CC BY
12УДК 616.992: 576.882.8
НЕЙТРОФИА-СТИМУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ДРОЖЖЕВОЙ И ГИФАЛЬНОЙ ФОРМ CANDIDA ALBICANS (ROBIN) BERKHOUT
Заславская М.И., Маянский А.Н.
Нижегородская государственная медицинская академия, Россия
© Заславская М.И., Маянский А.Н., 2006
Изучали нейтрофил-стимулирующую активность дрожжевой и гифальной форм Candida albicans. Установлено, что гифы быстрее индуцируют кислород-зависимые реакции в нейтрофи-лах. В то же время дрожжевая форма С. albicans в большей мере, чем мицелиальная, способна использовать термолабильные рецепторы для контакта с фагоцитами и усиливать «респираторный взрыв» в нейтрофилах через активацию их цитоскелета. Нитчатая и дрожжевая формы С. albicans обладают сходной on-сонической емкостью. Культура в мицелиальной форме вызывает более сильную, по сравнению с дрожжевой, нейтрофил-зависимую продукцию ИЛ-8, ИА-6 и растворимых молекул HLA-I.
Ключевые слова: гифы, дрожжевая форма, ИЛ-6, ИЛ-8, Candida albicans, нейтрофилы, sHLA-I
NEUTROPHIL-STIMULATED ACTIVITY OF YEAST AND HYPHAL FORM OF CANDIDA ALBICANS (ROBIN) BERKHOUT
Zaslavskaia M.I., Maianskii A.N.
Nizhny Novgorod State Medical Academy, Russia
© Zaslavskaia M.I., Maianskii A.N., 2006
We have investigated the neutrophil-dependent activity of yeast and mycelial forms of Candida albicans. It has been detected that hyphae faster start the oxygen-dependent reactions in neutrophils. At the same time, in contrast of hyphae, the yeast form can involve the thermolabile receptors in a contact with phagocytes and amplify the “respiratory burst” in neutrophils due to their cytoskeleton activation. Yeast and hyphal forms have the same ability to absorb the opsonic molecules. Hyphae stimulate more intensively the neutrophil-dependent production of IL-8, IL-6, and soluble HLA-I.
Key words: Candida albicans, hyphae, IL-6, IL-8, neutrophils, sHLA-I, yeast form
ВВЕДЕНИЕ
C.albicans относят к условно-патогенным микроорганизмам, колонизирующим слизистые оболочки и кожу здоровых людей [1]. Известен мице-лиально-дрожжевой диморфизм у С. albicans. При этом нитчатые формы считают более агрессивными и патогенными, а также способными, в отличие от дрожжевой формы, к активной пенетрации через слизистые оболочки макроорганизма на этапе инвазии [2,3]. Одними из эффекторов, обеспечивающих первую линию защиты против кандидозной инвазии, служат нейтрофилы, действующие в системе опсо-нической кооперации с антителами и комплементом [4,5]. В настоящей работе нами была сделана попытка проанализировать особенности взаимодействия нейтрофилов с различными морфологическими вариантами С. albicans и оценить провоспалительный потенциал дрожжевой и мицелиальной форм.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали С. albicans штаммы 258, 290, 601, 852 (из коллекции кафедры микробиологии и иммунологии Нижегородской государственной медицинской академии), обладающие выраженной способностью продуцировать псевдомицелий in vitro. Культуру С. albicans получали в дрожжевой фазе на агаре Сабуро (37 °С, 24 ч). Посевы смывали забуфе-ренным физиологическим раствором (ЗФР, pH 7,27,4), трижды отмывали десятикратным объемом ЗФР (3500 г, 15 мин) и ресуспендировали в концентрации 1-107 кл/мл. С. albicans в мицелиальной фазе получали при культивировании на жидкой среде ДМЭМ (37 °С, 72-96 ч). Выросшую культуру четырежды отмывали десятикратным объемом ЗФР (3500 г, 15 мин) и ресуспендировали в ЗФР в концентрации, эквивалентной концентрации дрожжевых клеток (по сухому весу). В ряде экспериментов использовали убитые клетки С. albicans, инактивированные на водяной бане (70 °С, 40 мин), с последующим отмыванием центрифугированием (3500 г, 15 мин) и ресуспендированием в исходном объеме среды.
Для опсонизации живые клетки С. albicans обрабатывали смесью сывороток от здоровых доноров (37 °С, 30 мин); для опсонизации в системе альтернативного пути активации комплемента суспензии С. albicans в равных объемах инкубировали (37 °С, 30 мин) с сывороткой, содержащей 10 шМ ЭДТА и MgCl2 [6]. Нековалентно связанные компоненты сыворотки удаляли 0,1% раствором додецилсульфата натрия. При IgG-опсонизации смешивали суспензию клеток С. albicans в равных объемах с раствором иммуноглобулина («ИМБИО», Н. Новгород) и инкубировали (1 ч, 4 °С). После опсонизации С. albicans дважды отмывали десятикратным объемом ЗФР (3500 г, 15 мин).
В серии экспериментов С. albicans подвергали обработке (1 ч, 37 °С, 1 мг/мл) трипсином («Spopha», Чехия) или проназой («Fluka», Швейцария), затем
клетки отмывали от ферментов (3500 г, 15 мин.) и взвешивали в исходном объеме ЗФР.
Для оценки реактивности нейтрофилов в системах с С. albicans использовали метод люминол-за-висимой хемилюминесценции (ХА) [7]. Нейтрофи-лы выделяли из крови, используя двойной градиент плотности фиколл-верографина [8], дважды отмывали ЗФР (1000 г, 5 мин) и взвешивали в растворе Хенкса без фенолового красного. В ряде экспериментов нейтрофилы инкубировали с цитохалазином В или колхицином («Sigma», США) (15 мин, 37 °С, 5 мкг/мл).
Для изучения индуцированной люминол-зависи-мой хемилюминесценции (ХА) нейтрофилов к 1 мл суспензии клеток (5-К)7мл), содержащей 5-10'sM люминола («Chemapol», Чехия), добавляли 0,1 мл соответствующего стимулятора. Стимулятором служила взвесь С. albicans (2-107 кл/мл), нативных или обработанных в различных режимах. В контроле (спонтанная ХА) вместо стимулятора использовали раствор Хенкса. Измерение люминол-зависимой ХА проводили на жидкостно-стинцилляционном счетчике «Бета-1». Каждый опыт ставили в трех повторах, учитывая средний результат (имп/мин) на пике хемилюминесценции. Все манипуляции с нейтрофи-лами проводили в силиконированной посуде.
Для определения уровня продуцируемых ИЛ-8, ИЛ-6 и растворимых молекул HLA-I нейтрофилы (4-106 кл/мл) культивировали в среде ДМЭМ (18-24 ч, 37 °С) с глутамином, гентамицином и амфотерицином В (2,5 мг/л) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки [9,10,11]. В качестве стимулятора нейтрофилов использовали клетки С. albicans (107 кл мл) в объемном соотношении 20:1. После инкубации отбирали надосадочную жидкость. Определяли количество ИЛ-8 и ИЛ-6 в культуральной жидкости с использованием наборов для иммуноферментного анализа (НПО «Цитокин», Санкт-Петербург), согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Результаты реакции учитывали на ридере (MULTISKAN ЕХ, Финляндия) при длине волны 450 нм. Определение уровня растворимых молекул HLA-I (sHLA I) в культуральной жидкости проводили с помощью иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител (МкАт) серии ИКО (ННИЭМ, Нижний Новгород). Для определения sHLA I класса использовали МкАт ИКО-53 против a-цепи HLA-I и ИКО-216 — против (3-микроглобулина [12]. Концентрацию растворимых молекул оценивали, переводя единицы оптической плотности в условные единицы (усл.ед. /мл).
Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы STADIA 4.10.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В экспериментах показано, что С. albicans в дрожжевой форме вызывала более сильную стимуляцию продукции активных форм кислорода нейтрофилами
по сравнению с мицелиальными элементами. Данная тенденция была более или менее выражена у различных штаммов: от незначительного до существенного увеличения показателей ХЛ нейтрофилов в реакциях с гифами (табл. 1).
Таблица 1.
Показатели индуцированной люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов в системах с дрожжевой (ДФ) и мицелиальной формами (МФ)
С. albicans
штаммы С albicans ХЯ в системах с ДФ (ХЯ-ДФ) (103 мп/мин) ХЯ в системах с ГФ (ХЯ-МФ) (103 имп/мин) ХЯ-МФ/ХЯ-ДФ (количество раз)
258 179,5±12,8 153,2± 8,9 1,17±0,03
290 247,8±96,8 116,4±42,6 * 1,91 ±0,13
601 156,8±18,4 124,9±11,8 1,76±0,23
852 126,1±Ю,3 97,6± 4,6 1,69±0,17
* — достоверные отличия применительно к дрожжевой форме (р <0,05).
Кроме того, было установлено, что нитчатые элементы во всех сериях экспериментов быстрее индуцировали «респираторный взрыв» нейтрофилов — пик ХА фагоцитами в экспериментах с гифами фиксировали на 10-20 мин раньше, чем с дрожжевыми формами (результаты в таблице не показаны).
Данные различия в интенсивности и динамике развития кислород-зависимого ответа нейтрофилов в системах с различными морфологическими вариантами С. albicans можно было связать с несколькими причинами. Во-первых, с реакциями цитоскелета нейтрофилов, задействованного в процесс поглощения ими дрожжевых клеток. Поскольку нитчатая и дрожжевая формы имеют существенные различия в размерах, можно было предположить, что трудности с фагоцитозом более крупных гиф могут отражаться на способности нейтрофилов образовывать активные формы кислорода. В то же время более интенсивное поглощение дрожжей нейтрофилами могло усиливать реакции «респираторного взрыва». Для проверки этого предположения мы экспериментально исследовали возможность вовлечения цитоскелета фагоцитов в реакции нейтрофилов с клетками С. albicans. Для этого нейтрофилы перед контактом с клетками тест-культуры инкубировали с колхицином (блокатор активности микротрубочек) [13] или цитохолазином В (ингибитор активности микрофи-ламентов) [14]. Во всех последующих сериях экспериментов в качестве модельного был выбран штамм С. albicans 601, который отличался стабильностью показателей и обладал высокой гифообразующей способностью.
Обработка колхицином нейтрофилов приводила к достоверному снижению нейтрофил-стимулирую-щей активности С. albicans относительно контроля, при этом снижение реакции нейтрофилов на дрожжевую форму штамма 601 было выше, чем в экспериментах с гифами: в 1,71±0,03 раз и в 1,45±0,04 раз соответственно (р<0,05). В экспериментах с цито-
холазином В достоверного снижения реактивности нейтрофилов не наблюдали. Таким образом, было показано, что активация элементов цитоскелета, после контакта с дрожжевыми и псевдомицелиаль-ными элементами С. albicans (в частности, участие микротрубочек), может вовлекаться в индукцию «респираторного взрыва». Кроме того, при более значительном снижении нейтрофил-стимулирующей активности дрожжевых элементов на фоне блокады активности микротрубочек подтверждается способность нейтрофилов более интенсивно поглощать дрожжевые клетки, чем нитчатые.
Другой причиной, объясняющей особенности нитчатой и дрожжевой форм индуцировать ХЛ нейтрофилов, может быть их различие в адгезивных реакциях клеток С. albicans с фагоцитами. Известно, что уровень ХЛ нейтрофилов коррелирует со способностью клеток вступать в адгезивные реакции [15]. Поэтому допустимо предположение о том, что гифы и дрожжевые элементы С. albicans способны использовать различные адгезивные механизмы: неспецифические (гидрофобные) и специфические (ли-ганд-рецепторные) взаимодействия при контакте с нейтрофилами [16].
Для выяснения природы рецепторов, вовлекаемых во взаимодействие между С. albicans и нейтрофилами, обе морфологические формы клеток подвергали термической обработке (70 °С, 40 мин.), приводящей к денатурации протеиновых структур. На основании полученных данных продемонстрировано, что после термической обработки дрожжевые клетки значительно слабее индуцировали ХЛ нейтрофилов, чем мицелиальные: 0,59-103±0,2-103 имп/мин и 9,6-103±3,2-103 имп/мин соответственно (р<0,05) (Рис. 1).
Рис. 1. Нейтрофил-стимулирующая активность нативных и инактивированных клеток штамма 601 С. albicans.
Дф — дрожжевая форма; МФ — мицелиальная форма; инакт — инактивированные (70 °С, 40 мин) клетки гриба; *- достоверные отличия применительно к дрожжевой форме (р <0,05).
Таким образом, С. albicans в дрожжевой фазе содержит большее количество, по сравнению с мице-лиальной фазой, термолабильных рецепторов (предположительно, белковой природы), обеспечивающих адгезивный контакт. В то же время высокая остаточ-
ная нейтрофил-стимулирующая активность нитчатых форм после термообработки могла быть связана с большей гидрофобностью их клеточной стенки [17], что подтверждается и более быстрой динамикой нарастания «респираторного взрыва» нейтрофилов, стимулируемой мицелиальными элементами. Поскольку гидрофобные контакты менее специфичны, они могут первыми участвовать в обеспечении адгезии, тогда как лигант-рецепторные взаимодействия более специфичны и зависят от функционального состояния нейтрофилов [18], поэтому для их реализации требуется определенное время.
Чтобы оценить химическую составляющую структур, участвующих во взаимодействии различных морфологических вариантов штамма 601 С. albicans с нейтрофилами, была проведена обработка дрожжевой и нитчатой форм протеолигическими ферментами — трипсином или проназой. В результате показано, что после обработки трипсином (мишень «лизин-аргинин») [19] имеет место снижение нейтрофил-стимулирующей активности дрожжевой формы в 1,32±0,05 раз. В то же время обработка трипсином не влияла на активность псевдогиф в системе с нейтрофилами (1,01±0,03). Обработка проназой (мишень «серин-треонин») не вызывала существенных изменений в способности различных морфологических вариантов С. albicans стимулировать ХЛ. Это может служить еще одним подтверждением белковой природы рецепторов, обеспечивающих более активный контакт дрожжевой формы с нейтрофилами.
В отдельных экспериментах была изучена способность разных морфологических форм С. albicans к опсонизации и вовлечению опсонин-зависимых контактов во взаимодействие между клетками тест-организма и нейтрофилами. С этой целью проводили опсонизацию обеих морфологических форм С. albicans штамм 601 цельной сывороткой, а также в режиме сорбции СЗЬ-компонента комплемента или молекул IgG.
Показано, что различия между способностью нативных дрожжевых клеток гриба индуцировать ХЛ нейтрофилов сглаживались после обработки цельной сывороткой или ее субкомпонентами (СЗЬ-, IgG-). Так, показатели ХЛ нейтрофилов после обработки дрожжевых и нитчатых форм С. albicans цельной сывороткой не отличались и составляли 18,95-103± 2,22-103 имп/мин и 19,61-103±1,78-103 имп/мин соответственно. Различий в показателях ХЛ также не наблюдали после СЗЬ-опсонизации: 12,74-103±6,9-103 имп/мин (дрожжевая форма) и 12,4-103±8,1-103 имп/мин (гифы); после IgG-опсониза-ции: З,70.103±1,21-103 имп/мин (дрожжевая форма) и 4,64-103±0,92-103 имп/мин (гифы) (р>0,05). Таким образом, мицелиальная и дрожжевая формы С. albicans обладают сходной опсонической емкостью, т.е. способностью сорбировать на себе различные опсони-ческие молекулы, в частности, СЗЬ и IgG. Можно предположить, что нивелирование различий между клетками дрожжей и псевдомицелия после опсони-
зации является дополнительным механизмом, усиливающим агрессивность нейтрофилов в отношении нитчатых элементов.
В серии экспериментов изучали интенсивность продукции нейтрофилами цитокинов (ИЛ-8 и ИЛ-6) после инкубации с различных морфологическими вариантами С. albicans. Данные цитокины продуцируются нейтрофилами на ранней стадии воспалительного ответа, являются провоспалительными медиаторами и способны выступать в качестве хемо-аттрактантов [20,21]. Отмечали достоверное увеличение продукции ИЛ-8 и ИЛ-6 (табл. 2) в системах с живыми псевдогифами по сравнению с живыми клетками в дрожжевой форме. Термическая обработка С. albicans практически не влияла на лидирующие позиции псевдогиф в отношении стимуляции синтеза ИЛ-8 (но не ИЛ-6), что могло свидетельствовать о том, что в данном случае реакция могла быть опосредована не только специфическими, но и неспецифическими взаимодействиями нейтрофилов с грибами.
Таблица 2.
Концентрация ИЯ-8, ИЯ-6 и sHLA-1 в среде после
инкубации нейтрофилов с дрожжевыми (ДФ) или мицелиальными (МФ) формами штамма 601 С. albicans
Объекты ИЛ-8 (пкг/мл) ИЛ-6 (пкг/мл) sHLA-1 (уел. ед./мл)
Среда (контроль) 208,8±23,2 66,9±12,2 43,2±4,1
живыеДФ 505±113,4 * 165,3±17,8* 111,6±34,5 *
живые МФ 934±127,8 */ ** 221,3±28,4 */ ** 219,7±47,8 */ **
инактивированные ДФ 392,9±68,8* 141,3±32,6 * 81,5±9,5 *
инактивированные МФ 643,1 ±102,1*/*** 14«,2±19,4* 191,1±20,3 */***
* — достоверные отличия в сравнении с контролем (р <0,05);
** — достоверные отличия относительно системы с живыми ДФ (р <0,05);
*** — достоверные отличия относительно системы с инактивированными ДФ (р <0,05).
Таким образом, присутствие нитчатых элементов значительнее, чем дрожжевая форма, стимулирует синтез нейтрофилами ИЛ-8 и ИЛ-6, что может, в свою очередь, способствовать аккумуляции фагоци-
тов в тканях, где присутствует псевдомицелий.
Отмечали, что культивирование нейтрофилов приводило к накоплению в среде растворимых молекул HLA-I (табл. 2). Инкубирование фагоцитов с нативными С. albicans существенно усиливало поступление sHLA в среду, при этом более высокий уровень sHLA отмечали в системах с псевдомицелием. Та же тенденция сохранялась и в экспериментах с инактивированными клетками Candida.
Известно, что растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы, в частности, молекулы HLA, играют важную роль в регуляции иммунного ответа. Полагают, что они могут выполнять функции ограничителей HLA-зависимых иммунных реакций [22], поскольку повышение уровня sHLA-I в организме человека способно вызывать дестабилизацию иммунных реакций, связанных с функционированием CD8+ клеток. На основании полученных результатов можно предположить, что выраженная способность псевдомицелия индуцировать продукцию нейтрофилами растворимых молекул HLA I класса является еще одним подтверждением большей вирулентности данной морфологической формы изученного тест-организма.
ВЫВОДЫ
1. Дрожжевая форма С. albicans в большей мере, чем нитчатая, специфически взаимодействует с нейтрофилами за счет термолабильных рецепторов.
2. Процесс поглощения клеток тест-культур привносит дополнительный вклад в продукцию активных форм кислорода нейтрофилами. При этом дрожжевая форма более выражено индуцирует перестройку элементов цитоскелета (микротрубочек) по сравнению с мицелиальной.
3. Нитчатая и дрожжевая формы С. albicans обладают сходной опсонической емкостью по способности сорбировать на себе различные молекулы оп-сонинов.
4. Мицелиальные структуры, по сравнению с дрожжевой формой С. albicans, вызывают более сильную стимуляцию синтеза нейтрофилами ИЛ-8, ИЛ-6, а также продукцию растворимых HLA-I.
ЛИТЕРАТУРА
1. Cannon R.D., Chaffin W.L. Oral colonization by Candida albicans!I Crit. Rev. Oral. Biol.-1999.- Vol.l0,№3.- P.359-383.
2. Cannon R.D., Holmes A.R., Mason A.B., Monk B.C. Oral Candida: clearance, colonization, or candidiasis? II]. Dent. Res.-1995,- Vol. 74, № 5,- P.1152-1161.
3. LiuL., KangK., TakaharaM., etal. Hyphae and Yeasts of Candida albicans Differentially Regulate Interleukin-12 Production by Human Blood Monocytes: Inhibitory Role of C. albicans Germination // Infection and Immunity.- 2001.- Vol. 69, №7.-P. 4695-4697.
4. Challacombe S.J Immunological aspects of oral candidiasis// Oral. Surg. Oral. Med. Oral. Pathol.- 1994.-Vol.78, №2.-P.202-210.
5. Jensen J, Warner Т., Balish E. The role of phagocytic cells in resistance to disseminated candidiasis in granulocytopenic mice// J. Infect. Dis.- 1994,- Vol.170, №4.-P.900-905.
6. Kozel T.R., Brown R.R., Pfrommer G.S. T. Activation and binding of C3 by Candida albicansl/ Infect. Immun. -1987.- Vol. 55,- P.1890-1894.
7. Маянский A.H., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. — Казань: «Магариф», 1993.- 191с.
8. Подосинников И.С., НиловаЛ.Г., Бабиченко И.В. и др. Метод определения хемотаксической активности лейкоцитов// Лаб. дело,- 1981,- №.8,- С.468-470.
9. Ryu J.S., Kang J.H., Jung S.Y., et al. Production of interleukin-8 by human neutrophils stimulated with Trichomonas vaginalis/Anfect. Immun. -2004.-Vol.72, №3.-P.1326-32.
10. Suttmann H., Lehan N., Bohle A., Brandau S. Stimulation of neutrophil granulocytes with Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin induces changes in phenotype and gene expression and inhibits spontaneous apoptosis// Infect. Immun.-2003,- Vol.71, №8.-P.4647-56.
11. Burns Т., Zhong Z., Steinitz М., Pirofski L.A. Modulation of polymorphonuclear cell interleukin-8 secretion by human monoclonal antibodies to type 8 pneumococcal capsular polysaccharide// Infect. Immun.- 2003.- Vol.71, №12.- P.6775-83.
12. Худякова H.E., Новиков B.B., Кравченко Г.А. и ^.Уровень растворимых антигенов классов в сыворотке крови ВИЧ-инфицированых лиц// Журн.микробиол.-2004.- №1.-С.42-45.
13. Wunder D., Dong J, BaevD. Human salivary histatin 5 fungicidal action does not induce programmed cell death pathways in C. albicans 11 Antimicrob Agents Chemother. -2004. -Vol. 48, №1. -P.110-5.
14. Newman S.L, Holly A. Candida albicans is phagocytosed, killed, and processed for antigen presentation by human dendritic cells// Infect. Immun.-2001.-Vol. 69, № 1. -P.6813-22.
15. Bellavite P., Chirumbolo S., Mansoldo C., et al. Simultaneous assay for oxidative metabolism and adhesion of human neutrophils: evidence for correlation’s and dissociation’s of the two responses//J.of Leukocyte Biology. -1994.-Vol. 51, №4.-P. 56-64.
16. Cannon R.D., Chaffin W.L. Oral colonization by Candida albicans// Crit. Rev. Oral. Biol.-1999.- Vol.10, №3.- P.359-383.
17. Nikava H., Nishimura H.,Yamamoto Т., Samaranayake Y.H. A novel method to studio the hyphal phase of Candida albicans and to evaluate its hydrophobicity// Oral. Microbiol. Immunol. -1995. -№10.- P.110-114.
18. Маянский A.H., Салина E.B., Абаджиди M.A. и др. Адгезивные реакции в системе «буккальные эпителиоциты -Candida albcans» у детей с бронхиальной астмой и гастродуоденитом/Щедиатрия. -2002.- № 3.- С. 41-43.
19. Основы биохимии/ Под ред. Анисимова А.А. — М.: Высшая школа, 1986.- 551 с.
20. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. — Екатеринбург: УрО РАН, 2001.-284 с.
21. Schaller М., Boeld U., Oberbauer S., et al. Polymorphonuclear leukocytes (PMNs) induce protective Thl-type cytokine epithelial responses in an in vitro model of oral candidosis// Microbiology.-2004.- №150.- P.2807-2813.
22. Новиков B.B. Растворимые формы дифференцировочных антигенов гемопоэтических клеток// Гематология и трансфузиология.-1996.- № 6.- С.40-43.
Поступила в редакцию журнала 05.09.06 г.
Рецензент: Н. П. Елинов
