:
5/AGGCGGCCAAGAGAGAGATATCTTCTTTGTCCTTTGAATTGAGCTCGTTTTCG
ACACTGG3/
APD1_D_R:
5/TGATGGCAAATTTTATGGCGTCAAAAGATTGTATTTTGCTTCCTTACCATTAAG
TTGATC3/
ПЦР проводили при следующих условиях: (95°C — 30 с — денатурация; 56°C — 30 с — отжиг праймеров; 72°C — 150 с — полимеризация) х 30 циклов; 72°C — 30 мин — полимеризация.
Для замещения хромосомных генов HSP150 и APD1 кассетой kanMX4 в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК, выделенную из клеток дрожжей. В качестве праймеров использовали олигонуклеотиды HSP150_F и HSP150_R (для гена HSP150) и APD1_F и APD1_R (для гена APD1 ). Состав праймеров:
HSP150_F:
5/GAACACTTGAAGTCTAACGACAATC3/
HSP150_R:
5/CAAAGGAATGGATGCGACTA3/
APD1_F:
5/GCTATATTCGGAGGAGGCAA3/
APD1_R:
5/GATTGTATTTTGCTGGCCAA3/
ПЦР проводили при следующих условиях: (95°C — 30 с — денатурация; 50°C — 30 с — отжиг праймеров; 72°C — 120 с — полимеризация) х 25 циклов; 72°C — 45 мин — полимеризация.
Подбор праймеров осуществляли с помощью пакета программ VNTI. Секвенирование ДНК осуществляли в ООО НПФ «Хеликс» и ООО НПФ «Амбер» с использованием праймера M13 (-20): 5/GTAAAACGACGGCCAGT 3/.
Для анализа сдвига распределения в парных наблюдениях применяли непараметрический критерий знаковых рангов Уилкоксона [6].
При большом объеме выборки (п >30) значение статистики Т* вычисляли по формуле Т* = (Т+ — [п(п+ 1)/4])/\/[п(п + 1)(2п + 1)/24] [6].
Трансформация штамма [isp-] экспрессионной библиотекой кДНК. Для
трансформации экспрессионной библиотекой использовали [isp-]-вариант штамма 25-25-2В-ПЗ982, содержащего детерминант [ISP+], полученный путем пассирования этого штамма на среде с GuHCl (см. «Материалы и методы исследования»). Критерием элиминации [ISP+] служило изменение фенотипа штамма с Sup- на Sup+. Для дополнительной проверки [ISP+]-статуса клоны c супрессорным фенотипом скрещивали с [ISP+] и [isp-] производными штамма 5Б-П451З, использованными в качестве тестеров. Поскольку фенотип [ISP+] доминантен [26], диплоиды от скрещивания [isp-] клонов с тестером [ISP+] должны проявлять фенотип Sup-, а от скрещивания с тестером [isp-] — Sup+ .
Один из клонов, удовлетворяющих перечисленным критериям, трансформировали банком генов и высевали суспензию клеток на селективную среду SMM-Ura. Всего было получено ^15 ООО трансформантов.
Для активации экспрессии генов, находящихся под контролем промотора GAL!, чашки с трансформантами печатали на среду SMM с галактозой и раффинозой, не содержащую урацила, и выращивали в течение 5 дней. Поскольку детерминант [ISP+] после элиминации способен к спонтанному появлению с высокой частотой [26], нужно было отличить индукцию [ISP+], связанную с активацией генов библиотеки кДНК, от спонтанного появления [ISP+]. Для этого чашки с трансформантами, помимо среды SMM с галактозой и раффинозой без урацила, печатали на SMM-His и SMM-Lys. Такая проверка фенотипа позволила выявить и исключить из дальнейшего анализа трансформанты, у которых произошло спонтанное возникновение [ISP+].
Чтобы обнаружить трансформанты, изменившие свой статус с [isp-] на [ISP+] в результате экспрессии генов библиотеки, чашки с трансформантами, выросшими на среде SMM с галактозой и раффинозой, перепечатывали на селективные среды, содержащие глюкозу. Наличие глюкозы приводит к инактивации галактозного промотора за счет явления глюкозной репрессии.
В результате было обнаружено 1З трансформантов, изменивших фенотип с Sup+ на Sup-после временной индукции галактозного промотора и воспроизводящих этот фенотип после повторной процедуры индукции у исходных трансформантов.
Анализ плазмид, выделенных из трансформантов. Для дальнейшего анализа из трансформантов, отобранных на предыдущем этапе и обозначенных для удобства порядковыми номерами с 1-го по 1З-й, выделили тотальную ДНК и трансформировали этой ДНК клетки штамма E. coli XL1-Blue. Отбор бактериальных трансформантов проводили на среде LB с ампициллином, отбирали по одному клону из каждой трансформации. После выращивания трансформантов в жидкой среде LB с ампициллином из них выделяли плазмидную ДНК, при этом плазмидам присваивались номера, соответствующие номерам исходных дрожжевых трансформантов.
Поскольку один и тот же ген может быть представлен в банке несколькими копиями, среди выделенных плазмид могли находиться идентичные плазмиды. Это предположение было проверено при помощи рестрикционного анализа с помощью плазмид HindIII, BamHI, Salí (данные не представлены).
Итоги рестрикционного анализа свидетельствуют о том, что во вставках кДНК, находящихся в выделенных плазмидах, содержатся разные гены, за исключением плазмид 1О, 14 и 15, которые с высокой долей вероятности являются идентичными. Для дальнейшего анализа была использована одна из них — 1О-я.
В ходе последующей проверки мы обнаружили, что стабильное воспроизведение несупрессорного фенотипа проявляют лишь четыре плазмиды из одиннадцати, идентифицированных на предыдущем этапе, а именно: 2, 4, 5 и 11. Характеристике этих плазмид посвящена следующая часть исследования.
Количественный анализ эффекта, вызванного экспрессией генов, находящихся в плазмидах 2, 4, 5 и 11. На следующем этапе была проведена количественная оценка эффективности индукции [ISP+] плазмидами 2, 4, 5 и 11. Необходимость такой оценки связана с несколькими причинами. Во-первых, Sup-фенотип клонов [ISP+] обусловливает негативную селекцию таких клонов (в качестве клонов [ISP+] учитываются клоны, не растущие на селективных средах, что осложняет их выявление среди клонов [isp-], имеющих фенотип Sup+ ). С другой стороны, показано, что [ISP+] способен к спонтанному возникновению в штаммах [isp-] с высокой частотой, причем штаммы, содержащие [ISP+], растут на некоторых средах быстрее, чем штаммы [isp-] [26]. Вследствие этого фенотипически супрессорные, учитываемые как [isp-], клоны трансформантов могут содержать клетки
[ISP+].
Известно также, что возникновение прионной формы белка при сверхэкспрессии гена, кодирующего прионогенный белок, является вероятностным событием. Это означает, что встречаемость клонов с прионным фенотипом при сверхэкспрессии такого гена может сильно варьировать даже между генетически идентичными клонами. Для более точного доказательства эффекта индукции [ISP+] выделенными плазмидами, получали значительное количество трансформантов каждой плазмидой и анализировали частоту встречаемости [ISP+] в митотическом потомстве независимых трансформантов. Данные, полученные для независимых трансформантов, подвергали статистической обработке.
С этой целью [isp-] вариант штамма 25-25-2В-П3982 трансформировали плазмидами 2, 4, 5 и 11 и используемой в качестве негативного контроля плазмидой pRS316-GAL1, не содержащей вставки. Отбор трансформантов, как и ранее, проводили на среде SMM-Ura. Отбирали по 40 трансформантов для плазмид 2, 4, 5 и 11, для контрольной плазмиды было отобрано 10 трансформантов. После клонирования трансформантов на YAPD отбирали по восемь клонов каждого трансформанта и проверяли их способность к росту на SMM-Ura-His и SMM-Ura-Lys.
В последующем анализе использовали по одному клону из восьми, растущему на средах без урацила, гистидина и лизина. Для плазмиды 2 было получено в общей сложности 32 клона, соответствующих независимым трансформантам, для плазмиды 4 — 23 клона, для плазмиды 5 — 15 клонов, для плазмиды 11 — 31 клон, для контрольной плазмиды — 6 клонов.
Для активации экспрессии генов библиотеки, содержащихся в плазмидах, клоны переносили штрихом со среды SMM-Ura с глюкозой на среду SMM-Ura с галактозой и раффинозой. Кроме того, для оценки частоты встречаемости спонтанно возникающих клонов [ISP+] трансформанты переносили на среду SMM-Ura с раффинозой. Поскольку эта среда не содержит галактозы, ее можно использовать для оценки частоты встречаемости клонов [ISP+], не обусловленной активацией экспрессии генов, содержащихся во вставке кДНК. Клоны выращивали на этих средах в течение 6 дней, а затем высевали из водной суспензии на среду YAPD из расчета 200 клеток на чашку. Через два дня выросшие клоны печатали на среду SMM без лизина и подсчитывали количество колоний, характеризующихся супрессорным и несупрессорным фенотипами. Таким образом можно было сравнить частоту встречаемости клонов, характеризующихся фенотипом
Sup- в парных наблюдениях — после выращивания в условиях индукции галактозного промотора и в отсутствие индукции.
Доли колоний, характеризующихся несупрессорным фенотипом, сравнивали с помощью непараметрического критерия знаковых рангов Уилкоксона. Поскольку сравниваемые выборки являются зависимыми, так как происходят из совокупности митотических потомков одной клетки, использовали одновыборочный критерий.
Проведенное сравнение показало, что в случае плазмид 2, 5 и 11 доля несупрессорных колоний в потомстве клеток, выращенных на среде с галактозой и раффинозой, достоверно выше, чем на среде с раффинозой. Так, для плазмиды 2 значение статистики T* = 4, 30, для плазмиды 5 T* = 3,15, а для плазмиды 11 T* = 4, 65. Эти значения больше Znop.(a=ojoi) = 2, 33. Для плазмиды 4 достоверных различий между долями несупрессорных колоний в двух выборках выявлено не было. В этом случае T + = 60,
T+ < T(15)(a=o,053) = 89.
Для контрольной плазмиды, не содержащей вставки, также не было выявлено достоверных отличий доли несупрессорных колоний на среде с галактозой и раффинозой и на среде с раффинозой (значение статистики T + = 7 < T(a=o,o3;n=5) = 15). Различия применяемых статистик T* и T + связаны с применением формулы приближения для большой выборки (п > 20) при анализе потомства клонов, трансформированных плазмидами 2, 5 и 11.
Таким образом, можно утверждать, что экспрессия вставок кДНК, содержащихся в плазмидах 2, 5 и 11, приводит к индукции [ISP+]. Хотя для плазмиды 4 не было получено статистического подтверждения индукции [ISP+], она также была подвергнута дальнейшему анализу.
Идентификация генов, содержащихся в плазмидах 2, 4, 5 и 11. Секвени-рование вставок кДНК, содержащихся в исследуемых плазмидах, показало, что плазмида 2 несет ген APD1, плазмида 4 — ген ACT1, плазмида 5 — ген RPS24A, плазмида 11—ген HSP150.
Функция белка Apd1 в настоящее время неизвестна, однако показано, что делеция гена APD1 приводит к нарушению распределения некоторых элементов цитоскелета — так называемых «актиновых бляшек» [10]. Белок Act1 (актин) — это один из центральных белков цитоскелета, вовлеченный во множество происходящих в клетке процессов, и в том числе в обеспечение точности трансляции [14]. Rps24a — структурный белок малой субчастицы рибосомы [15, 19]. Продуктом HSP150 является поверхностный гликопротеин клеточной стенки, синтез которого возрастает в условиях теплового шока или голодания [21].
Получение делеций генов HSP150 и APD1. Если какой-то из этих генов является структурным геном [ISP+], его инактивация должна приводить к элиминации [ISP+]. Для проверки этой возможности нужно исследовать эффекты делеций найденных генов. Однако в случае гена RPS24A проверить эту возможность нельзя, поскольку его функция дублируется идентичным на 97% геном RPS24B, а совместная делеция обоих генов летальна (http://www.yeastgenome.org). К числу жизненно важных генов относится и ACT1, что также не позволяет получить делецию этого гена.
Для получения делеций генов HSP150 и APD1 проводили замещение этих генов конструкциями, полученными с помощью ПЦР на матрице плазмиды pCORE с праймерами HSP150_D_F и HSP150_D_R и APD1 _D_F и APD1 _D_R соответственно. Эти праймеры сконструированы таким образом, что 20 н. (нуклеотиды, здесь и далее — н.) с 3'-конца комплементарны соответствующим участкам в pCORE, а 40 н. с 57-конца комплементарны флангам генов HSP150 или APD1. В результате ПЦР образуется кон-
струкция, содержащая кассету плазмиды pCORE, фланкированную последовательностями, комплементарными флангам генов, которые нужно делетировать.
С применением праймеров к гену HSP150 было получено 10 независимых ПЦР проб, к гену APD1 — 9 проб. Корректное прохождение ПЦР контролировали с помощью гель-электрофореза. Полученными ПЦР-продуктами трансформировали [ISP+]-вариант штамма 25-25-2В-П3982, отбор трансформантов проводили на SMM-Ura. Трансформанты отсевали на среду YAPD, а затем перепечатывали на SMM-Ura и YAPD с генетицином для проверки наличия вставки. В качестве контроля на чашки с трансформантами высевали [ISP+]-вариант штамма 25-25-2В-П3982.
Для гена HSP150 было получено 19 трансформантов, 11 из них росли на среде SMM-Ura и на YAPD с генетицином, что свидетельствовало о встраивании кассеты в геном. Однако встраивание может происходить и в случайный участок генома, поэтому необходимо дополнительно проверить, что произошло замещение гена HSP150. Для этого из трансформантов выделяли ДНК и проводили ПЦР с праймерами HSP150_F и HSP150_R. Эти праймеры комплементарны последовательностям, расположенным на расстоянии нескольких десятков нуклеотидов от рамки считывания гена HSP150. Таким образом, продукт ПЦР должен содержать либо кассету с флангами гена HSP150 в случае деле-ции, либо ген HSP150 с флангами, если встраивание кассеты произошло в другой участок генома. В первом случае размер ПЦР-продукта должен составлять 3440, а во втором —1478 н.
Из 11 трансформантов только у одного было выявлено замещение гена HSP150 на кассету с маркерными генами (рисунок).
Аналогичный анализ был проведен для 12 трансформантов, полученных с использованием праймеров к флангам гена APD1. Шесть из них росли на среде SMM-Ura и на YAPD с генетицином. Для проверки встраивания кассет у этих трансформантов проводили ПЦР с использованием праймеров APD1_F и APD1_R. Если встраивание кассеты произошло в ген APD1, продукт ПЦР должен иметь длину 3271 н.; если кассета встроилась в другой участок генома, размер продукта ПЦР должен составлять 1036 н. Проведенный таким образом анализ выявил одного трансформанта, у которого произошло замещение гена APD1 делеционной кассетой (см. рисунок).
Трансформантов, содержащих делеции генов HSP150 и APD1, клонировали на среде YAPD, отбирали по 40 клонов на YAPD и печатали их на SMM-Ura, YAPD с генетицином, SMM-His и SMM-Lys. Ни у одного из клонов не было выявлено изменение фенотипа с Sup- на Sup+, свидетельствующее об элиминации [ISP+]. Таким образом, можно утверждать, что делеция генов HSP150 и APD1 не приводит к потере детерминанта [ISP+].
10 000 6000 6000 5000 4000 3000 2500 2000
Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных при амплификации ДНК, выделенной из трансформантов, с праймерами к флангам гена НБР150 и АРБ1
Дорожки: 1 —маркерная ДНК, 2 —нормальная аллель НБР150 с флангами; 3 —деле-ционная кассета с флангами НБР150; 4 —нормальная аллель ЛРР1 с флангами; 5 —деле-ционная кассета с флангами ЛРР1.
В нашей лаборатории проводится масштабный поиск генов, контролирующих индукцию, проявление и поддержание прионоподобного детерминанта [ISP+]. Подходы, применяемые для поиска таких генов, основаны на скрининге различных библиотек генов: центромерной, инсерционной, экспрессионной. К настоящему моменту такой скрининг осуществлен в отношении двух библиотек, центромерной и инсерционной. Выявлены как гены, влияющие на проявление [ISP+] (SUP45, HAL3, PPZ1 ), так и гены, от которых зависит его поддержание (UPF1, UPF2, SFP1) [1, 3, 5, 7].
Подход, использованный в настоящей работе, основан на том, что, согласно одному из критериев прионного наследования у дрожжей, сформулированных Р. Викнером [27], сверхэкспрессия прионогенного белка должна приводить к индукции соответствующего приона. Следует отметить, что помимо структурного гена приона таким образом можно выявить гены, контролирующие возникновение данного приона. Такой подход имеет ряд преимуществ перед подходом, основанным на использовании инсерционной библиотеки, возможности которого ограничены тем, что жизненно важные гены оказываются за рамками исследования, так как их инактивация летальна. Кроме того, использованная в работе методика позволяет регистрировать изменение фенотипа трансформантов после инактивации промотора. Благодаря этому исключается учет клонов, изменение фенотипа которых связано с собственным эффектом сверхэкспрессии гена, а не с индукцией [ISP+]. Это дает возможность отличить случаи индукции [ISP+] от случаев маскировки [isp-]-статуса за счет фенотипического эффекта сверхпродукции соответствующего белка.
В результате скрининга экспрессионного банка кДНК нами было показано, что сверхэкспрессия генов HSP150, APD1 и RPS24A приводит к индукции [ISP+]. Влияние гена ACT1 на индукцию [ISP+] показано только в качественном тесте; при количественной оценке эффекта сверхэкспрессии этого гена статистически достоверных отличий с контролем выявлено не было. Вероятные причины этого обсуждаются ниже.
Какова возможная роль найденных генов в индукции [ISP+]? Для двух из них, HSP150 и APD1, строго доказано, что они не являются структурными генами [ISP+], поскольку делеции этих генов не приводят к элиминации [ISP+]. Как отмечено выше, аналогичный анализ невозможен в отношении генов RPS24A и ACT1, однако ряд фактов указывает на то, что их роль в индукции [ISP+] также косвенна. Основным из этих фактов является результат, полученный в ходе проведенного параллельно скрининга инсерционного банка генов, свидетельствующий о том, что структурным геном [ISP+] является, скорее всего, ген SFP1. Этот вывод базируется на том, что делеция этого гена приводит к необратимой элиминации [ISP+] [5]. В связи с этим вопрос о роли идентифицированных в настоящей работе генов в индукции [ISP+] может быть сформулирован следующим образом: как продукты этих генов связаны с белком Sfp1 или с его переходом в прионную конформацию?
Белок Sfp1 представляет собой транскрипционный фактор, контролирующий экспрессию нескольких сотен генов, продукты которых участвуют во множестве процессов, таких как биогенез рибосом, прохождение стадий клеточного цикла, контроль размера клеток, выживание клеток в различных стрессовых условиях и т.д. [8, 9, 11, 12]. Функции Sfp1 связаны с его миграцией между ядром и цитоплазмой, причем эта миграция контролируется участниками TOR- и PKA- сигнальных путей [17]. Так, например, выход Sfp1 в цитоплазму при стрессе приводит к инактивации биогенеза рибосом [17]. Белок Sfp1 обогащен аспарагином и глутамином и входит в число потенциально прио-
ногенных белков [18]. Сейчас мы изучаем возможность прионного превращения этого белка в клетках [ISP+].
В настоящее время в литературе отсутствуют данные о физическом взаимодействии молекул Sfpl и белков Hsp150, Apdl и Rps24A. Вместе с тем продукты двух из трех идентифицированных генов — Apdl и Hsp150 — имеют отношение к переживанию клеткой стрессовых условий (Apdl обеспечивает устойчивость к ионам натрия и перекиси водорода, Hsp150 — отвечает за широкий спектр приспособительных изменений, связанных с поддержанием стабильности клеточной стенки). Идентификация возможной связи SFP1 и HSP150, APD1 и RPS24A требует дополнительных исследований.
Отдельного внимания заслуживает вопрос: почему ген SFP1 не был выявлен в данной работе при скрининге экспрессионной библиотеки кДНК? Следует отметить, что негативным свойством применяемого метода является сложность идентификации генов, кодирующих белки, представленные небольшим числом копий. Поскольку экспрес-сионная библиотека сконструирована при помощи обратной транскрипции мРНК, гены, характеризующиеся низким уровнем экспрессии, представлены в библиотеке небольшим числом копий. К числу таких генов относится и ген SFP1: в клетке присутствует около 200 молекул Sfpl.
Проведение адекватного анализа затруднительно и для генов, сверхэкспрессия которых понижает жизнеспособность клетки. Возможно, именно это обстоятельство помешало обнаружить эффект индукции [ISP+] при сверхэкспрессии гена ACT1 [16]. Пониженная жизнеспособность таких трансформантов может скрыть эффект индукции
[ISP+].
Вместе с тем результаты применения данного подхода демонстрируют его эффективность при выявлении жизненно важных генов: идентификация RPS24A и ACT1 невозможна при скрининге инсерционной библиотеки. Таким образом, представляется перспективным совместное использование обоих подходов для идентификации генов, контролирующих возникновение и поддержание дрожжевых прионов.
Литература
1. Аксенова А. Ю., Волков К. В., Ровинский Н. С., Свитин А. В., Миронова Л. Н. Фенотипическое проявление эпигенетического детерминанта [ISP+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae зависит от комбинации мутаций в генах SUP35 и SUP45 // Молек. биол. 2006. Т. 40, №5. C. 844-849.
2. Захаров И. А., Кожин С.А., Кожина Т. Н., Федорова И. В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л., 1984. 143 с.
3. Иванов М. С., Аксенова А. Ю., Бурдаева Я. В., Радченко Э. А., Миронова Л. Н. Сверхэкспрессия гена PPZ1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae влияет на эффективность нонсенс-супрессии // Генетика. 2008. Т. 44, №2. C. 177-184.
4. Инге-Вечтомов С. Г. Прионы дрожжей и центральная догма молекулярной биологии // Вестник РАН. 2000. Т. 70, №4. C. 299-306.
5. Рогоза Т. М., Викторовская О. В., Родионова С. А., Иванов М. С., Волков К. В., Миронова Л. Н. Поиск генов, влияющих на поддержание антисупрессорного прионоподобного детерминанта [ISP+] у дрожжей, с помощью инсерционной библиотеки генов // Молек. биол. 2009. (в печати).
6. Холлендер М., Вулф Д. Непараметрические методы статистики. М., 1983. 518 с.
7. Aksenova A., Muñoz I., Volkov K., Ariño J., Mironova L. The HAL3-PPZ1 dependent regulation of nonsense suppression efficiency in yeast and its influence on manifestation of the yeast prion-like determinant [ISP+] // Genes Cells. 2007. Vol. 12(4). P. 435-445.
8. Cipollina C., van den Brink J., Daran-Lapujade P., Pronk J. T., Porro D., de Winde J. H. Saccharomyces cerevisiae SFP1: at the crossroads of central metabolism and ribosome biogenesis // Microbiology. 2008a. Vol. 154 (Pt. 6). P. 1686-1699.
9. Cipollina C., van den Brink J., Daran-Lapujade P., Pronk J. T., Porro D., de Winde J. H. Revisiting the role of yeast Sfpl in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study // Microbiology. 2008b. Vol. 154 (Pt 1). P. 337-346.
10. Entian K. D., Schuster T., Hegemann J. H., Becher D., Feldmann H., Güldener U., Gütz R., Hansen M., Hollenberg C. P., Jansen G., Kramer W., Klein S., Kötter P., Kricke J., Laun-hardt H., Mannhaupt G., Maierl A., Meyer P., Mewes W., Munder T., Niedenthal R. K., Ramezani Rad. M., Rühmer A., Römer A., Hinnen A., et al. Functional analysis of 150 deletion mutants in Saccharomyces cerevisiae by a systematic approach // Mol. Gen. Genet. 1999. Vol. 262 (4-5). P. 683-702.
11. Fingerman I., Nagaraj V., Norris D., Vershon A. K. Sfp1 plays a key role in yeast ribosome biogenesis // Eukaryot. Cell. 2003. Vol. 2 (5). P. 1061-1068.
12. Jorgensen P., Rupes I., Sharom J. R., Schneper L., Broach J. R., Tyers M. A dynamic transcriptional network communicates growth potential to ribosome synthesis and critical cell size // Genes Dev. 2004. Vol. 18 (20). P. 2491-2505.
13. Kaiser C., Micha,elis S., Mitchell A. Methods in yeast genetics. New York, 1994. 234p.
14. Kandl K.A., Munshi R., Ortiz P.A., Andersen G.R., Kinzy T. G., Adams A. E. Identification of a role for actin in translational fidelity in yeast // Mol. Genet. Genomics. 2002. Vol. 268 (1). P. 10-18.
15. Lecompte O., Ripp R., Thierry J. C., Moras D., Poch O. Comparative analysis of ribosomal proteins in complete genomes: an example of reductive evolution at the domain scale // Nucleic Acids Res. 2002. Vol. 30 (24). P. 5382-5390.
16. Liu H., Krizek J., Bretscher A. Construction of a GAL1 regulated yeast cDNA library and its application to the identification of genes whose overexpression causes lethality in yeast // Genetics.
1992. Vol. 132. P. 665-673.
17. Marion R. M., Regev A., Segal E., Barash Y., Koller D., Friedman N., O’Shea E. K. Sfp1 is a stress- and nutrient-sensitive regulator of ribosomal protein gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101 (40). P. 14315-14322.
18. Michelitsch M.D., Weissman J. S. A census of glutamine/asparagine-rich regions: implications for their conserved function and the prediction of novel prions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 11910-11915.
19. Planta R. J., Mager W.H. The list of cytoplasmic ribosomal proteins of Saccharomyces cerevisiae // Yeast. 1998. Vol. 14 (5). P. 471-477.
20. Prusiner S. B. Molecular biology and genetics of prion diseases // Biol. Sci. 1994. Vol. 343. P. 447-463.
21. Russo P., Simonen M., Uimari A., Teesalu T., Makarow M. Dual regulation by heat and nutrient stress of the yeast HSP150 gene encoding a secretory glycoprotein // Mol. Gen. Genet.
1993. Vol. 239 (1-2). P. 273-280.
22. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York, 1989. 723 p.
23. Sherman F., Fink G. R, Hincks J. B. Methods in yeast genetics. New York, 1986. 367 p.
24. Storici F., Lewis L.K., Resnick M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides // Nat. Biotechnol. 2001. Vol. 19. P. 773-776.
25. Tuite M. F., Mundy C. R., Cox B. S. Agents that cause a high fequency of genetic change from [psi+] to [psi“] in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1981. Vol. 98. P. 691-711.
26. Volkov K. V., Aksenova A. Y., Soom M. J., Osipov K. V., Svitin A. V., Kurishko C., Shkun-dina I. S., Ter-Avanesyan M. D., Inge-Vechtomov S. G., Mironova L. N. Novel non-mendelian determinant involved in the control of translation accuracy in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 2002. Vol. 160. P. 25-36.
27. Wickner R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae // Science. 1994. Vol. 264. P. 566-569.
28. Wickner R. B, Edskes H. K., Shewmaker F., Nakayashiki T. Prions of fungi: inherited structures and biological roles // Nat. Rev. Microbiol. 2007. Vol. 5 (8). P. 611-618.
29. Wickner R. B., Taylor K. L., Edskes H. K., Ma.dd.elein M. L., Moriyama H., Tibor Roberts
B. Prions of yeast as heritable amyloidoses // J. Str. Biol. 2000. Vol. 130. P. 310-322.
Статья поступила в редакцию 31 июля 2009 г.
