CC BY
93
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 4. 2009. Вып. 4
УДК 547.92+542.91
С. Н. Морозкина, О. И. Антимонова, Н. Д. Ещенко, В. А. Вилкова, А. Г. Шавва
НЕКОТОРЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА УРСОЛОВОЙ И БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТ
Введение. Создание новых лекарственных препаратов для лечения онкологических гормонозависимых заболеваний, таких как рак молочной железы, рак эндометрия у женщин и рак предстательной железы у мужчин, продолжает оставаться актуальной задачей. Для её решения в настоящее время чаще всего используются антигормональ-ные препараты и ингибиторы ферментов, ответственные за образование соответствующих гормонов [1, 2].
Известно, что урсоловая (I) [3] и бетулиновая (II) [4, 5] кислоты являются ингибиторами процессов ангиогенеза и могут усиливать апоптоз в клетках различных опухолей [6-10]. Кроме того, урсоловая кислота ингибирует образование ароматазы [11]. Это открывает перспективы применения указанных тритерпеноидов для лечения онкологических заболеваний, особенно в комбинации с известными противоопухолевыми препаратами. С другой стороны, бетулиновая кислота проявляет противовоспалительную активность, частично опосредованную рецепторами глюкокортикоидов [12]. При длительном применении это может привести к увеличению риска возникновения остеопороза - основного побочного эффекта глюкокортикоидов [13].
И хотя нет серьёзных экспериментальных доказательств влияния урсоловой кислоты на указанные рецепторы, представлялось важным исследовать действие тритерпе-ноидов (I) и (II) на содержание минеральных компонентов в кости.
Обсуждение результатов. Урсоловую кислоту выделяли из толокнянки, бету-линовую кислоту синтезировали из бетулина комбинацией известных методик. В опытах использовали тритерпеноиды со степенью чистоты не менее 98 %, идентификацию модельных соединений проводили с применением масс-спектрометрии, спектроскопии ЯМР 1Н и 13С.
Влияние тритерпеноидов на минеральные компоненты кости изучали в опытах на овариэктомированных крысах по методу Kalu [14], модифицированному на кафедре химии природных соединений СПбГУ [15]. Положительным контролем служил 17-эти-нилэстрадиол (ЕЕ) в дозе 0,1 мг/кг массы тела в сутки. Тритерпеноиды вводили per os
© С. Н. Морозкина, О. И. Антимонова, Н. Д. Ещенко, В. А. Вилкова, А. Г. Шавва, 2009
в виде суспензии в оливковом масле в дозе 20 мг/кг массы тела в сутки в течение 35 суток.
Из результатов исследований, представленных в табл. 1, можно заключить, что урсоловая (I) и бетулиновая (II) кислоты не оказывают в условиях эксперимента негативного влияния на содержание минеральных компонентов в бедренной кости подопытных животных и не проявляют утеротропного действия. В то же время они нормализуют содержание холестерина в сыворотке крови. Под действием урсоловой кислоты, в отличие от 17а-этинилэстрадиола [15, 16], наблюдается снижение содержания триглицеридов в сыворотке крови, что весьма важно, поскольку гипертриглицеридемия рассматривается как независимый фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний [17]. Полученные результаты о влиянии урсоловой кислоты (I) на липидный обмен подтверждают имеющиеся в литературе данные [18, 19].
Недавно в опытах на мышах было показано, тритерпеноид милиацин снизил лимфотоксический эффект метотрексата, используемого в клинической онкологии [20]. Представленные нами данные также указывают на перспективность исследования противоопухолевого действия урсоловой (I) и бетулиновой (II) кислот, в первую очередь, при комбинированном действии этих кислот и уже применяющихся в клинике анти-гормональных и других препаратов.
Экспериментальная часть. Полноту протекания реакций проверяли методом ТСХ на пластинах «Silufol» в системах растворителей петролейный эфир - этилаце-тат, (4:1), (3:1). Детектирование веществ проводили адсорбцией паров йода, в УФ-свете или под действием фосфомолибденовой кислоты. Для очистки веществ колоночной хроматографией использовали силикагель (0,040-0,063 мм) фирмы «Merck».
Масс-спектры снимали на приборе MX-1321 при температуре в ионизационной камере 200-210 С и энергии ионизирующего излучения 70 эВ.
Спектры 1H-ЯМР и 13С-ЯМР регистрировали при 295 К на спектрометре Bruker DPX-300 соответственно на частотах 300,130 и 75,468 МГц при 295 К. Спектры урсоловой и бетулиновой кислот сняты в DMSO-d6, остальных соединений в CDO3. Для спектров 1Н-ЯМР использовали растворы 5-7 мг вещества в 0,6 мл растворителя, а для 13С-ЯМР 30-50 мг в том же объёме. Химические сдвиги измерены по отношению к тетра-метилсилану.
Температуры плавления веществ определяли на нагревательном столике «Boetius».
Урсоловая кислота (I). 1 кг сухих измельчённых листьев толокнянки трижды экстрагировали 3 л этилового спирта в течение 2 суток, экстракты объединяли, спирт удаляли под вакуумом. К остатку добавляли 500 мл петролейного эфира (т. кип. 40-70 С), смесь перемешивали при комнатной температуре 1 ч, после чего растворитель удаляли декантацией. Экстракцию окрашенных примесей петролейным эфиром повторяли ещё раз. Оставшуюся массу растворяли в 800 мл диэтилового эфира, добавляли 500 мл 3 %-ного раствора едкого натра в воде. Тёмно-коричневый осадок, находящийся на границе раздела фаз, отфильтровывали, промывали водой и растворяли в 600 мл этанола. К полученному раствору добавляли, при сильном перемешивании, 10 % раствор соляной кислоты до рН = 1. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре водой до нейтральной реакции промывных вод, а затем сушили на воздухе. После кристаллизации осадка из смеси хлороформ-этанол получали 0,9—1,1 г урсоловой кислоты (I), т. пл. 283-284 °С. По литературным данным т. пл. 283-283,5 С [21]. Соединение (I) плавилось без депрессии температуры плавления в пробе смешения с заведомо известным веществом [21].
112
Таблица 1
Результаты исследования некоторых биологических свойств урсоловой (I) и бетулиновой кислот (II)
Группа подопытных крыс Изменение массы тела за время опыта, г Утеротропная активность Масса золы от бедренной кости / «влажная» масса бедренной кости Содержание холестерина в сыворотке крови, мг/100 мл Содержание триглицеридов в сыворотке крови, мг/100 мл
масса матки, мг/100 г массы тела содержание рецепторов прогестерона, фмоль/мг белка
ложнооперированные 30,6 ±2,7* 156,7 ±8,9** 62 ± 5** 0,440 ± 0,006* 58,7 ±1,8* 81,6 ±4,9*
овариэктомированные 65,5 ±4,2 34,5 ±2,6 18 ±2 0,396 ±0,005 70,7 ±1,9 65,8 ±4,3
овариэктомированные, получавшие 17а-этинилэст-радиол 9,0 ±4,1* 156,2 ± 7,4** 102 ± 11** 0,448 ± 0,005* 27,2 ± 1,5** 122,7 ±12,6**
овариэктомированные, получавшие урсоловую кис-лоту (I) 62,5 ±4,1 32,4 ±3,5 20 ±2 0,407 ± 0,005 46,3 ±2,2* 45,2 ±4,1*
овариэктомированные, получавшие бетулиновую кислоту (II) 64,1 ±5,3 29,8 ±2,5 22 ± 3 0,385 ± 0,008 49,4 ±3,1* 57,3 ± 5,1
* i-критерий Стьюдента р < 0,05; ** i-критерий Стьюдента р < 0,01.
Спектр 13С-ЯМР (5, м. д.): 39,2 (С1), 27,8 (С2), 77,7 (С3), 39,1 (С4), 55,6 (С5), 18,8 (С6), 33,5 (С7), 40,0 (С8), 47,9 (С9), 37,4 (С10), 23,6 (С11), 125,4 (С12), 139,0 (С13), 42,5 (С14), 28,3 (С15), 24,6 (С16), 47,7 (С17), 53,2 (С18), 39,5 (С19), 39,3 (С20), 30,9 (с21), 37,3 (С22), 29,1 (С23), 16,1 (С24), 16,9 (С25), 17,8 (С26), 24,1 (С27), 179,1 (С28), 17,9 (с29), 24,1 (С30) (отнесение сигналов проведено в соответствии с работами [22, 23]). Масс-спектр, m/z (I, %): 456 (2, М+), 441 (1), 438 (1), 300 (2), 248 (100), 207 (29), 203 (34), 133 (31).
Найдено, %: С 78,68; Н 10,64. С30Н48О3. Вычислено, %: С 78,90; Н 10,59.
Бетулиновая кислота (II). 5 г известного 3-моноацетата бетулина (III) [24] окисляли хромовым ангидридом в условиях, предложенных для синтеза бетулоновой кислоты [25]. После обычной обработки получали 2,4-2,6 г ацетата бетулиновой кислоты (IV) с т. пл. 287-290 °С. По лит. данным, т. пл. 288-290 °С [24]. 2 г полученного соединения гидролизовали в соответствии с методикой работы [24]. Выход бетулиновой кислоты (II) после кристаллизации из метанола составлял 1,5-1,6 г, т. пл. 293-295 С. По лит. данным, т. пл. 300-302 °С [24], 295-298 °С [25]. Спектр ЯМР 1Н соединения (II) соответствовал данным литературы [25].
Найдено, %: С 78,85; Н 10,69. С30Н48О3. Вычислено, %: С 78,90; Н 10,59.
Литература
1. Гершанович М. Л., Филов В. А., Акимов М. А., Акимов А. А. Введение в фармакологию злокачественных опухолей. СПб., 1999.
2. Chetrite G. S., Pasqualini J. R. The selective estrogen enzyme modulator (SEEM) in breast cancer // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2001. Vol. 76. N 1-5. P. 95-104.
3. Hsu Y. L., Kuo P. L., Lin C. C. Proliferative inhibition, cell-cycle dysregulation, and induction of apoptosis by ursolic acid in human non-small cell lung cancer A549 cells // Life Sci. 2004. Vol. 75. N 19. P. 2303-2316.
4. Anti-angiogenic activity of betulinic acid and its derivatives. // Pat. USA 6.228.850. Chem. Abstr. 2001. Vol. 134. P336213b.
5. Mukherjee R., Jaggi M., Rajendran P. et al. Synthesis of 3-O-acyl-3-benzylidene-3-hydrazone-3-hydrazine- 17-carboxyacryloyl ester derivatives of betulinic acid as anti-angiogenic agents // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. Vol. 14. P. 3169-3172.
6. Kim D.-K., Baek J. H., Kang C. M. et al. Apoptotic activity of ursolic acid may correlate with the inhibition of initiation of DNA replication // Int. J. Cancer. 2000. Vol. 87. P. 629-636.
7. Basul S., Ma R., Boyle P. J. et al. Apoptosis of human carcinoma cells in the presence of potential anti-cancer drugs: III. Treatment of Colo-205 and SKBR3 cells with cis-platin, Tamoxifen, Melpha-lan, Betulinic acid, L-PDMP, L-PPMP, and GD3 ganglioside // Glycoconjugate J. 2004. Vol. 20. N 9. P. 563-577.
8. Pisha E., Chai H., Lee I. S. et al. Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions of induction of apoptosis // Nat. Med. 1995. Vol. 1. P. 1046-1051.
9. Zhao Ning J., Wen Cai Y., Guo Ging Liu W. L., Wendy Hsiao. 23-Hydroxybetulinic acid-mediated apoptosis is accompanied by decreases in bcl-2 expression and telomerase activity in HL-60 cells // Life Sci. 2002. Vol. 72. N 1. P. 1-9.
10. Schmidt M. L., Kuzmanov K. L., Ling-Indeck L., Pezzuto J. M. Betulinic acid induces apoptosis in human neuroblastoma cells lines // Eur. J. Cancer. 1997. Vol. 33. N 12. P. 2007-2010.
11. Jeong H. J., Chang L. C., Kim Ho K. Aromatase inhibitors from Isodon excisus var. coreanus // Medic. Chem. Natur. Prod. 2000. Vol. 23. N 10. P. 243-245.
12. Recio R. C., Giner R. M., Manez S., Rios J. L. Structural Requirement for the antiinflammatory activity of natural triterpenoids // Planta Med. 1995. Vol. 61. N 2. P. 182-185.
13. Насонов Е. Л., Скрипникова И. А., Насонова В. А. Проблема остеопороза в ревматологии. М., 1997. 429 с.
14. Kalu D. N. The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss // Bone Miner. 1991. Vol. 15. N 3. P. 175-192.
15. Белов В. Н., Дудкин В. Ю., Урусова Е. А. и др. Синтез, исследование структуры и биологических свойств некоторых 8а-аналогов стероидных эстрогенов, содержащих фтор в положении 2 // Биоорг. химия. 2007. Т. 33. № 3. С. 315-323.
16. Шавва А. Г., Морозкина С. Н., Ищенко И. В. и др. Синтез и исследование биологических свойств 6-окса^-гомо-8а-аналогов стероидных эстрогенов // Биоорг. химия. 2007. Т. 33. № 3. С. 310-314.
17. Koren E., Corder C., Mueller G. Triglyceride enriched lipoprotein particles correlate with the severity of coronary artery disease // Atherosclerosis (Shannon, Irel). 1996. Vol. 122. N 1. P. 105-115.
18. Парфентьева Е. П. Влияние урсоловой кислоты и её производных на липидный обмен в условиях экспериментального атеросклероза // Хим.-фарм. журн. 1979. C. 10-16.
19. Somova L. I., Shoda F. O., Ramnanan P., Nadar A. Antihypertensive, antiatherosclerotic and antioxidant activity of triterpenoids isolated from Olea europea, subspecies africana leaves // J. Ethnopharmacol. 2003. Vol. 84. N 2-3. P. 299-305.
20. Железнова А. Д., Железнов Л. М., Штиль А. А., Фролов Б. А. Морфологические проявления защитного влияния милиацина в органах иммуногенеза при действии метотрексата // Бюл. эксп. биол. мед. 2007. Т. 144. N 10. С. 458-463.
21. Шавва А. Г., Матюхина Л. Г., Салтыкова И. А. Урсоловая кислота в Sorbus aucu-paria L // Химия прир. соед. 1969. № 5. С. 447.
22. Seebacher W., Simic N., Weis R. Complete assignments of 1H and 13C-NMR resonances of oleanolic acid, 18a-oleanolic acid, ursolic acid and their 11-oxo derivatives // Magn. Res. Chemistry. 2003. Vol. 41. N 8. P. 636-638.
23. Moghaddam F. M., Farimany M. M., Salahvarzi S., Amin G. Chemical constituents of dichloromethane extract of cultivated Satureja khuzistana // eCAM, 2006, 1. doi: 10.1993/ecam/nel065.
24. Li T. C., Wang J. X., Zheng X. J. Simple synthesis of allobetuline, 28-oxyallobetulin and related biomarkers from betulin and betulinic acid catalysed by solid acids // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1. 1998. N 10. P. 3957-3965.
25. Шон Б. Л., Каплун А. П., Шпилевский А. А. и др. Синтез бетулиновой кислоты из бе-тулина и исследование её солюбилизации с помощью липосом // Биоорг. хим. 1998. Т. 24. № 10. С. 787-793.
Принято к публикации 13 марта 2009 г.
