CC BY
158
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК 618+616.992.282:612.621.31:612-018.7
ВЛИЯНИЕ ЖЕНСКИХ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ И ЦИТОКИНОВ НА АДГЕЗИВНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК С CANDIDA ALBICANS IN VITRO
О.А. Лукова, Н.А. Александрова, М.И. Заславская,
ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»
Лукова Ольга Алексеевна - e-mail: olga_domracheva@bk.ru
Было обнаружено, что женские половые гормоны влияют на способность эпителиоцитов слизистых оболочек абсорбировать C. albicans in vitro. При этом прогестерон и лютеинизируюший гормон стимулируют, а эстрадиол подавляет контакт мукозальных клеток с кандидами. Обработанные гормонами буккальные и вагинальные эпителиоциты обладают сходной реактивностью в отношении C. albicans. Провоспалительные цитокины IL-1, IL-6, IL-8 и TNFa способны усиливать контактные взаимодействия между буккальными клетками и C. albicans; в свою очередь INFa снижает возможность кандид колонизировать эпителиальные клетки.
Ключевые слова: кандиды, эпителиоциты, адгезия, женские половые гормоны, цитокины.
It was detected woman sex hormones influence on the ability of mucosal epithelial cells to absorb C. albicans in vitro. Thus progesterone and luteinizing hormone stimulate, but estradiol suppresses contact of mucosal cells with candida. Hormone-treated buccal and vaginal epithelial cells have shown similar reactivity for C.albicans. Inflammatory cytokines IL-1, IL-6, IL-8 and TNFa augment contacts between buccal cells and C.albicans, on the contrary, INFa reduces candida possibility to epithelial cell colonization.
Key words: candida, epithelial cells, adhesion, woman sex hormones, cytokines.
Введение
Кандидоз слизистых оболочек начинается с адгезии грибов рода Candida на поверхности эпителиальных клеток [1, 2]. Возможность последующего закрепления и размножения патогена зависит от вирулентности штамма, а также от уровня резистентности слизистых оболочек [3, 4, 5]. Антимикробная устойчивость слизистых определяется многими факторами, в частности, функциональной активностью эпителиоцитов, которая способна меняться под действием различных стимулов [6, 7].
Целью настоящей работы было определение способности женских половых гормонов и некоторых цитокинов регулировать адгезивные реакции эпителиоцитов слизистых оболочек с Candida albicans.
Материал и методы
Культуру C. albicans штамм 601 из коллекции кафедры микробиологии и иммунологии НижГМА получали в дрожжевой фазе после инкубации (24 ч, 37°С) на агаре Сабуро (HiMedia Laboratory, India). Посевы смывали забуферен-ным физиологическим раствором (ЗФР, рН 7,2-7,4), трижды отмывали десятикратным объемом ЗФР (1000 g, 15 мин) и ресуспендировали в концентрации 107 кл/мл в ЗФР.
Клетки буккального и вагинального эпителия получали от здоровых женщин 25-36 лет путем соскоба с внутренней поверхности ротовой или вагинальной полости соответственно. Эпителиальные клетки трижды отмывали от слизистого секрета ЗФР (40 g, 5 мин.), готовили взвесь с концентрацией 106 кл/мл.
Концентрацию клеток микромицетов и эпителиоцитов определяли путем измерения оптической плотности суспензии на денситометре DEN-1 (ООО «Biosan», Латвия).
В эксперименте эпителиоциты обрабатывали гормонами или цитокинами («Sigma», USA) в течение 30 мин при
t=370C. В работе использовали растворы женских половых гормонов в ЗФР: эстрадиол в концентрации 450 пмоль/л, лютеинизирующий гормон (ЛГ) - 100 мМЕ/мл, фоллику-лостимулирующий гормон (ФСГ) - 50 мМЕ/мл, прогестерон - 50 нмоль/л, а также цитокины: интерлейкин-1 (IL-1) -10-12 г/мл, интерлейкин-6 (IL-6) - 10-12 г/мл, интерлейкин-8 (IL-8) - 10-12 г/мл, фактор некроза опухоли-a (TNFa) - 10-9 г/ мл и a-интерферон человека (INFa) - 10-9 г/мл. В контроле использовали эпителиальные клетки, не подвергавшиеся воздействию гормонов или цитокинов. Каждая серия экспериментов проводилась на эпителиоцитах, полученных от 5 доноров.
Проводили искусственную колонизацию C. albicans на клетках эпителия, для чего взвесь эпителиоцитов инкубировали (30 мин., 370С) в равных объемах с клетками кандид. Эпителиоциты отмывали от несвязавшихся кандид, из осадка эпителиальных клеток готовили мазки, которые после фиксации метанолом окрашивали 0,25%-м водным раствором азура А («Sigma», USA). Подсчитывали количество кандид, закрепившихся на одном эпителиоците (рис.), рассчитывали средний показатель (канд/эпит) после световой микроскопии 100 эпителиальных клеток.
Определение жизнеспособности эпителиальных клеток до и после обработки гормонами или цитокинами проводили на проточном цитофлюориметре BD FACS Canto II System with Fluidics Cart (6-color, blue/red, США). Для этого к 100 мкл эпителиоцитов добавляли 20 мкл красителя 7AAD (7-Amino Actinomycin D), инкубировали 15 минут. Учитывали количество клеток с поврежденными мембранами (мертвые) и способными, в отличие от живых, окрашиваться 7AAD [8].
Статистическую обработку данных проводили по общепринятой методике. Рассчитывали среднюю арифметическую
■
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
и ее стандартную ошибку (М±т). Достоверность различий оценивали при помощи критериев Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия расценивали как статистически значимые при р<0,05.
Результаты и их обсуждение
Процент жизнеспособных эпителиоцитов в контроле и среди клеток, подвергавшихся воздействию гормонов или цитокинов, был сходным и составлял 62-77%.
Было проведено сравнение действия основных гормонов, регулирующих менструальный цикл у женщин: эстра-диол, прогестерон, ФСГ и ЛГ - на возможность эпителио-цитов слизистых оболочек ротовой полости вступать в адгезивные контакты с C. albicans in vitro. Результаты представлены в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1.
Влияние гормонов репродуктивного цикла женщин на адгезивные взаимодействия буккальных эпителиоцитов с C. albicans штамм 601
вагинальных клеток, прединкубированных с гормонами, к адгезивным контактам с C. albicans (таблица 2).
Эксперименты показали сходное как по интенсивности, так и по направлению гормон-опосредованное изменение способности буккальных и вагинальных эпителиоцитов адгезировать кандиды (р>0,05). Отсутствие различий в адгезивности эпителиоцитов из разных биотопов (вагинальная, оральная полости) позволило сделать вывод об однотипной реактивности клеток слизистых оболочек в отношении кандид. В связи с этим в последующих экспериментах использовали тест-систему только с буккальными эпителиоцитами.
На втором этапе работы оценивали влияние цитокинов: IL-1, IL-6, IL-8, TNFa и INFa - на адгезивную активность эпителиоцитов слизистой оболочки полости рта в отношении клеток C. albicans (таблица 3).
ТАБЛИЦА 3.
Влияние цитокинов на адгезивные взаимодействия буккальных эпителиоцитов с C. albicans штамм 601
Индекс искусственной колонизации на буккальных эпителиоцитах (канд/эпит) Кратность Снижение (4) или
Гормоны Контроль: интактные эпителиоциты (канд/эпит) Эпителиоциты, обработанные гормонами (канд/эпит) показателя адгезии относительно контроля (количество раз) увеличение (Т) уровня адгезии кандид на эпителиоцитах относительно контроля
Эстрадиол 4,9±0,3 3,8±0,2 * 1,29±0,2 4
ЛГ 3,6±0,2 4,7±0,2 * 1,31±0,1 Т
Прогестерон 6,5±0,4 8,2±0,3 * 1,26±0,2 Т
ФСГ 5,1±1,1 5,2±0,6 0,9±0,1
Гормоны Индекс искусственной колонизации на буккальных эпителиоцитах (канд/эпит) Кратность изменения показателя адгезии относительно контроля Увеличение^) или снижение (4) адгезии кандид на эпителиоцитах относительно контроля
интактные эпителиоциты (контроль) Эпителиоциты, обработанные цитокинами (эксперимент)
IL-1 6,62±2,0 8,83±2,3 * 1,3±0,1 t
IL-6 8,59±2,7 10,24±2,8 * 1,2±0,1 t
IL-8 3,21±1,1 5,52±0,8 * 1,8±0,5 t
TNF- a 5,04±1,8 10,16±2,2 * 2,0±0,2 t
INF- a 4,83±1,0 2,31±0,3* 2,1±0,3 4
Примечание: * - достоверность отличий относительно контроля (р<0,05).
ТАБЛИЦА 2.
Влияние женских половых гормонов на изменение адгезивности взаимодействия буккальных и вагинальных эпителиоцитов к C. albicans штамм 601
Инкубация эпителиальных клеток ротовой полости с эстрадиолом приводила к подавлению адгезии кандид в 1,29±0,2 раз (р=0,013) (таблица 1). В то же время обработка эпителиоцитов прогестероном и ЛГ повышала адгезию C. albicans на буккальных клетках в 1,26±0,2 и 1,31±0,1 раза соответственно (р=0,016, р=0,007). Обработка эпителиоцитов ФСГ не приводила к изменению адгезивности клеток (p=0,83).
Та же схема эксперимента была использована и в экспериментах с вагинальными эпителиоцитами, после чего было проведено сравнение способности буккальных и
Примечание: * - достоверность отличий относительно контроля (р<0,05).
Прединкубация эпителиальных клеток с IL-1, IL-6, IL-8 и TNFa повышала адгезию C. albicans на эпителиоцитах в 1,3±0,1, 1,2±0,06, 1,8±0,5 и 2,0±0,2 раза соответственно по сравнению с контролем (p=0,033, p=0,046, p=0,025, p=0,017). В то же время обработка эпителиоцитов INFa приводила к снижению адгезии на них кандид в 2,1±0,3 раза (p=0,012) (таблица 3).
Таким образом, женские половые гормоны у женщин способны изменять реактивность эпителиоцитов слизистых оболочек в отношении C. albicans. Зная, что изменение концентрации женских половых гормонов наблюдается не только во время менструального цикла, но также и при беременности [9], можно предположить, что постоянный высокий уровень прогестерона, характерный для беременных, обеспечивает повышенную готовность муко-зальных эпителиоцитов к адгезивным взаимодействиям с кандидами. Это подтверждается исследованиями, указывающими на увеличение частоты вагинального кандидоза среди беременных женщин [10]. При этом, известно, что вагинальный кандидоз не обязательно сопровождается кандидозом полости рта [10]. Эту особенность можно объяснить тем, что микробная колонизация слизистых оболочек патогеном является не только результатом его контакта с эпителиоцитом, но также зависит от антимикробной активности факторов мукозальных секретов, а также взаимодействия с другими представителями микробиоты
Гормоны Буккальный эпителий Вагинальный эпителий
Кратность изменения индекса искусственной колонизации (количество раз) Снижение (4) или увеличение (t) адгезивности эпителиоци-тов Кратность изменения индекса искусственной колонизации (количество раз) Снижение (4) или увеличение (t) адгезивности эпителиоци-тов
Эстрадиол 1,29±0,2 4 1,25±0,2 4
ЛГ 1,31±0,1 t 1,28±0,1 t
Прогестерон 1,26±0,2 t 1,17±0,1 t
ФСГ 0,9±0,2 1,1±0,3
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
данного биотопа. [11]. Эксперименты также показали, что патологические процессы, протекающие на уровне слизистых оболочек и сопровождаемые синтезом большого количества цитокинов [12], участвующих в развитии воспалительной реакции: IL-1, IL-6, IL-8 и TNFa способны увеличивать риск развития кандидоза. В то же время цитоки-ны, обладающие антимикробной активностью, такие как INFa, способствуют снижению контаминации эпителиоци-тов C. albicans.
Выводы
1. Женские половые гормоны и цитокины меняют способность эпителиальных клеток к адгезивным контактам с C. albicans.
2. Прогестерон и лютеинизирующий гормон усиливают, а эстрадиол уменьшает адгезивность эпителиоцитов в отношении C. albicans.
3. Провоспалительные цитокины (IL-1, IL-6, IL-8 и TNFa) способны усиливать контактные взаимодействия между мукозальными клетками и C. albicans; в свою очередь INFa
снижает возможность кандид колонизировать буккаль-ный эпителий. [Д
ЛИТЕРАТУРА
1. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В.. Кандидоз. М: Триада-Х, 2001. 472 с.
SergeevA.Yu, Sergeev Yu.V.. Kandidos. M: Triada-X, 2001.472s.
2. Williams D.W., Jordan R. P. C., Wei X., Alves C.T., Wise M. P, Wilson M.J., Lewis M.A.O. Interactions of Candida albicans with host epithelial surfaces J. Oral. Microbiol. 2013.Vol. 5. N. 10. P. 340-358.
3. Cannon R.D., Holmes A.R., Mason A.B., Monk B.C. Oral candida: clearance, colonization, or candidiasis? J. Dent. Res. 1995. Vol. 74. N.5. P.1152-1161.
4. Naglik J.R., Moyes D.L., Wachtler B., Hube B. Candida albicans interactions with epithelial cells and mucosal immunity. Microbes Infect. 2011. N. 13. P. 963-976.
5. Ueta E., Tanida T., Doi S., Osaki T. Regulation of Candida albicans growth and adhesion by saliva. J. Lab. Clin. Med. 2000. Vol. 136. N 1. P. 66-73.
6. Маянский А.Н., Абаджиди М.А., Маянская И.В., Заславская М.И., Махрова Т.В. Реактивность буккальных эпителиоцитов: индикация местных и общих нарушений гомеостаза. Клиническая лабораторная диагностика. 2004. № 8. С. 31-34.
Mayanskiy A.N., Abadzhidi М.А., Mayanskaya I.V., Zaslavskaya M.I., Makhrova TV. Reactivnost buccalnykh epiteliotsitov: indikatsia mestnykh i obshchikh narusheniy gomeostaza. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2004. № 8. S. 31-34.
7. Ochiel D.O., Fahey J.V., Ghosh M., Haddad S.N., Wira C.R. Innate Immunity in the Female Reproductive Tract: Role of Sex Hormones in Regulating Uterine Epithelial Cell Protection Against Pathogens. Curr Womens Health Rev. 2008. Vol.4. N. 2. P.102-117.
8. Perfetto S.P., Chattopadhyay P.K., Lamoreaux L., Nguyen R., Ambrozak D., Koup R.A., Roederer M. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 2006. Vol. 313. №. 1-2. P. 199-208.
9. Леонова З.А., Флоренсов В.В. Синтез и функции женских половых гормонов. Сибирский медицинский журнал. 2013. № 2. C. 10-13.
Leonova Z.A., Florensov V.V. Sintez i funktsii zhenskikh polovykh gormonov. Sibirskiy meditsinskiy zhurnal. 2013. № 2. S. 10-13.
10. Каплин Н.Н., Жерновая Я.С., Сердюк С.Н., Голубничая В.Н. Кандидоз и кандидоносительство в акушерстве. Проблемы медицинской микологии. 2002. Т. 4. № 3. С. 31-33.
Kaplin N.N., Zhernovaya Ya.S, Serdyuk S.N., Golubichnaya V.N. Kandidoz i kandidonositelstvo v akusherstve. Problemy meditsinskoy mikologii. 2002. Т. 4. № 3. S. 31-33.
11. Лебедева О.П., Калуцкий П.В. Влияние половых стероидов на микрофлору влагалища (обзор). Лечебное дело. 2006. №2. С.44-47.
Lebedeva О.й, Kalutskiy P.V. Vliyanie polovykh steroidov na mikrofloru vlagalishcha (obzor). Lechebnoe delo. 2006. №2. S.44-47.
12. Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж. Роль цитокинов в воспалительном процессе. Сибирский медицинский журнал, 2008. № 8. C. 5-8.
Serebryannikova S.N., Seminsky I.Zh. Rol' cytokinov v vospalitelnom processe. Sibirskiy meditsinskiy zhurnal. 2008. № 8. S. 5-8.
