CC BY
34
▲1
SSM
10. Каграманова Ж.А. Разработка и обоснование комплексной клинико-иммунологической диагностики и иммунотерапии воспалительных заболеваний матки и ее придатков: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М. 2014. 313 с.
Kagramanova Z.H. Razrabotka i obosnovanie kompleksnoy kliniko-immunologicheskoy diagnostiki i immunoterapii vospalitelnyh zabolevaniy matki i ee pridatkov: avtoref. diss.... kand. med. nauk. M. 2014.313 s.
11. Viana G.A., Cela V., Ruggiero M., Pluchino N., Genazzani A.R., Tantini C. Endometritis in infertile couples: the role of hysteroscopy and bacterial endotoxin. JBRA Assisted Reproduction. 2015. № 19 (1). Р. 21-23.
12. Gleicher N., Kim A., Michaeli T., Lee H.J., Shohat-Tal A., Lazzaroni E., Barad D.H. A pilot cohort study of granulocyte colony-stimulating factor in the treatment of unresponsive thin endometrium resistant to standard therapies. Hum Reprod. 2013. Jan. № 28 (1). Р. 172-177.
13. Cicinelli E., De Ziegler D., Nicoletti R., Colafiglio G., Saliani N., Resta L., Rizzi D., De Vito D. Chronic endometritis: correlation among hysteroscopic, histologic, and bacteriologic findings in a prospective trial with 2190 consecutive office hysteroscopies. Fertil Steril. 2008. № 89. Р. 677-684.
14. Takasaki A., Tamura H., Miwa I., Taketani T., Shimamura K., Sugino N. Endometrial growth and uterine blood flow: a pilot study for improving endometrial thickness in the patients with a thin endometrium. Fertil Steril. 2010. Apr. № 93 (6). Р. 1851-1858.
15. Гомболевская Н.А., Марченко Л.А. Современные критерии диагностики хронического эндометрита (обзор литературы). Проблемы репродукции. 2012. Т. 18. № 1. С. 42-46.
Gombolevskaya N.A., Marchenko L.A. Sovremennye kriterii diagnostiki hronicheskogo endometrita (obzor literatury). Problemy reproduktcii. 2012. T. 18. № 1. S. 42-46.
16. Мотовилова Т.М., Замыслова В.П., Боровкова Л.В., Качалина Т.С. и др. Ведущие инфекционные факторы хронического воспалительного процесса в эндометрии у пациенток нижегородской области. «Актуальные вопросы акушерства, гинекологии, неонатологии и педиатрии» // Сборник научных трудов, посвященный 35-летию со дня основания института / под ред. А.И. Малышкиной, С.Б. Назарова. Иваново: Изд-во «МИК», 2015. С. 96-101.
Motovilova T.M., Zamyslova V.P., Borovkova L.V., Kachalina T.S. i dr. Vedushie infekcionnye faktory hronicheskogo vospalitel'nogo processa v endometrii u patsientok nizhegorodskoy oblasti. «Aktual'nye voprosy akusherstva, ginekologii, neonatologii i pediatrii» // Sbornik nauchnyh trudov, posvyashhennyy 35-letiyu so dnya osnovaniya institute / pod red. A.I. Malyshkinoy, S.B. Nazarova. Ivanovo: Izd-vo «MIK», 2015. S. 96-101.
17. Van den Bruel A., Aertgeerts B., and Buntinx F. Results of diagnostic accuracy studies are not always validated. J Clin Epidemiol. 2006. № 59. Р. 559-566.
18. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. Изд-во Фолиант, 2008. 552 с.
Ketlinskiy S.A., SimbirtsevA.S. Citokiny. Izd-vo Foliant, 2008. 552 s.
19. Скуинь Л.М. Иммунологические взаимоотношения в системе «мать-плацента-плод». Новости прикладной иммунологии и аллергологии. 2003. № 7. С. 1-4.
Skuin L.M. Immunologicheskie vzaimootnosheniya vsisteme «mat'-placenta-plod». Novosti prikladnoy immunologii i allergologii. 2003. № 7. S. 1-4. ^^
ш
УДК: 579.61:616.9.001.6 Код специальности ВАК: 14.01.01, 03.02.03
АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ЭНТЕРОКОККОВ С КАНДИДАМИ НА УРОВНЕ ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА И В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO
Н.А. Александрова1-2, М.И. Заславская1, М.В. Вахромова2,
1ФГБОУ ВО «Нижегородская государственная медицинская академия», 2ООО «Клиника современных технологий "Садко"», г. Н. Новгород
Александрова Наталья Александровна - e-mail: Nataiyuskova@rambier.ru
Изучено взаимодействие энтерококков и кандид на уровне вагинального биотопа у женщин репродуктивного возраста. Обнаружена обратная корреляционная зависимость между количеством энтерококков и кандид в вагинальном секрете у женщин. Исследованы механизмы влияния метаболитов энтерококков на кандиды в экспериментах in vitro. Установлено, что продукты метаболизма энтерококков оказывают слабый фунгицидный эффект в отношении Candida spp. Кроме того, метаболиты энтерококков подавляют адгезию кандид на эпителиальных клетках in vitro.
Ключевые слова: кандиды, энтерококки, вагинальная микрофлора,
адгезия на эпителиоцитах.
It was studied the interaction between enterococci and Candida in the vaginal biotope of women in reproductive age. It was detected a negative correlation between enterococci and candida quantity in the woman vaginal secretion. It was investigated the mechanisms of enterococci metabolites effect on Candida during experiments in vitro. It was founded that metabolites of enterococci have a small fungicidal effect on Candida spp. Furthermore the enterococcal metabolites inhibit the candida adhesion to epithelial cells in vitro.
Key words: сandida, enterococci, vaginal microflora, adhesion to epithelial cells.
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Введение
В настоящее время широко распространены оппортунистические микозы, вызываемые грибами рода Candida, в частности, постоянно отмечается высокий уровень вагинального кандидоза среди женщин детородного возраста [1, 2, 3]. Существуют данные о том, что в присутствии кандид общее количество бактериальной микрофлоры во влагалище снижается, а лечение антибактериальными средствами, подавляющими нормофлору, в свою очередь, приводит к росту числа Candida spp. [4]. Известно, что доминирующими представителями вагинальной микрофлоры являются лактобациллы, способные подавлять рост многих оппортунистических патогенов [3, 5]. К минорным представителям микрофлоры влагалища относят Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp., Ureaplasma spp., представителей семейства Enterobacteriaceae и прочие бактерии [2, 6], однако их вклад в обеспечение колонизационной резистентности слизистой влагалища менее изучен.
Цель исследования: установить характер взаимоотношений между Candida spp. и энтерококками в вагинальной полости у женщин детородного возраста.
Материал и методы
Проводили посев вагинального содержимого женщин (18-35 лет) на базе гинекологического отделения ООО «КСТ "Садко"». Вагинальное содержимое забирали ложкой Фолькмана в стерильную центрифужную пробирку с 1 мл стерильного забуференного физиологического раствора (ЗФР, pH 7,2-7,4). Полученный материал засевали на плотную среду Сабуро (0,1мл) и «Энтерококк-агар» (0,05 мл) по методу Дригальского. Посевы инкубировали (37°С, 48 ч), после чего подсчитывали количество выросших колоний кандид или энтерококков. Ретроспективно вычисляли количество КОЕ в 1 мл нативного материала по формуле: x=ax10n+1, где x - количество микроорганизмов в 1 мл нативного материала, a - количество выросших колоний, n - степень разведения. Для статистического анализа взаимоотношений исследуемых микроорганизмов из всех полученных образцов оценивали лишь те, в которых обнаруживали кандиды или энтерококки, либо оба микроорганизма. Видовую идентификацию микромицетов проводили на HiChrome агаре (Индия), а энтерококков - с помощью наборов для биохимической идентификации Эн-коккус тест (Erba Lachema, Чехия) проходил согласно инструкции.
Для изучения влияния продуктов метаболизма энтерококка на жизнеспособность Candida spp. проводили эксперименты in vitro. Для этого чистую культуру кандид в дрожжевой фазе получали на агаре Сабуро (HiMedia, India) (24 ч, 37°С). Кандиды отмывали (2000 g, 10 мин) и ресуспендировали в ЗФР, затем освобождали от клеточных агрегатов центрифугированием (40g, 2 мин), доводили до концентрации 107 кл/мл. Энтерококки культивировали в бульоне TSB (Soybean-Casein Digest broth, Becton, Dickenson and Company, USA, France) (24 ч, 37°С), метаболиты E. faecalis 671 отделили от бактериальных клеток с помощью бактериального фильтра с диаметром пор 20 мкм (Sterile syringe filter, Corning, Germany). Полученный фильтрат (1 мл) добавили к осадку кандид, в контроле
52% кандиды: норма (до 104 КОЕ/мл)
РИС. 1.
37% кандиды до 105 КОЕ/мл
7% кандиды
с
выше 10 КОЕ/мл
Содержание Candida spp. в вагинальном содержимом в отсутствии Enterococcus spp.
79% отсутствие кандид
8% кандиды: выше нормы
13% кандиды: норма (до 104 КОЕ/мл)
РИС. 2.
Содержание Candida spp. в вагинальном содержимом в нормальном титре (до 103 КОЕ/мл) Enterococcus spp.
89% кандиды, отсутствуют/
5% кандиды: выше нормы
6% кандиды:
4
норма 10 КОЕ/мл
РИС. 3.
Содержание Candida spp. в вагинальном содержимом в повышенном концентрации Entrococcusspp. (свыше 103 КОЕ/мл).
ЮОООг 9000; f 8000 § 7000 ~ 6000 S 5000 1 4000 | 3000! 2000: 1000| Olli
10000 20000 30000 40000 титр энтерококков (КОЕ/мл)
50000
РИС. 4.
Зависимость количества кандид от энтерококков в вагинальном содержимом.
▲1
SSM
использовали 1 мл стерильной среды ТСБ. Полученные пробы инкубировали при температуре 37°С в течение 1, 2 или 24 часов. После термостатирования делали высев по 0,1 мл из каждой пробирки на агар Сабуро и инкубировали 24 часа при температуре 37°С. Подсчитывали количество колоний кандид на агаре после термостатирования.
Для оценки влияния продуктов метаболизма энтерококков на адгезивность Candida albicans в экспериментальной тест-системе «кандиды-эпителий» in vitro определяли индекс искусственной колонизации кандид на вагинальных эпителиоцитах до и после инкубации с метаболитами клинических изолятов E. faecalis 671 или E.faecium 651. Для этого эпителиоциты получали от здоровых женщин путем соскоба из вагинальной полости, трижды отмывали от слизи ЗФР (40g, 5 мин). Суспензию кандид в ЗФР (107 кл/ мл), смешивали в равных объемах (по 0,5 мл) с эпителио-цитами (106 кл/мл), затем добавляли 1 мл метаболитов энтерококков (E. faecalis или E. faecium). Проводили совместную инкубацию всех компонентов в течение 30 мин при 37°С, встряхивая каждые 5 мин. В контроле вместо энтерококковых метаболитов использовали стерильный ЗФР. Эпителиоциты трехкратно отмывали ЗФР от неприкрепившихся кандид (40g, 5 мин); из осадка клеток (0,2 мл) готовили мазки. Полученные препараты фиксировали 96% этанолом (10 мин), окрашивали 0,25% водным раствором азура А (Sigma, USA). Индекс искусственной
ТАБЛИЦА.
Снижение КОЕ Candida spp. после инкубации с метаболитами E. faecalis 671, M±m
Виды кандид Время обработки кандид метаболитами энтерококка
1 ч 2 ч 24 ч
Кратность снижения количества КОЕ Candida spp. после обработки метаболитами энтерококка (количество раз)
C. albicans 601 0,89±0,30 1,50±0,52 0,80±0,17
C. glabrata 44-1 0,99±0,44 1,29±0,33 1,80±0,59
C. krusei 583 1,46±0,61 1,36±0,27 1,23±0,35
C. kefir 17 0,88±0,29 1,22±0,48 2,69±0,96
б. 4,5 4
3,5
2,5 2
1,5 1
0,5 0
Е. faecalis 671 Е. Таесют 651
РИС. 5.
Влияние продуктов метаболизма энтерококков на взаимодействие кандид с эпителиальными клетками ■ - контроль (интактный эпителий) □ - эпителий, обработанный метаболитами энтерококка * - статистически значимые различия показателей относительно контроля (р<0,05)
колонизации определяли как среднее количество адгези-рованных кандид в перерасчете на один эпителиоцит (канд/эп) после световой микроскопии 100 эпителиальных клеток.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку проводили по общепринятой методике с использованием компьютерных программ Excel и Stadia. Данные были представлены в виде средней арифметической (М) и стандартной ошибки средней арифметической (m). Межгрупповые различия анализировались параметрическими или непараметрическими методами, в зависимости от типа распределения. В качестве параметрического критерия был использован критерий Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Взаимосвязь параметров оценивали методом корреляционного анализа, определяя коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs). Силу корреляционной связи определяли по значению rs: ниже 0,3 считали слабой, от 0,3 до 0,7 - средней и от 0,7 до 1,0 - сильной.
Результаты и их обсуждение
Был проведен микробиологический анализ содержимого влагалища, полученного от 552 женщин детородного возраста с дисбиозом влагалища различной этиологии. Из них были отобраны 399 образцов, в которых выявлялись кандиды и/или энтерококки. Из них у 205 женщин (51%) были обнаружены кандиды в разных титрах: 108 образцов имели концентрацию кандид до 104 КОЕ/мл (норма), 72 - свыше 104 и до 105 КОЕ/мл, 25 - свыше 105 КОЕ/мл. При этом из 95% образцов была выделена C. albicans. Энтерококки были найдены у 235 женщин (59%): в 50 случаях - в пределах нормы (до 103 КОЕ/мл), в 128 - от 103 до 105 КОЕ/мл, в 57 -свыше 105 КОЕ/мл.
При анализе вагинального содержимого было обнаружено, что в отсутствии энтерококков в 52% случаев количество Candida spp. было в норме (до 104 КОЕ/мл), а в 48% случаев - превышало нормальные значения (из них в 7% образцах число кандид было выше 106 КОЕ/мл) (рис. 1).
При наличии в вагинальном содержимом энтерококков в концентрации до 103 КОЕ/мл (нормальное содержание энтерококков) у 79% женщин кандиды отсутствовали, у 13% число микромицетов не превышало 104 КОЕ/мл, что соответствовало норме, и только в 8% случаев кандиды превышали норму (свыше 104 и до 106 КОЕ/мл) (рис. 2).
При превышении энтерококками уровня 103 КОЕ/мл было отмечено, что у 89% женщин кандиды отсутствовали (данный процент несколько выше, чем при нормальной концентрации энтерококков в том же биотопе), у 6% пациенток концентрация кандид не превышала норму и лишь в 5% случаев число кандид было выше нормы (рис. 3).
Был проведен корреляционный анализ полученных данных для выборок с распределением, отличным от нормального, методом Спирмена. Коэффициент корреляции по Спирмену (r) составил -0,66 (p=0,03), что говорит об обратной зависимости и средней силе корреляционной связи между популяциями энтерококков и кандид. Обратная взаимосвязь между микроорганизмами хорошо прослеживается на графике, показывающем количество кандид в зависимости от титра энтерококков в вагинальном
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
содержимом (рис. 4). Видно, что при повышении титра энтерококков в вагинальной полости количество кандид стремится к нулю.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о выраженных антагонистических взаимоотношениях между энтерококками и кандидами во влагалище у женщин детородного возраста, что проявляется в подавлении кандид на фоне нормальной или повышенной концентрации Enterococcus spp. в данном биотопе.
Для выяснения механизмов антагонистических взаимоотношений между энтерококками и кандидами были проведены эксперименты in vitro. Мы предположили, что данный феномен может быть связан с фунгицидным эффектом продуктов метаболизма энтерококков. Для этого был проведен ряд экспериментов, где суспензию кандид инкубировали с метаболитами энтерококков в течение 1-2-24 часов. Было выявлено, что метаболиты E. faecalis 671 негативно влияют на жизнеспособность кандид разных видов. Во всех экспериментах наблюдали некоторое снижение количества колоний кандид после инкубации с метаболитами энтерококков в диапазоне от 1,22 до 1,5 раз (р>0,05) (таблица). Наиболее стабильный фунгицидный эффект наблюдался после двух часов инкубации кандид с метаболитами энтерококка. При этом нужно отметить, что после контакта с метаболитами энтерококков кандиды всегда формировали колонии, меньшие по размеру по сравнению с контролем.
В следующих экспериментах исследовали влияние продуктов метаболизма E. faecalis 671 и E. faecium 651 на процесс взаимодействия кандид с эпителиальными клетками in vitro (искусственная колонизация кандид). Было выявлено достоверное снижение адгезии C. albicans на вагинальных эпителиоцитах под действием метаболитов энтерококков E. faecalis 671 и E. faecium 651 в 1,34 (p=0,036) и 1,29 раза (p=0,041) соответственно (рис. 5).
Таким образом, антифунгальный эффект энтерококков в отношении кандид в большей степени обусловлен подавлением адгезии кандид на вагинальном эпителии, что может приводить к ускоренной элиминации Candida spp. из вагинальной полости.
Выводы
1. Существуют антагонистические взаимоотношения между энтерококками и кандидами в вагинальном содержимом у женщин детородного возраста.
2. Установлена обратная зависимость со средней силой корреляционной связи между вагинальными популяциями энтерококков и кандид.
3. Метаболиты энтерококков оказывают выраженный антиадгезивный эффект в экспериментальной тест-системе «кандиды - вагинальные эпителиоциты» и слабый фунгицидный эффект. та
ЛИТЕРАТУРА
1. Буданов П.В., Стрижакова M.A. Новое в терапии нарушений микроценоза влагалища. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2006. Т. 5. № 1. С. 104-108.
Budanov P.V., Strizhakova M.A. Novoe v terapii narushenij mikrocenoza vlagalishha. Voprosy ginekologii, akusherstva i perinatologii. 2006. Т. 5. № 1. S. 104-108.
2. Попова А.Л., Дворянских С.А., Яговкина Н.В. Современные аспекты лече-нияи профилактики вульвовагинального кандидоза (обзор литературы). Вятский медицинский вестник. 2013. № 4. С. 31-36.
Popova A.L., Dvorjanskih S.A., Jagovkina N.V. Sovremennye aspekty lechenijai profilaktiki vul'vovaginal'nogo kandidoza (obzor literatury). Vjatskij medicinskij vestnik. 2013. № 4. S. 31-36.
3. Сергеев А.Ю., Иванов О.Л., Караулов А.В., Маликов В.Е., Сергеев Ю.В., Жарикова Н.Е. Вагинальный кандидоз: этиология, эпидемиология, патогенез. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2000. № 2. С. 99-106.
Sergeev A.Ju, Ivanov O.L., Karaulov A.V., Malikov V.E., Sergeev Ju.V., Zharikova N.E. Vaginal'nyj kandidoz: jetiologija, jepidemiologija, patogenez. Immunopatologija, allergologija, infektologija. 2000. № 2. S. 99-106.
4. Занько С.Н. Вагинальный кандидоз. Охрана материнства и детства. 2006. № 1-7. С. 64-71.
Zan'ko S.N. Vaginal'nyj kandidoz. Ohrana materinstva i detstva. 2006. № 1-7. S. 64 -71.
5. Бондаренко К.Р., Озолиня Л.А., Бондаренко В.М., Шпирко В.О. Особенности влагалищной микроэкосистемы в период гестации (обзор литературы). Вестник РГМУ. 2014. № 4. С. 6-11.
Bondarenko K.R., Ozolinja L.A., Bondarenko V.M., Shpirko V. O. Osobennosti vlagalishhnoj mikrojekosistemy v period gestacii (obzor literatury). Vestnik RGMU. 2014. № 4. S. 6-11.
6. Цизина Е. А., Ильина Н. А. Нормоценоз влагалища и его влияние на здоровье женщин. Молодой ученый. 2011. № 8. Т. 2. С. 152-156.
Cizina E. A., Il'ina N. A. Normocenoz vlagalishha i ego vlijanie na zdorov'e zhenshhin. Molodoj uchenyj. 2011. № 8. Т. 2. S.152-156.
