CC BY
153
С.Н. Морозкина1, Д.Б. Ушаков1, Н.Д. Ещенко1, С. Линдер2, А.Г. Шавва1
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 8а-АНАЛОГОВ СТЕРОИДНЫХ ЭСТРОГЕНОВ, СОДЕРЖАЩИХ ФТОР В ПОЛОЖЕНИИ 2
1 Санкт-Петербургский государственный университет, химический факультет 2Онкологический центр Каролинска, Каролинский госпиталь, Стокгольм, Швеция,
e-mail [email protected], тел./факс: (812) 428-6809
Тамоксифен, специфический модулятор ядерных рецепторов эстрогенов, широко используется для лечения гормонзависимого рака молочной железы. Однако при длительном применении клетки опухоли становятся гормонрезистентными, хотя рецепторы эстрогенов в опухоли могут сохраняться. Резистентность опухоли к тамоксифену связана с изменением внутриклеточных сигнальных путей. Недавно обнаружили, что последующая терапия эстрадиолом возвращает клеткам чувствительность к тамоксифену. Представлялось важным найти аналоги эстрогенов с пониженной гормональной активностью, сохранившими способность индуцировать апоптоз, тем более, что клетки опухоли можно сенсибилизировать к действию эстрогенов.
Стероиды I и II, обладают пониженной эстрогенной активностью по сравнению с 17а-этинилэстрадиолом (ЕЕ), сохраняя остеопротекторное и гипохолестеринемическое действие (Таблица).
Группа подопытных крыс Sprague Dawley Изменение веса тела за время опыта, г Вес матки, мг/100 г веса тела Вес золы от бедренной кости / «влажный» вес бедренной кости Плотность минеральных компонентов, г/см2 Содержание холестерина в сыворотке крови, мг / дл
Ложнооперированные 31±4* 147±9* 0,442±0,007* 0,247±0,004* 63,7±1,8
Овариэктомированные 68±5 32±2 0,403±0,005 0,220±0,003 92,4±3,2
Овариэктомированные, получавшие ЕЕ 27±4 149±8* 0,437±0,004* 0,241±0,008* 43,0±1,8*
Овариэктомированные, получавшие стероид I 19±4* 110±5* 0,447±0,005* 0,242±0,005* 36,0±3,2*
Овариэктомированные, получавшие стероид II 16±3* 109±7* 0,449±0,005* 0,252±0,007* 29,7±2,6*
На основе этих соединений был получен индуктор апоптоза опухолевых клеток, не содержащих рецепторов эстрогенов.
1 12 С.Н. Морозкина , О.И. Антимонова , А.Г. Шавва
НЕКОТОРЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА УРСОЛОВОЙ И БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТ
1 Санкт-Петербургский государственный университет, химический факультет 2Онкологический центр Каролинска, Каролинский госпиталь, Стокгольм, Швеция
Показано, что введение овариэктомированным крысам линии Sprague-Dawley урсоловой или бетулино-вой кислот не приводит к снижению содержания минеральных компонентов в бедренной кости.
Таблица
Результаты исследования некоторых биологических свойств урсоловой (I) и бетулиновой кислот (II)
Группа подопытных крыс Изменение веса тела за время опыта, г Утеротропная активность Вес золы от бедренной кости / «Влажный» вес бедренной кости Содержание холестерина в сыворотке крови, мг/100 мл
Вес матки, мг /100 г веса тела Содержание рецепторов прогестерона, фмоль/мг белка
Ложнооперирован- ные 30,6±2,7* 156,7±8,9** 62±5** 0,440±0,006* 58,7±1,8*
Овариэктомирован- ные 65,5±4,2 34,5±2,6 18±2 0,396±0,005 70,7±1,9
Овариэктомированные, получавшие ЕЕ, 9,0±4,1* 156,2±7,4** 102±11** 0,448±0,005* 27,2±1,5**
Овариэктомирован-ные, получавшие урсоловую кислоту 62,5±4,1 32,4±3,5 20±2 0,407±0,005 46,3±2,2*
Овариэктомирован-ные, получавшие бе-тулиновую кислоту 64,1±5,3 29,8±2,5 22±3 0,3 85±0,008 49,4±3,1*
* 1-критерий Стьюдента р<0,05; ** - р<0,01.
Создание новых лекарственных препаратов для лечения онкологических гормонозависимых заболеваний, таких как рак молочной железы, рак эндометрия у женщин и рак предстательной железы у мужчин, продолжает оставаться актуальной задачей. Для её решения в настоящее время чаще всего используются антигормональные препараты и ингибиторы ферментов, ответственные за образование соответствующих гормонов [1,2].
Известно, что урсоловая (I) [3] и бетулиновая (II) [4,5] кислоты являются ингибиторами процессов ангиогенеза и могут усиливать апоптоз в клетках различных опухолей [6-10]. Кроме того, урсоловая кислота ингибирует образование ароматазы [11]. Это открывает перспективы применения указанных три-терпеноидов для лечения онкологических заболеваний, особенно в комбинации с известными противоопухолевыми препаратами. С другой стороны, бету-
линовая кислота проявляет противовоспалительную активность, частично опосредованную рецепторами глюкокортикоидов [12]. При длительном применении это может привести к увеличению риска возникновения остеопороза - основного побочного эффекта глю-кокортикоидов [13].
И хотя нет серьезных экспериментальных доказательств влияния урсоловой кислоты на указанные рецепторы, представлялось важным исследовать действие тритерпеноидов (I) и (II) на содержание минеральных компонентов в кости.
Урсоловую кислоту выделяли из толокнянки, бе-тулиновую кислоту синтезировали из бетулина комбинацией известных методик. В опытах использовали тритерпеноиды со степенью чистоты не менее 98%, идентификацию модельных соединений проводили с применением масс-спектрометрии, спектроскопии ЯМР 1Н и 13С.
Влияние тритерпеноидов на минеральные компоненты кости изучали в опытах на овариэктомирован-ных крысах по методу Kalu [14], модифицированному на кафедре химии природных соединений СПбГУ [15]. Положительным контролем служил 17а-этинилэстрадиол (ЕЕ) в дозе 0,1 мг/кг веса тела в сутки. Тритерпеноиды вводили per os в виде суспензии в оливковом масле в дозе 20 мг/кг веса тела в сутки в течение 35 суток.
Из результатов исследований, представленных в таблице, можно заключить, что урсоловая (I) и бету-линовая (II) кислоты не оказывают в условиях эксперимента негативного влияния на содержание минеральных компонентов в бедренной кости подопытных животных и не проявляют утеротропного действия. В то же время они нормализуют содержание холестерина в сыворотке крови. Под действием этих кислот,
в отличие от 17а-этинилэстрадиола [15,16] происходит снижение триглицеридов в сыворотке крови (эти данные в таблице не представлены), что является дополнительным преимуществом урсоловой (I) и бе-тулиновой (II) кислот, поскольку гипертриглицери-демическая активность рассматривается как независимый фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний [17]. Полученные результаты о влиянии урсоло-вой кислоты (I) на липидный обмен подтверждают имеющиеся в литературе данные [18,19].
Недавно в опытах на мышах было показано, три-терпеноид милиацин снизил лимфотоксический эффект метотрексата, используемого в клинической онкологии [20]. Представленные нами данные также указывают на перспективность исследования противоопухолевого действия урсоловой (I) и бетулиновой (II) кислот, в первую очередь, при комбинированном действии этих кислот и уже применяющихся в клинике антигормональных и других препаратов.
Экспериментальная часть
Полноту протекания реакций проверяли методом ТСХ на пластинах Silufol в системах растворителей петролейный эфир - этилацетат, (4:1), (3:1). Детекти-
рование веществ проводили адсорбцией паров йода, в УФ-свете или под действием фосфомолибденовой кислоты. Для очистки веществ колоночной хроматографией использовали силикагель (0,040 - 0,063 мм) фирмы Мегск.
Масс-спектры снимали на приборе МХ-1321 при температуре в ионизационной камере 200-210°С и энергии ионизирующего излучения 70 eV.
Спектры 1Н-ЯМР и 13С-ЯМР регистрировали при 295К на спектрометре Вгикег DPX-300 соответственно на частотах 300.130 и 75.468 МГц при 295К. Спектры урсоловой и бетулиновой кислот сняты в DMSO-d6, остальных соединений в CDQ3. Для спектров 1Н-ЯМР использовали растворы 5-7 мг вещества в 0.6 мл растворителя, а для 13С-ЯМР - 30-50 мг в том же объеме. Химические сдвиги измерены по отношению к тетра-метилсилану.
Температуры плавления веществ определяли на нагревательном столике ВоеНш.
Урсоловая кислота (I). 1кг сухих измельчённых листьев толокнянки трижды экстрагировали 3л этилового спирта в течение 2 суток, экстракты объединяли, спирт удаляли под вакуумом. К остатку добавляли 500 мл петролейного эфира (т. кип. 40-70 С), смесь перемешивали при комнатной температуре 1 ч, после чего растворитель удаляли декантацией. Экстракцию окрашенных примесей петролейным эфиром повторяли ещё раз. Оставшуюся массу растворяли в 800 мл ди-этилового эфира, добавляли 500 мл 3%-ного раствора едкого натра в воде. Темно-коричневый осадок, находящийся на границе раздела фаз, отфильтровывали, промывали водой и растворяли в 600 мл этанола. К полученному раствору добавляли, при сильном перемешивании, 10%-ный раствор соляной кислоты до рН
1. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре водой до нейтральной реакции промывных вод, а затем сушили на воздухе. После кристаллизации осадка из смеси хлороформ-этанол получали 0,91,1 г урсоловой кислоты (I), т. пл. 283-284оС. По лит. данным т.пл. 283-283.5оС [21]. Соединение (I) плавилось без депрессии температуры плавления в пробе смешения с заведомо известным веществом [21].
Спектр 13С-ЯМР (5, м. д.): 39.2 (С1), 27.8 (С2), 77.7 (С3), 39.1 (С4), 55.6 (С5), 18.8 (С6), 33.5 (С-7), 40.0 (С8), 47.9 (С9), 37.4 (С10), 23.6 (С11), 125.4 (С12), 139.0 (С13), 42.5 (С14), 28.3 (С15), 24.6 (С16), 47.7 (С 17), 53.2 (С 18), 39.5 (С-19), 39.3 (С20), 30.9 (С21), 37.3 (С22), 29.1 (С23), 16.1 (С24), 16.9 (С25), 17.8 (С26), 24.1 (С27), 179.1 (С28), 17.9 (С29), 24.1 (С30) (отнесение сигналов в соотвествии с работой [21]).
Масс-спектр, (1,%): 456 (2, М+), 441 (1), 438 (1), 300 (2), 248 (100), 207 (29), 203 (34), 133 (31).
Найдено, %: С 78.68; Н 10.64. С30Н48О3. Вычислено, %: С 78.90; Н 10.59.
Бетулиновая кислота (II). 5 г известного 3-моноацетата бетулина (III) [23] окисляли хромовым ангидридом в условиях, предложенных для синтеза бетулоновой кислоты [24]. После обычной обработки получали 2,4-2,6 г ацетата бетулиновой кислоты (IV) с
т.пл. 287-290° С. По лит. данным, т.пл. 288-290° С [22].
2 г полученного соединения гидролизовали в соответствии с методикой работы [22]. Выход бетулиновой кислоты (II) после кристаллизации из метанола составлял 1,5-1,6 г, т.пл. 293-295о С. По лит. данным, т.пл. 295-298оС [23], 300-302оС [24]. Спектр ЯМР 1Н соединения (II) соответствовал данным литературы [24].
Найдено, %: С 78.85; Н 10.69. С30Н48О3. Вычислено, %: С 78.90; Н 10.59.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гершанович М.Л., Филов В.А., Акимов М.А., Акимов А.А. Введение в фармакологию злокачественных опухолей. 1999, С-Петербург, «СОТИС».
2. Chetrite G.S., Pasqualini J.R. J. SteroidBiochem. Mol. Biol., 2001, 76, 95.
3. Cadrenas C., Quesada A.R., Medina M.A. Biochem. Biophys. Res. Communs., 2004, 320, 402.
4. Pat. USA 6.228.850 (cl. 514-169; A61K31/15). -Chem. Abstr. 2001, 134. P336213b.
5. Mukherjee R., Jaggi M., Rajendran, Srivastava S.K., Siddiqui M.J.A., Vardhan A., Burman A.C. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 3169.
6. Kim D.K., Baek J.H., Kang C.M., Yoo M.A., Sung J.W., Chung H.Y., Kim N.D., Choi Y.H., Lee S.H., Kim K.W. Int. J. Cancer. 2000, 87, 629.
7. Harmand P.O., Duval R., Liagre B., Jayat-Vignoles C., Beneytout J.L., Delage C., Simon A. Int. J. Oncology. 2003, 23, 105.
8. Pisha E., Chai H., Lee I.S., Chagwedera T.E., Farnsworth N.R., Cordell G.A., Beecher C.W., Fong H.H., Kinghorn A.D., Brown D.M., Wani M.C., Wall M.E., Hieken T.J., Gupta T.D., Pezzuto J.M. Nat. Med. 1995, 1, 1046.
9. Cichewitz R.H., Kouzi A.A. Med. Res. Rev. 2004, 24, 90.
10. Wick W., Grimmel C., Wagenknecht B.,
Dichgans J., Weller M. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999, 289, 1306.
11. Jeong H.-J., Chang L.C., Kim Ho-K., Kinghorn
A.D., Pezzuto J.M. Medicinal Chemistry and Natural Products. 2000, 23, 243.
12. Recio R.C., Giner R.M., Manez S., Rios J.L. Planta Med. 1995, 61, 182.
13. Насонов Е.Л., Скрипникова H.A., Насонова
B.А. Проблема остеопороза в ревматологии. М., Стин, 1997. 429 с.
14. Kalu D.N. Bone Miner, 1991, 15, 175.
15. Белов В.Н., Дудкин В.Ю., Урусова Е.А., Ста-рова Г.Л., Селиванов С.Н., Николаев С.В., Ещенко Н.Д., Морозкина С.Н., Шавва А.Г. Биоорган. химия. 2007, 33, 315.
16. Шавва А.Г., Морозкина С.Н., Нщенко Н.В., Елисеев H.H., Селиванов С.Н., Абусалимов Ш.Н., Селиванов С.С., Каменева Н.Ю., Ещенко Н.Д. Биоорг. хим., 2007, 33, 310.
17. Koren E., Corder C., Mueller G., Centurion H., Hallum G., Fesmire j., McGonathy W., Alaupovic P. Atherosclerosis (Shannon, Irel), 1996, 122, 105.
18. Парфентьева Е.П. Хим.-фарм. журн., 1979,
10.
19. Somova L.I., Shoda F.O., Ramnanan P., Nadar
A. J. Ethnopharmacol., 2003, 84, 299.
20. Железнова А.Д., Железнов Л.М., Штиль А.А., Фролов Б.А. Бюлл. эксп. биол. мед., 2007, 144, 458-463.
21. Шавва А.Г., Матюхина Л.Г., Салтыкова Н.А. // Химия природн. соед., 1969, 447.
22. Moghaddam F.M., Farimany M.M., Salahvarzi S., Amin G. eCAM, 2006, 1. doi: 10.1993/ecam/nel065.
23. Li T.-C., Wang J.-X., Zheng X.-J. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1998, 3957.
24. Шон Б. Ле, Каплун А.П., Шпилевский А.А., Андия-Правдивый Ю.Э., Алексеева С.Г., Григорьев
B.Б., Швец В.Н. Биоорг. хим., 1998, 24, 787.
