CC BY
28
НАРУШЕНИЕ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ ЖЕНЩИН И СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ И.Р. Исхаков, Р.С. Исхакова
Башкирский государственный университет, г. Уфа
Abstract
Every sixth couple is having difficulty becoming pregnant naturally, what affect both female and male factors. Of particular interest is the study of the effects of free radicals on fertility. Their effect on oocytes and reproductive function of women is unclear. We examined 72 infertile women aged 25 to 38 years, undergoing diagnosis and treatment at the medical center "Family" (Ufa). Investigated the role of reactive oxygen species (ROS), lipid peroxidation and total antioxidant activity (TAA) in follicular fluid (FF) of these women. FF suppresses the generation of ROS in a model system. With the high quality performance of embryological degree of suppression of the ROS lower less TAA and higher content of malonic dialdehyde.
Key words: female infertility, free radical oxidation, follicular fluid.
Каждая шестая супружеская пара испытывает трудности с естественным наступлением беременности, на что влияют как женский, так и мужской факторы. Особый интерес вызывает изучение влияния свободных радикалов на фертильность. Их действие на ооциты и репродуктивную функцию женщин неясно. Было обследовано 72 женщины с бесплодием в возрасте от 25 до 38 лет, проходивших диагностику и лечение на базе медицинского центра «Семья» г.Уфы. Изучали роль активных форм кислорода (АФК), перекисного окисления липидов и общей антиоксидантной активности (ОАА) в фолликулярной жидкости (ФЖ) этих женщин. ФЖ подавляет генерацию АФК в модельной системе. При высоком качестве эмбриологических показателей степень подавления АФК ниже, меньше ОАА и выше содержание малонового диальдегида.
Ключевые слова: женское бесплодие, свободнорадикальное окисление, фолликулярная жидкость.
Около 15% супружеских пар во всем мире имеют проблемы с естественным наступлением беременности, что может быть связано с разными причинами и со стороны женщины, и мужчины [1].
Известно о влиянии свободных радикалов на репродуктивную функцию. Свободные радикалы отличаются высокой химической активностью, образуются в организме при многих жизненно важных физиологических и метаболических процессах. Наиболее часто в организме встречаются следующие: активные формы кислорода (АФК) и радикалы, возникающие при перекисном окислении липидов (ПОЛ).
АФК выполняют сигнальную функцию в клеточной регуляции. Они
2+
стимулируют накопление цАМФ и цГМФ, ионов Ca в цитозоле, активацию протеинкиназ, протеинтирозинкиназ и подавление активности протеинфосфатаз. Будучи в избытке, они повреждают биологические мембраны, вызывают различные патологические процессы, получившие обобщающее название «оксидативный стресс» [2].
АФК играет основную роль в процессах гиперактивации сперматозоидов, ведущей к капацитации и развитию акросомальной реакции. И вместе с тем влияние свободнорадикального окисления (СРО) на фолликулярные клетки женщин изучено мало [3]. Действие свободных радикалов и продуктов окисления на ооциты и последующее развитие эмбрионов остается неясным. В доступной литературе сравнительно мало данных о роли АФК, ПОЛ и общей антиоксидантной активности (ОАА) в фолликулярной жидкости (ФЖ) женщин с бесплодием [4].
Материал и методы исследования
Было обследовано 72 женщины с бесплодием в возрасте от 25 до 38 лет, проходивших диагностику и лечение на базе медицинского центра «Семья» г. Уфы. Для выявления причин бесплодия пациенткам проводили общеклиническое и гинекологическое обследование, УЗИ органов малого таза, эндоскопическое исследование эндометрия (по показаниям), определяли концентрацию половых гормонов в крови. Индукцию суперовуляции в лечебных циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) осуществляли по стандартным протоколам. ФЖ получали путём трансвагинальной пункции преовуляторных фолликулов (от 2 до 11 у одной пациентки). В качестве контрольной группы выступили доноры ооцитов (12 женщин), имеющие детей и прошедшие аналогичное обследование.
ЭКО проводили в среде Fertilization medium (SAGE), которую на следующий день заменяли на Cleavage medium (SAGE). Оплодотворение проверяли по наличию двух пронуклеусов. На 2 день определялись частота дробления и степень фрагментации. На 3 день сменяли среду на Blastocyst medium (SAGE). Анализировали количество клеток, фрагментацию и внешний вид бластомеров. Образование и качество бластоцист определяли на 5 день согласно методике Гарднера.
Оценивали эмбриологические показатели (по 3 дню): частоту оплодотворения, характеристики дробления и выход в бластоцисты. Дробление оценивали по числу бластомеров и степени фрагментации. К группе высокого качества относили эмбрионы 6a-8a и 6ab-8ab, а также эти же эмбрионы со 1 степенью фрагментации. К группе среднего качества - 6b-8b и более 8 бластомеров, а также эти же эмбрионы со 2 степенью фрагментации. К группе низкого качества - менее 6 бластомеров, а также эти же эмбрионы со степенью фрагментации больше 3.
Оценивали процент выхода в бластоцисты и выделяли 3 группы: бластоцисты с полностью расправленной полостью - классы III, IV, V, бластоцисты с наличием не превышающей половины объема эмбриона полости - классы I, II, а в третью группу вошли морулы (МО).
Всего было исследовано 200 проб ФЖ. Показатели свободнорадикальной активности измерялись методом регистрации хемилюминесценции (ХЛ) -свечения, возникающего при взаимодействии свободных радикалов, на хемилюминометре ХЛ-003 (Россия) [2]. В модельную систему, в которой инициировали образование свободных радикалов, добавляли 0,5 мл ФЖ. Уровень продуктов ПОЛ определяли по содержанию малонового диальдегида (МДА) в ФЖ набором фирмы «Агат». ОАА определяли набором фирмы «Randox». Математическую обработку результатов производили программой MS Excel 2000.
Результаты и обсуждение На рисунке приведены записи хемилюминесценции модельной системы, генерирующей АФК, и влияние ФЖ на интенсивность свечения (рис. 1).
Бремя, Мин
Рис. 1. Записи хемилюминесценции (ХЛ) модельной системы при добавлении
фолликулярной жидкости (ФЖ) Обозначения кривых: 1 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК; 2 - добавление ФЖ донора ооцитов; 3 - добавление ФЖ женщины, забеременевшей после ЭКО; 4 - добавление ФЖ женщины, незабеременевшей после ЭКО.
Таблица 1. Влияние показателей СРО в ФЖ на частоту оплодотворения, качество _дробления и выход в бластоцисты_
Показатели Контроль Частота оплодотворения Характеристики дробления Выход в бластоцисты
<70% (n=43) >70% (n=41) Низкое качество (n=29) Среднее качество (n=31) Высокое качество (n=24) Морулы (n=27) I и II классы (n=34) III, IV и V классы (n=23)
Интенсивность подавления ХЛ, % 100 85* 73* 90 84* 65* 92 83* 72*
ОАА, ммоль/л 5,4±0,09 2,3±0,05* 0,6±0,01* 5,3±0,07 2,9±0,02* 0,6±0,01* 4,1±0,07* 2,2±0,02* 0,9±0,01*
МДА, Д532 нм 0,1±0,05 0,2±0,05 0,3±0,05* 0,2±0,05 0,25±0,05 0,3±0,05* 0,1±0,05 0,2±0,05* 0,3±0,05*
Статистически достоверные различия (p<0,05) отмечены «*».
Согласно рисунку 1, введение в модельную систему ФЖ существенно изменяет течение процессов генерации радикалов, причем выраженность сдвига непосредственно определяется особенностями добавляемого биологического материала. Это полностью подтверждают результаты количественного анализа интенсивности хемилюминесценции в созданных системах, представленные в таблице 1. Установлено, что все изученные образцы, кроме характерных для морул и при низком качестве дробления, статистически значимо снижают уровень данного параметра (p<0,05).
С другой стороны, подобный антиоксидантный эффект сопровождается изменением и других параметров, характеризующих как прооксидантные (концентрация малонового диальдегида), так и антиоксидантные свойства модельной системы. Так, нарастание уровня малонового диальдегида было зафиксировано при высокой частоте оплодотворения, высоком качестве дробления и выходе в бластоцисты (p<0,05 для всех случаев по сравнению с интактной модельной системой). Этому сопутствует тенденция к снижению общей антиоксидантной активности ФЖ, обнаруженная в тех же случаях.
Выводы:
1. Фолликулярная жидкость подавляет генерацию активных форм кислорода в модельной системе.
2. При высокой частоте оплодотворения, высоких показателях дробления эмбрионов и выходе в бластоцисты высокого качества степень подавления активных форм кислорода ниже, меньше общая антиоксидантная активность и выше содержание малонового диальдегида в фолликулярной жидкости, что вероятно отражает усиленную метаболическую активность.
Список литературы
1. Нишлаг Э., Бере Г.М. Андрология, 2005.
2. Фархутдинов Р.Р., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободнорадикального окисления в биологии и медицине, 1995.
3. Agarwal A., Aponte-Mellado A. The effects of oxidative stress on female reproduction: a review // Reprod. Biol. Endocrinol. 2012. Vol. 10. P. 49.
4. Kolesnikova L.I., Darenskaya M.A. Activity of lipid peroxidation in infertile women from different populations // Bull. Exp. Biol. Med. 2012. Vol. 154, N2. P. 203-205.
