CC BY
36
УДК 611.671-018.7-078
ВЛИЯНИЕ ГУМОРАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ И ВАГИНАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ НА АДГЕЗИЮ CANDIDA ALBICANS К ВАГИНАЛЬНЫМ ЭПИТЕЛИОЦИТАМ
М. А. Свиридов, И.И. Долгушин, П.В. Подлубная*
ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»; *МУЗ ГКБ N94, Челябинск
Вагинальная жидкость обладает антиадгезивным эффектом в системе «С. albicans - вагинальные эпителиоциты» за счет муцина. Антитела, находящиеся в вагинальной жидкости и сыворотке крови, не вносят существенного вклада во взаимоотношения кандид и вагинальных эпителиоцитов.
Ключевые слова: вагинальная жидкость, сыворотка крови, муцин, адгезия, С. albicans.
Актуальность. По данным ВОЗ, пятая часть населения Земли страдает различными грибковыми заболеваниями [6]. Кандидоз - самый распространенный из системных микозов человека, так как свыше 40 % взрослых людей являются носителями Candida albicans и любое серьезное нарушение местного или общего иммунитета может спровоцировать их активацию [1, 2]. При кандидозе поражается организм человека, ослабленный воздействием различных неблагоприятных факторов, изменяющейся экологией окружающей среды, широким использованием химических средств в быту и на производстве, применением медикаментозных препаратов, особенно антибиотиков, кортикостероидов, цитостатиков, иммунодепрессантов и других [5].
Отмечаемый во всем мире рост заболеваемости кандидозами связан прежде всего с тем, что эта инфекция является оппортунистической и носит преимущественно эндогенный характер [14]. Среди оппортунистических инфекций кандидоз-ные вульвовагиниты являются наиболее часто встречающимися заболеваниями во всем мире, занимая второе место после бактериального ваги-ноза и всех инфекций влагалища [17], являясь одной из основных причин обращения женщин репродуктивного возраста за медицинской помощью [10]. Распространенность этой патологии неуклонно растет как в России, так и в других странах [12].
Особенностью кандидозной инфекции является длительное течение, частое рецидивирование, возможность распространения на другие органы и системы с развитием генерализованных форм, высокая резистентность возбудителей к антимикоти-ческим препаратам, трудность лечения беременных и новорожденных [8]. Вот почему урогенитальный кандидоз является актуальной общеклинической проблемой и имеет социальное значение, так как снижает качество жизни женщины, вызыва-
ет аллергизацию, может привести к осложнениям беременности и патологии у новорожденных, способствует возникновению иммунодефицитных состояний, развитию неопластических процессов [11].
Слизистая влагалища формирует физический и экологический барьер, который препятствует проникновению патологических агентов внутрь организма. Влагалищная жидкость, формируя вязкий слой, связывает патогены и способствует их удалению. Постоянный ее ток сверху вниз также ведет к элиминации заносимых из внешней среды микроорганизмов. Кроме того, находящиеся в вагинальной жидкости здоровых женщин микроорганизмы, играют важную роль в поддержании здоровья во все периоды ее жизни. Они обеспечивают колонизационную резистентность половых путей, тесно взаимодействуя между собой и клетками вагинального эпителия. Колонизационная резистентность включает комплекс специфических факторов местного иммунитета, к которым принадлежат ингибиторы микробной адгезии, биоцидные и биостатические вещества секретов, нормальная микрофлора, антитела. Дрожжевые грибы рода Candida могут присутствовать во влагалище здоровых женщин, особенно сексуально активных [7]. Наиболее часто обнаруживаемым видом является С. albicans.
Известно, что биологические жидкости и секреты, а также их отдельные компоненты играют большую роль в системе естественной резистентности макроорганизма. Значение иммуноглобулинов велико, поскольку они участвуют в формировании неспецифического иммунитета влагалища и обеспечивают защиту от болезнетворных микроорганизмов.
Противокандидозные антитела в вагинальном содержимом имеют двоякое происхождение: синтезируются локально и поступают из крови [3, 13], поэтому мы решили изучить влияние гуморальных
Проблемы здравоохранения
факторов сыворотки крови и вагинальной жидкости на адгезию С. albicans к вагинальным эпите-лиоцитам. Кроме того, несмотря на многочисленные исследования роли местного иммунитета в антикандидозной защите, механизмы действия гуморальных компонентов мукозального иммунитета на адгезию кандид изучены недостаточно.
Методы исследования. Для решения поставленных задач нами обследованы 51 практически здоровая женщина в возрасте от 18 до 26 лет в первой фазе менструального цикла. Для оценки адгезивной активности грибов рода Candida у всех женщин проводили забор вагинального эпителия, вагинального отделяемого из заднего свода влагалища. Для определения влияния сыворотки на адгезию С. albicans к эпителию здоровых женщин использовали взятую у них венозную кровь.
Получение вагинальных эпителиоцитов. Вагинальный эпителий забирали с боковых стенок влагалища стерильной ложкой Фолькмана и помещали в пробирку с 5 мл раствора Хенкса без фенолового красного, дважды отмывали забуфе-ренным физиологическим раствором (ЗФР, pH 7,2-7,4) (1500 об/мин, в течение 5 мин) и готовили взвесь с концентрацией 106 кл/мл (подсчёт клеток осуществляли в камере Горяева).
Получение культуры С. albicans. Во всех экспериментах использовали суточную культуру штамма С. albicans 601, которую получали в дрожжевой фазе при культивировании на агаре Сабуро (ФГУП «НПО «МИКРОГЕН» М3 РФ, г. Махачкала) в течение 24 часов при температуре +37 °С. Посевы смывали забуференным физиологическим раствором, трижды отмывали десятикратным объемом, удаляли клеточные агрегаты центрифугированием (1500 об/мин, 2 мин), ресуспендировали в ЗФР и доводили до необходимой концентрации в зависимости от методики исследования 107-109 кл/мл методом спектрофотометрии при \= 540 нм.
Получение вагинальной жидкости. Забор вагинальной жидкости осуществляли с помощью специальной стерильной градуированной пипетки из заднего свода влагалища у практически здоровых женщин, вагинальный эпителий которых использовали в опытах. 0,2 мл вагинальной жидкости помещали в 1,8 мл стерильного физиологического раствора натрия хлорида. Материал доставляли в лабораторию в течение 2-х часов с момента взятия. Пробирку с исследуемым материалом центрифугировали в течение 2-3 минут с целью осаждения клеточных элементов при 1000 об/мин. На-досадочную жидкость использовали в дальнейшей работе.
Получение сыворотки крови. Для получения сыворотки крови использовали 15,0 мл периферической венозной не гепаринизированной крови, которую отстаивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Надосадочную жидкость аккуратно собирали, переносили в стерильные центрифужные пробирки, освобождали от оставшихся
клеток крови путем центрифугирования в течение 30 минут при 3000 оборотах в минуту. Затем сыворотку от 5-7 доноров смешивали и использовали.
Определение параметров адгезии С. albicans на вагинальных эпителиоцитах. В своей работе мы взяли за основу методику Т.В. Махровой (2004), которая изучала адгезивные свойства С. albicans на поверхности буккального эпителия, и дополнили ее.
Равные объемы (по 0,5 мл) взвеси вагинальных эпителиоцитов в концентрации 10б кл/мл и кандид в концентрации 107 кл/мл инкубировали в течение 30 мин при температуре +37 °С в растворе Хенкса без фенолового красного, встряхивая каждые 5 мин. После инкубации эпителиоциты отмывали десятикратным объёмом ЗФР от неприкре-пившихся кандид (1500 об/мин, в течение 5 мин). Из осадка клеток готовили мазки, которые высушивали, фиксировали 96 % этиловым спиртом, окрашивали спиртовым раствором кристаллического фиолетового и исследовали с помощью световой микроскопии (увеличение 630).
Адгезию оценивали по трём показателям:
1. Активность адгезии (АА) - количество вагинальных эпителиоцитов с адгезированными кан-дидами из 100 посчитанных эпителиоцитов, %.
2. Интенсивность адгезии (ИА) - количество кандид, адгезированных на 100 вагинальных эпителиоцитах, уел. ед.
3. Адгезивное число (АЧ) - количество адгезированных кандид на одной эпителиальной клетке, уел. ед.
Определение влияния вагинальной жидкости или сыворотки крови на адгезию С. albicans на вагинальном эпителии. К осадку С. albicans 601 (1 х 107 клеток/мл) добавляли 0,5 мл вагинальной жидкости или сыворотки крови и инкубировали 30 мин при +37 °С, встряхивая каждые 5 мин. В контроле использовали ЗФР. После инкубации отмывали эпителий от неприкрепившихся кандид десятикратным объемом ЗФР. Затем использовали для изучения адгезивных реакций с вагинальными клетками
Для удаления антител вагинальную жидкость или сыворотку крови истощали микробной взвесью 109 клеток С. albicans на 0,5 мл вагинальной жидкости или сыворотки крови в течение 30 мин, встряхивая каждые 5 мин, при +4 °С для исключения возможного участия комплемента. После центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут, надосадочную жидкость забирали и использовали в опытах.
Изучение влияния на адгезию кандид к вагинальному эпителию истощенной вагинальной жидкости или сыворотки крови осуществляли путем применения методики, аналогичной использованию интактной вагинальной жидкости или сыворотки крови.
Определение влияния муцина на адгезию С. albicans на вагинальном эпителии. Осадок
Свиридов М.А., Долгушин И.И., Подлубная Л.В. Влияние гуморальных факторов сыворотки
___________________________________________________крови и вагинальной жидкости на адгезию...
кандид (1x107 клеток/мл) смешивали с 0,5 мл муцина (Type I-S, «Sigma», США 1мг/мл) и инкубировали 30 мин при +37 °С. Оценку влияния муцина на адгезию С. albicans проводили аналогично экспериментам с вагинальной жидкостью.
Результаты исследования. Проведённые эксперименты показали, что при обработке кандид цельной сывороткой крови происходило ослабление адгезии С. albicans на вагинальных клетках (р < 0,05), причем снижались все адгезивные характеристики. Данные о количестве адгезирован-ных кандид на одной эпителиальной клетке представлены в таблице. Данное свойство сыворотки крови могло быть обусловлено различными факторами, в том числе, антиадгезивной активностью могли обладать антитела, содержащиеся в сыворотке. Для определения вклада антител в общий антиадгезивный эффект, сыворотку крови истощали микробной взвесью С. albicans. После обработки кандид истощённой сывороткой крови получили такой же эффект, как и при воздействии на них цельной сывороткой - достоверно снижались все показатели адгезии (см. таблицу).
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что антитела сыворотки крови здоровых женщин, вероятно, являются только одним из факторов, влияющим на адгезию кандид. Возможно, основная антиадгезивная роль сыворотки крови принадлежит другим гуморальным факторам.
Учитывая представительство С. albicans в нор-мофлоре, антигены клеточной стенки этих грибов -маннаны и маннанопротеины [15], а также белковые антигены, представленные, прежде всего, протеинами теплового шока, протеиназы и другие литические ферменты, вырабатываемые С. albicans [16], должны индуцировать образование антител у здоровых людей, которые могли бы принимать участие в антиадгезивных реакциях, в частности с вагинальными эпителиоцитами. Кроме того, известно, что
противокандидозные антитела поступают во влагалище из крови и частично синтезируются в слизистой влагалища, поэтому необходимо было изучить влияние компонентов содержимого влагалища на процесс адгезии С. albicans на поверхности вагинальных эпителиоцитов и выяснить роль антител в формировании иммунитета влагалища.
С этой целью кандиды обрабатывали цельной вагинальной жидкостью и вагинальной жидкостью, истощённой микробной взвесью С. albicans. Во всех опытах при воздействии на С. albicans цельной или истощённой вагинальной жидкостью происходило однонаправленное достоверное снижение адгезивных показателей грибов, что отражено в таблице.
Полученные нами результаты указывают на то, что антитела, находящиеся в вагинальной жидкости, не вносят существенного вклада во взаимоотношения кандид и вагинальных эпителиоцитов. Поскольку влагалищная жидкость представляет собой многокомпонентную систему, поэтому мы предположили, что таким свойством могут обладать ее другие компоненты, в частности, муцин, поэтому изучили роль муцина в адгезии грибов С. albicans на поверхности вагинальных эпителиоцитов, проведя серию опытов с бычьим муцином (см. таблицу).
Преинкубация С. albicans с муцином вызывала такой же эффект, как и цельная вагинальная жидкость - достоверное снижение всех показателей адгезии. После предварительной обработки вагинальных эпителиоцитов муцином адгезивные свойства С. albicans не менялись. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что содержимое влагалищной жидкости способно блокировать только адгезивные молекулы кандид, не влияя на вагинальный эпителий, который уже контактировал с вагинальной жидкостью.
Таким образом, на основании полученных нами данных можно утверждать, что вагинальная
Влияние гуморальных факторов на адгезивную способность С. albicans к вагинальным эпителиоцитам, (М ± т)
Показатель
Группы Адгезивное число, уел. ед.
Без воздействия (контроль) Предварительно обработанные С. albicans
Сыворотка крови п= 13 2,42 ±0,11 1,78 ±0,11* Р < 0,003
Истощенная сыворотка крови п = 13 2,41 ± 0,10 1,76 ±0,10* Р < 0,001
Вагинальная жидкость п= 18 2,39 ±0,11 2,04 ±0,05* Р < 0,05
Истощенная вагинальная жидкость п = 13 2,54 ±0,14 2,03 ±0,06* Р < 0,003
Муцин п = 20 2,40 ±0,11 2,07 ± 0,06* Р < 0,02
Примечание: * - достоверность отличий показателей адгезии С. albicans от контроля; п - количество проб вагинального эпителия.
Проблемы здравоохранения
жидкость, обладая антиадгезивным эффектом в системе «С. albicans - вагинальные эпителиоци-ты», препятствует прикреплению и активному размножению С. albicans на слизистой влагалища здоровых женщин репродуктивного возраста, причем часть антиадгезивного потенциала вагинальной жидкости, возможно, принадлежит муцину. Известно, что он является гликопротеином клеточной стенки эпителиальных клеток и препятствует прикреплению микроорганизмов к слизистой оболочке [7]. Кроме того, по данным литературы, антиадгезивная функция биологических жидкостей связана с тем, что растворенные в них макромолекулы физиологически активных веществ взаимодействуют с лигандами микроорганизмов, меняют свойства поверхностных структур микробных клеток и создают стерические препятствия для связывания с рецепторами клеток-мишеней [4], поэтому, входя в состав вагинальной жидкости и используя данный механизм, муцин, может обладать антиадгезивным действием.
Выводы
1. Вагинальная жидкость обладает антиадгезивным эффектом в системе «С. albicans - вагинальные эпителиоциты» за счет муцина.
2. Антитела, находящиеся в вагинальной жидкости и сыворотке крови, не вносят существенного вклада во взаимоотношения кандид и вагинальных эпителиоцитов.
Литература
1. Арзуманян, В.Г. Чувствительность дрожжей рода Candida, выделенных от больных аллергическими заболеваниями, к противогрибковым препаратам / В.Г. Арзуманян, Б.Ф. Семенов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - Т. 131. -№ 4.- С. 411-414.
2. Колонизация влагалища дрожжеподобными грибами, распространенность вагинита и ассоциированный местный иммунитет у подростков / М.М. Баруссе, Б.Дж. Ван Дер Пол, Д. Фортенберри и др. // Инфекции передаваемые половым путём. - 2004. -Ms 1.- С. 35-41.
3. Долгушина, В.Ф. Местный иммунитет половой системы у беременных с генитальной инфекцией /В.Ф. Долгушина, И.И. Долгушин, Л.Ф. Теле-шева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2000. —№ 2. - С. 92-95.
4. Еропкина, Е.М. Антиадгезивная активность белковых комплексов биологических жидкостей и секретов / Е.М. Еропкина, Г.Е. Афиногенов//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1994. -Кв 2.- С. 110-114.
5. Кантин, О.М. Принципы лечения вульвовагинального кандидоза во время беременности и
профилактики инфицирования кандидами новорожденных / О.М. Кантин, И.М. Корсунская, Н.И. Сюч// Акушерство и гинекология. - 2007. -Ms 5.- С. 93-95.
6. Роль бактерий и вирусов в патогенезе фоновых и диспластических процессов слизистой оболочки шейки матки и влагалища / В.И. Киста, О.Е. Михалко, М.А. Мирзабекова и др. // Вестник дерматологии и венерологии. - 2001. - Ms 2. -С. 40-45.
7. Поверхностный кандидоз в практике врача-дермато-венеролога / С.Г. Лыкова О. Б. Немчани-нова, О.С. Петренко и др. //Вестник дерматологии и венерологии. - 2005. -Ms 6.- С. 26-32.
8. Масюкова, С.А. Глубокий кандидоз - актуальность и перспективы проблемы / С.А. Масюкова, М.В. Устинов, И.В. Ильина // Русский медицинский журнал. - 2004. - Т. 12. -М4.-С. 189-195.
9. Махрова Т.В. Факторы и условия, влияющие на адгезивную активность Candida albicans в системах с буккальными эпителиоцитами: авто-реф. дис. ... канд. мед. наук/Т.В. Махрова. - Челябинск, 2004. - 24 с.
10. Прилепская, В.П. Вульвовагинальный кандидоз в практике акушера-гинеколога / В. Н. Прилепская, Г.Р. Байрамова // Гинекология. — 2004. -Т. 6.-Ив2.-С. 59-60.
11. Самсыгина, Г.А. Кандидоз новорожденных и детей первого года жизни: пособие для практических врачей / Г.А. Самсыгина, Г.Н. Буслаева. -М.: Печатный город, 2004. - 64 с.
12. Сергеев, Ю.В. Фармакотерапия микозов / Ю.В. Сергеев, Б.И. Шпигель, А.Ю. Сергеев. - М.: Медицина для всех, 2003. - 200 с.
13. Сергеев, А.Ю. Факторы резистентности и иммунитет при грибковых инфекциях кожи и слизистых оболочек / А.Ю. Сергеев, Ю.В. Сергеев // Иммунопатология, аллергология, инфектология. -2004. - Ms 1,-С. 6-14.
14. Oral Candida: clearance, colo-nization, or candidiasis? / KD. Cannon, A.R. Holmes, A.B. Mason et al. // J. Dent. Res. - 1995. - Vol.74. - Ms 5. -P. 1152-1161.
15. Identification of wall-specific antigens synthesized during germ tubeformation by Candida albicans / M. Casanova, M.L. Gil, L. Caldenoso et al. // Infect, lmmun. - 1989. - Vol. 57. -P. 262-271.
16. Protective role of antimannan and anti-aspartyl proteinase antibodies in an experimental model of Candida albicans vaginitis in rats / F. De Ber-nardis, M. Boccanera, D. Adriani et al. // Infect. Im-mun. - 1997. - Vol. 65. -Ms 8. -P. 3399-3405.
17. Hiller, S.L. Vaginal microflora in postmenopausal women who have not received estrogen replacement therapy / S.L. Hiller, R.J. Lau // Clin. Infect. Dis. - 1997. - Vol. 25. -Ms2.-P. 123-126.
