CC BY
25УДК 577.171.4:579.86:675.016:539.612:616.594.171.2
ВЛИЯНИЕ ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА ЭНТЕРОКОККОВ НА АДГЕЗИю CANDIDA ALBICANS (BERKHOUT) К БУККАЛЬНЫМ ЭПИТЕЛИОЦИТАМ IN VITRO
Заславская м.и. (профессор кафедры)*, Александрова н.А. (аспирант), Жукова о.А. (ассистент кафедры), 2Карасева А.Б. (аспирант), 2,3суворов А.н. (зав. отделом, зав. кафедрой)
1 Нижегородская государственная медицинская академия, Нижний Новгород; 2 Институт экспериментальной медицины, Санкт-Петербург; 3 Санкт-Петербургский государственный университет, Россия
©Коллектив авторов, 2016
Выявлено, что метаболиты энтерококков снижают адгезию Candida разных видов на буккальных клетках, но не приводят к десорбции уже адгезированных на эпителиоцитах клеток Candida spp. Наибольшей активностью обладают продукты метаболизма энтерококков с молекулярной массой 3-10 кДа, которые вызывают конформационные изменения адгезивных молекул Candida. Предварительная инкубация Candida albicans с метаболитами Enterococcus faecium L3 подавляет способность микромицетов прикрепляться к IL-6/IL-8- стимулированным эпителиоцитам.
Ключевые слова: адгезия, Candida, метаболиты энтерококков, цитокины, эпителиоциты
INFLUENCE OF ENTEROCOCCI METABOLITES ON CANDIDA ALBICANS (BERKHOUT) ADHESION TO BUCCAL EPITHELIAL CELLS IN VITRO
1Zaslavskaya M.i. (professor of the chair), 1Aleksandrova N.A. (postgraduate student), 1Lukova o.A. (assistant of the chair), 2Karaseva A.B. (postgraduate student), 2,3suvorov A.N. (head of the department, head of the chair)
1 Nizhny Novgorod State Medical Academy, Nizhny Novgorod;
2 Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg; 3 St. Petersburg State University, Russia
©Collective of authors, 2016
It is revealed that the enterococcal metabolites reduce the adhesion of different Candida species on the buccal cells, but do not cause desorption of already adhered Candida spp. on epithelial cells. The most active metabolites of enterococci have a molecular weight 3-10 kDa and induce conformational changes of Candida adhesion molecules. Pre-incubation of Candida albicans with Enterococcus faecium L3 metabolites suppress fungal adhesion on IL-6/ IL-8- stimulated epithelial cells.
Key words: adhesion, Candida, cytokines, enterococcal metabolites, epithelial cells
введение
Адгезия является обязательным этапом колонизации слизистых оболочек Candida spp. [1-3]. При этом адгезию рассматривают не только как механическое прикрепление микроорганизма к субстрату, но и как процесс, в котором оба компонента системы «эпителиальная клетка - микроорганизм» активно взаимодействуют между собой [4, 5]. Известно, что представители нормальной микробиоты могут оказывать различное влияние на взаимодействие Candida с эпителиоци-тами слизистых оболочек человека [6].
Цель работы - исследование способности метаболитов энтерококков изменять адгезивные свойства микромицетов в экспериментальной тест-системе «Candida albicans - буккальные эпителиоциты» in vitro.
материалы и методы
Чистые культуры штаммов C. albicans 601, C. gla-brata 44-1, C. krusei 583, C. tropicalis 127 и C. kefir 17 выращивали (дрожжевая фаза) на декстрозном агаре Сабуро (HiMedia, India) (24 ч, 37 °С). Посевы смывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР, рН 7,2-7,4), трижды отмывали десятикратным объемом ЗФР (1000g, 15 мин), клеточные агрегаты удаляли центрифугированием (40g, 2 мин), затем ресуспендирова-ли в концентрации 107 кл/мл в ЗФР.
Буккальные эпителиоциты получали от здоровых доноров 18-35 лет, утром, натощак, путем соскоба с внутренней поверхности щеки. Эпителиальные клетки трижды отмывали от слюны ЗФР (40g, 5 мин), готовили взвесь с концентрацией 106 кл/мл. Концентрацию эпителиоцитов определяли путем измерения оптической плотности суспензии на денситометре DEN-1 (ООО «Biosan», Латвия). В каждой серии экспериментов использовали эпителиоциты, полученные не менее чем от 3-х доноров.
Enterococcus faecium (штаммы L3, 651, 682, 2482) и Enterococcus faecalis (штаммы 173-5, 174-3, 179-2, 4276, 4304, 4306, 4314) культивировали в бульоне TSB (Soybean-Casein Digest broth, Becton, Dickenson and Company, USA, France). Супернатанты отделяли от микробных клеток центрифугированием (2000g, 15 мин), затем фильтровали через бактериальные фильтры с диаметром пор 20 мкм (Sterile syringe filter, Corning, Germany).
Для оценки уровня искусственной колонизации Candida, полученные в дрожжевой фазе (107 кл/мл)**, инкубировали в равных объемах (по 0,5 мл) с взвесью эпителиоцитов (106 кл/мл) в ЗФР (30 мин, 37 °С), встряхивая каждые 5 мин. Эпителиоциты трехкратно отмывали ЗФР (40g, 5 мин) от неприкрепившихся микромицетов, из осадка клеток (0,2 мл) готовили мазки [7]. Полученные препараты фиксировали 96% этанолом (10 мин), окрашивали 0,25% водным раствором азура А (Sigma, USA). Индекс искусственной колонизации определяли как среднее количество адгезированных Candida в перерасчете на один эпителиоцит (канд/эп) после световой микроскопии 100 эпителиальных клеток.
Для фракционирования растворимых продуктов
* Контактное лицо: Заславская Майя Исааковна,
e-mail: [email protected]
Выбранная концентрация Candida дает максимальные показатели искусственной колонизации и минимальное количество свободных микромицетов в поле зрения при подготовке микроскопических препаратов
метаболизма энтерококков полученный фильтрат центрифугировали в пробирках со встроенным микрофильтром (Amicon® Ultra-15) с диаметром пор для молекул 3кДа, 10кДа или 30 кДа (6000g, 40 мин). Полученные после центрифугирования фракции бактериальных метаболитов с атомной массой менее 3кДа, 10кДа или 30 кДа соответственно использовали в дальнейших экспериментах.
Молекулярно-генетические исследования штаммов энтерококков для выявления генов entA, entB, entXa, entXb, lac, entP, cylA, cylB, cylM, кодирующих цитолизины и бактериоцины [8], проводили методом ПЦР с ДНК праймерами, сконструированными для данной работы, по методике, описанной ранее [9]. При конструировании праймеров применяли программу Primer 3.0 National Institutes of Health. Хромосомную ДНК энтерококков выделяли с помощью наборов «ДНК-ЭКСПРЕСС» Литех, Россия.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе работы исследовали влияние продуктов метаболизма различных штаммов E. faecalis и E. faecium на способность C. albicans штамм 601*** прикрепляться к эпителиальным клеткам in vitro. Грибы обрабатывали продуктами метаболизма энтерококков в течение 30 мин при 37 °С, инкубировали с буккаль-ными эпителиоцитами (30 мин, 37 °С), затем отмывали эпителий от неприкрепившихся микроорганизмов. Подсчитывали уровень искусственной колонизации C. albicans на эпителиоцитах. В контроле вместо метаболитов энтерококков использовали стерильный бульон TSB.
В большинстве случаев было выявлено снижение адгезивной способности C. albicans после обработки метаболитами энтерококков (табл.1).
Таблица 1
Антикандидозная активность и способность продуцировать бактериоцины и цитолизины у различных штаммов E. faecium и E. faecalis
Штаммы энтерококков Кратность снижения адгезии C. albicans на эпителиоцитах под действием метаболитов энтерококков(количество раз), М ± m Наличие генов, кодирующих цитолизины и бактериоцины
E. faecium L3 1,77±0,29* EntA, EntB, EntXa, EntXb
E. faecium 2482 1,20±0,17 cylA, cylB, cylM
E. faecium 682 1,19±0,15 cylA, cylB, cylM, Ш
E. faecium 651 1,17±0,17 cylA, cylB, cylM
E. faecalis 4306 1,60±0,36* cylA, cylB, cylM, entXa, entXb
E. faecalis 179-2 1,47±0,11* отсутствуют
E. faecalis 4314 1,26±0,14* cylA, cylB, cylM, entXa, entXb
E. faecalis 174-3 1,20±0,13 отсутствуют
E. faecalis 173-5 1,16±0,16 отсутствуют
E. faecalis 4304 0,95±0,11 Ш
E. faecalis 4276 0,90±0,14 отсутствуют
* - достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
Антиадгезивный эффект энтерококков в отношении C. albicans носил выраженный штаммоспецифи-ческий характер. При этом достоверное снижение адгезии C. albicans на эпителиоцитах наблюдали после обработки фунгальных клеток метаболитами E. faecium L3, E. faecalis 4306, E. faecalis 179-2, E. faecalis 4314 (р<0,05); тенденцию к снижению адгезивных свойств
*** Данный штамм отличался средними, но наиболее постоянными показателями адгезии.
у грибов прослеживали также при обработке микро-мицетов метаболитами других штаммов энтерококков (табл. 1).
Исследовали антиадгезивный эффект продуктов метаболизма энтерококков на Candida разных видов с использованием штамма E. faecium L3, метаболиты которого обладали наибольшим воздействием на грибы (табл.1). Установлено, что антиадгезивный эффект продуктов метаболизма энтерококков проявлял себя не только в системах с C. albicans, но также и с другими видами Candida (табл. 2). При этом, выраженный эффект отмечали в экспериментах с C. glabrata 44-1, C. krusei 583 и C. tropicalis 127, адгезивность которых снижалась под действием метаболитов энтерококков в 1,77±0,29, 1,63±0,22 и 1,25±0,09 раз соответственно (р<0,05). В экспериментах с C. kefyr 17 достоверных отличий от контроля не обнаружили, что было связано, по-видимому, с низкой адгезивной способностью штамма.
Таблица 2
Влияние продуктов метаболизма E. faecium L3 на адгезию Candida spp. к буккальным эпителиоцитам, М ± m
Виды Candida Показатель адгезии (Candida/эпит.) Кратность снижения адгезии Candida на эпителиоцитах (количество раз)
Контроль: интактные Candida Candida после обработки метаболитами
C. albicans 601 5,79±0,87 3,37±0,39* 1,72±0,16*
C. glabrata 44-1 5,79±0,86 3,45±0,39* 1,77±0,29*
C. krusei 583 2,33±0,43 1,67±0,37* 1,63±0,22*
C. tropicalis 127 3,07±0,42 2,57±0,27* 1,25±0,09*
C. kefyr 17 0,76±0,05 0,82±0,13 0,94±0,06
* -достоверность отличий относительно контроля (р<0,05)
Исследовали влияние продуктов метаболизма энтерококков на адгезивность буккальных эпителиоцитов. Для этого клетки буккального эпителия инкубировали с метаболитами E. faecium L3, затем проводили эксперимент по оценке уровня искусственной колонизации Candida на эпителиоцитах. В контроле использовали эпителиальные клетки, не обработанные метаболитами энтерококков. Установлено, что продукты метаболизма энтерококков слабо влияли на буккальные эпи-телиоциты, повышая адгезивный потенциал клеток в 1,07 раз (р<0,05). Такая незначительная реакция могла быть связана с отсутствием специфических мишеней на эпителиоцитах для литических ферментов E. faecium или со способностью буккальных клеток к быстрой регенерации своего адгезивного аппарата.
Энтерококки относятся к молочнокислым бактериям [8, 10], поэтому мы предположили, что негативное влияние метаболитов энтерококков на адгезивные свойства микромицетов могло быть обусловлено воздействием молочной кислоты. Для проверки этого предположения был определен рН супернатанта бульонной культуры E. faecium L3, выращенной на трип-тическом соевом бульоне (ТСБ), который составлял 6,6 (Hanna HI 2210). В контроле в стерильный бульон ТСБ добавляли молочную кислоту, доводя рН до того же значения, что и в опытном образце с метаболитами энтерококков. Негативным контролем служил стерильный бульон ТСБ с рН=7,0.
Выявили, что закисление среды молочной кислотой до рН 6,6 приводило к достоверному повышению адгезии Candida на буккальных эпителиоцитах в 1,15
раз (р<0,05). В то же время, супернатант бульонной культуры, содержащий метаболиты энтерококков, с аналогичным рН (6,6) снижал адгезивность грибов к эпителиоцитам в 1,26 раза (р<0,05). Таким образом, культуральные среды, имеющие одинаковый рН, но содержащие разные органические компоненты, раз-нонаправлено влияли на адгезивность Candida; это означало, что рН среды не определяет направление в изменении их адгезивности. Снижение адгезии C. albicans на эпителиоцитах также нельзя было объяснить гибелью микромицетов под действием продуктов метаболизма энтерококков, поскольку ранее в нашей лаборатории было установлено отсутствие достоверных различий в адгезивной активности живых и инактиви-рованных клеток этих микромицетов [6].
Мы предположили, что снижение адгезивности C. albicans, обработанных метаболитами энтерококков, могло быть следствием экранирования молекул адгезии либо структурных изменений рецепторного аппарата грибов. В последующих экспериментах мы проверили данные гипотезы. С целью удаления не-ковалентно связанных частиц клетки Candida обрабатывали метаболитами E. faecium L3, затем трижды отмывали десятикратным объемом ЗФР, смешивали в равных объемах (0,5 мл) с 0,1% водным раствором до-децилсульфата натрия (ДДС) при постоянном перемешивании (20 °С, 10 мин, 6'100 мин-1) на термомиксере («Eppendorf», США), отмывали и ресуспендировали в ЗФР. Контролем служили интактные клетки, обработанные ДДС. Обнаружили, что удаление нековалентно связанных молекул с поверхности грибов не приводило к восстановлению исходной адгезивной активности C. albicans. Таким образом, снижение адгезивных способностей клеток грибов после их экспозиции с продуктами метаболизма энтерококков было результатом конформационных изменений адгезивных молекул Candida. Это было показателем того, что адгезины грибов не экранировались, а необратимо модифицировались под действием метаболитов энтерококков, обладающих, возможно, ферментативной активностью.
Для выявления наиболее активной фракции, обладающей выраженным воздействием в отношении адгезивного аппарата Candida, продукты метаболизма энтерококков разделяли с помощью центрифужных пробирок со встроенными микрофильтрами (Amicon® Ultra-15). Клетки C. albicans обрабатывали отдельными фракциями, содержащими продукты метаболизма с молекулярной массой менее 30, 10 и 3 кДа, затем исследовали уровень искусственной колонизации грибов на эпителиоцитах.
Установили, что метаболиты E. faecium L3 из разных фракций по-разному влияли на адгезивность C. albicans (Рис.1).
Рис. 1. Влияние различных фракций продуктов метаболизма энтерококков на адгезивность C. albicans штамм 601 в тест-системе с эпителиоцитами.
Так, метаболиты энтерококка, содержащие белки и пептиды с молекулярной массой менее 30 кДа и 10 кДа, снижали способность Candida адгезироваться на буккальных эпителиоцитах в 1,41 и в 1,36 раза соответственно (p<0,05), при этом значимых различий в антиадгезивном эффекте между этими фракциями не наблюдали (p>0,05). Метаболиты с молекулярной массой менее 3 кДа, наоборот, повышали адгезивность грибов в 1,25 раза. Исходя из полученных данных, установлено, что большинство метаболитов энтерококков, обладающих повреждающим (либо модифицирующим) эффектом в отношении адгезинов Candida, имели молекулярную массу от 3 до 10 кДа. Известно, что именно в этом диапазоне молекулярных весов определяются антимикробные пептиды - энтероцины. Например, штамм E. faecium L3, обладающий наиболее выраженный эффектом по подавлению адгезивной способности Candida (табл.1.), характеризуется наличием пяти генов бактериоцинов в геноме, причем экспрессия двух из пяти обнаруженных генов доказана [11, 12].
При исследовании штаммов с использованием специфических ДНК праймеров к генам некоторых из бактериоцинов (табл.1.) выявили, что, наряду с E. faecium L3, еще два штамма энтерококков, чьи продукты метаболизма существенно снижали адгезивность Candida (E. faecalis 4306 и E. faecalis 4314), имели гены антимикробных пептидов и цитолизинов. При этом обратили внимание на тот факт, что у всех вышеуказанных штаммов энтерококков обнаружили гены бактериоцинов EntXa и EntXb. Можно предположить, что продукты экспрессии данных генов могли обусловить феномен подавления адгезии Candida в системах с эпителиоцитами. В то же время, мы отметили, что у штамма E. faecalis 179-2, также обладающего выраженной антикандидозной активностью в экспериментах, не выявили генов бактериоцинов и цитолизинов (табл. 1.). Это дает возможность предположить, что энтерококки могут продуцировать достаточно широкий спектр молекул из различных функциональных групп, способных вызывать структурные изменения в адгезивном аппарате Candida.
На следующем этапе изучали влияние продуктов метаболизма энтерококков на способность ранее адге-зированных Candida открепляться от эпителиоцитов (десорбцию). Для этого, мукозальные клетки инкубировали с грибами (30 мин, 37 °С), после чего обраба-
тывали метаболитами энтерококков, затем определяли индекс искусственной колонизации эпителиоцитов. Установлено, что обработка метаболитами энтерококка не оказывает влияния на десорбцию Candida с буккального эпителия (p>0,05). Следовательно, продукты метаболизма энтерококков оказывают влияние на рецепторы адгезии грибов до момента их контакта с клетками эпителия.
Известно, что кандидоз является оппортунистической инфекцией, и ее развитию могут способствовать воспалительные реакции [13]. При патологическом процессе повышается уровень различных цитокинов, например, таких как IL-6, IL-8 и пр., которые относятся к медиаторам, запускающим и поддерживающим воспалительную реакцию [14, 15]. Выявлено, что обработка эпителиоцитов IL-6, IL-8 повышала адгезивность буккальных клеток в отношении C. albicans [7], что косвенно указывает на то, что воспалительные процессы могут способствовать контаминации эпителия грибами. С другой стороны, как нами было показано ранее, метаболиты энтерококков - представителей нормальной микробиоты - снижали адгезию Candida на эпителиоцитах. Для оценки совместного действия этих факторов на систему «Candida -эпителиоциты» был проведен ряд экспериментов с цитокинами и метаболитами энтерококка. Эпителиоциты обрабатывали IL-6, («Sigma», USA; 10- 12 г/мл), IL-8 («Sigma», USA;10-12 г/мл), трижды отмывали и инкубировали с Candida, обработанными метаболитами энтерококка (30 мин, 37°С). В контроле использовали буккальные эпите-лиоциты, обработанные IL-6 или IL-8 с интактными Candida. Негативным контролем служили интактные эпителиоциты, взаимодействующие с необработанными грибами. Выявлено, что уровень адгезированных Candida на эпителиоцитах, прединкубированных с IL-6 или IL-8, существенно повышался - в 1,51±0,26 и 1,42±0,25 раза соответственно (p<0,05). В то же время, адгезия грибов, предварительно обработанных метаболитами энтерококков, на буккальных эпителиоци-тах, контактировавших ранее с цитокинами (IL-6 или IL-8), была значительно ниже по сравнению с адгезией в системе «интактные C. albicans - эпителиоциты, об-
работанные интерлейкинами» (Рис. 2) и снижалась до уровня показателей негативного контроля. Таким образом «негативный эффект» цитокинов на эпителий, связанный с усиленной контаминацией буккальных клеток микромицетами, может быть нивелирован предварительной обработкой Candida продуктами метаболизма энтерококков.
IL-£ IL-S
I I контроль: интактные эпителиоциты + интактные Candida [^обработанные цитокином эпителиоциты + интактные Candida ■ обработанные цитокином эпителиоциты + Candida, инкубированные с метаболитами Е. faecium L3. * - достоверность отличии относительно контроля (р< 0,05) ** - достоверность отличии относительно эпителиоцитов, обработанный цитокином. с ингаетными Candida {: I ■: " Ог: :
Рис. 2. Влияние цитокинов IL-6, IL-8 и метаболитов E. faecium L3 на экспериментальную тест-систему «С. albicans -эпителиоциты».
ВЫВОДЫ
1. Метаболиты энтерококков снижают адгезивность Candida spp. в экспериментальной тест-системе с буккальными эпителиоцитами in vitro.
2. Метаболиты энтерококков, преимущественно с молекулярной массой 3-10 кДа, вызывают изменения в рецепторном аппарате Candida и не повреждают адгезивные структуры эпителиоцитов человека.
3. Воздействие цитокинов IL-6 и IL-8 на буккальные клетки повышает уровень искусственной колонизация в системе «эпителиоциты - C. albicans». В то же время, прединкубация C. albicans с метаболитами E. faecium L3 подавляет способность микромицетов прикрепляться к IL-6/IL-8- стимулированным эпителиоцитам.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Занько С.Н. Вагинальный кандидоз // Охрана материнства и детства. - 2006. - №1 (7). - С. 64-71.
2. Капустина О.А., Карташова О.Л. Факторы патогенности грибов рода Candida и возможность их регуляции эфирными маслами // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал) - 2013. - №1. URL: http://www. elmag.uran.ru.
3. Williams D.W., Jordan R. P. C., Wei X., et al. Interactions of Candida albicans with host epithelial surfaces // J. Oral. Microbiol. - 2013. - Vol. 5, №10. - P. 340-358.
4. Naglik J.R., Moyes D.L., Wachtler B., Hube B. Candida albicans interactions with epithelial cells and mucosal immunity // Microbes Infect. - 2011. - №13. - P. 963-976.
5. Кремлева Е.А., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Эпителиально-бактериальные взаимодействия как основа формирования микробиоценоза // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012. - № 6. - С. 89-95.
6. Заславская М.И. Взаимодействие Candida albicans с нейтрофилами и эпителиоцитами в экспериментальных системах: Автореф. дисс... д.б.н. - М., 2009. - 49 с.
7. Заславская М.И., Маянский А.Н. Роль нуклеарного фактора-kB в обеспечении взаимодействий нейтрофилов и клеток эпителия слизистой полости рта человека с Candida albicans //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - №5. - С. 61-65.
8. Ермоленко Е.И. Бактериоцины энтерококков: проблемы и перспективы. Обзор литературы // Вестник Санкт-Петербургского университета. - 2009. - Сер. 11, Медицина. №3. - С. 184-201.
9. Criado R., Diep D.B., Aakra A., et al. Complete sequence of the enterocin Q-encoding plasmid pCIZ2 from the multiple bacteriocin producer Enterococcus faecium L50 and genetic characterization of enterocin Q Production and Immunity// Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - Vol. 72, №10. - P. 6653-6666.
10. Бондаренко В.М., Суворов А.Н. Симбиотические энтерококки и проблема энтерококковой оппортунистической ин-
фекции. - М., 2007. - С. 30.
11. Karaseva A., Tsapieva A., Pachebat J., Suvorov A. Draft genome sequence of probiotic Enterococcusfaecium strain L-3// Genome Announc. - 2016. - Vol. 4, №1: e01622-15.
12. Yermolenko E., Kolobov A., Chernysh A., Suvorov A. Influence of synthetic peptide inductors on antibacterial activity of enterococci// Beneficial Microbes. - 2011. - Vol. 1, №1. - P. 253-257.
13. Кунцевич Л.Д., Шибаева Е.В., Мишанов В.Р. и др. Возбудители генитального кандидоза у женщин и их чувствительность к антимикотикам // Вестник дерматологии и венерологии - 2009. - №4. - С. 45-48.
14. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы: руководство для врачей. - М.: ГЭОТАР. Медиа. - 2009. - 352 с.
15. Москалёв А.В., Сбойчаков В.В., Рудой А.С. Общая иммунология с основами клинической иммунологии: учебное пособие. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. - 352 с.
Поступила в редакцию журнала 08.04.2016
Рецензент: Н.А. Новикова
