CC BY
98
Биорэдикалы и Аникжсиданты 2015 Тем 2. ftal
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЭМБРИОНОВ ЧЕЛОВЕКА НА РАННИХ ЭТАПАХ II СВОЕОЛИОРАДИКАЛЪНОЕ ОКИС ЛЕНИЕ II.Р. Исааков. Р.С. Исхакова
Башкирст iй госл'дарственный медицинский университет, Уфа
Abstract
Assessing of the quality of embryos . usually carried out on the basis of morphological parameters. It is believed that the embryos with the best morphological parameters should have the highest rate of implantation. But in assisted reproductive technology there is the problem of multiple pregnancy . and many clinics tend to selective transfer of one embryo. In this regard, you need to look for ways to improve the current criteria for assessing the quality of the embryos. It is promising to study the metabolism of embryos when cultured. Tins study presents an analysis of free radical oxidation in the culture media used in fertilization and early embryogenesis.
Key words: in vitro fertilization, fertilization rate, cleavage, blastocyst
Оценку качества эмбрионов, как правило, проводят на основании морфологических параметров. Принято считать, что эмбрионы с наилучшими морфологическими показателями должны иметь наиболее высокую частоту имплантации. Но в программах вспомогательных репродуктивных технологии существует проблема многоплодия, и многие клнннки стремятся к селективному переносу одного эмбриона. В связи с этим нужно искать пути совершенствования современных критериев оценки качества эмбрионов. Перспективным является изучение метаболизма эмбрионов прн культивировании. Данное исследование представляет собой анализ процессов свободнораднкального окисления в культуральных средах, используемых прн оплодотворении и раннем эмбриогенезе.
Ключевые слова: экстракорпоральное оплодотворение. частота оплодотворения, дробление, бластоциста
В последнее время все больше супружеских пар сталкиваются с проблемой бесплодия. Причем бесплодными оказываются и женщины, и мужчины почти в равной степени. Ряд заболеваний приводит к необходимости проведения методов вспомогательной репродукции. Порой это единственный способ получить беременность.
Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) - метод, прн котором оплодотворение яйцеклетки сперматозоидом происходит вне женского организма. Интрацитоплазматнческая инъекция сперматозоида в яйцеклетку (ИКСИ) - метод, прн котором сперматозоид вводится прямо в яйцеклетку. Л ля применения других методов лечения бесплодия, которые используются в
Биорздикалы и Аникжснданты 2015 Тем 2. Nil
программе ЭКО. как правило, необходимо множество сперматозоидов высокого качества. Для ИКСИ хватает одного.
С каждым годом совершенствуется техника выполнения ЭКО. Одна нз проблем - отбор качественных эмбрионов для переноса в полость мягки. Чаще перенос делают на 3 или 5 лень развития эмбриона и при этом среди множества выросших эмбрионов выбирают от 1 до 3, прибегая к световой микроскопии. При этом производят морфологическую оценку эмбрионов согласно классификации Гарднера (1999) [2].
Уже не одно десятилетие ведется поиск иных методов оценки качества эмбрионов и выбора лидера для переноса. Перспективным является изучение метаболизма эмбрионов. Немаловажно отметить, что одна нз трудностей его изучения заключается в чрезвычайно малых объемах исследуемых образцов сред для оплодотворения и культивирования эмбрионов (несколько десятков микролнлров). Есть определенный успех в изучении метаболических процессов эмбрионов, связи их с гормонами и ферментами [5].
В го же время связь развития эмбриона и ев обод нора дикальных процессов малоизученна. В процессе зарождения и раннего развития организма они играют очень большую роль, являясь регуляторами и инициаторами раэнообразных реакций [6].
Свободные радикалы отличаются высокой химической активностью, образуются в организме при многих жизненно важных физиологических и метаболических процессах. Наиболее часто встречаются следующие свободные радикалы: активные формы кислорода (АФК) и радикалы, возникающие прн пер екн сном окислении липидов (ПОЛ) [1].
В случае с человеческими эмбрионами можно нзучягь свободнораднкальное окисление (СРО) в средах. где происходило оплодотворение и развитие эмбриона, и по нему уже судить об интенсивности метаболических процессов [3].
Цель: изучить особенности своболнор а дикальных процессов, протекающих в средах, используемых для оплодотворения и культивирования эмбрионов на ранних этапах.
Материал и методы
Было обследовано 114 пар с диагнозом «бесплодие», проходивших диагностику и лечение на базе медицинского центра «Семья» г. Уфы. Для выявления причин бесплодия женщинам проводили общеклиническое и гинекологическое обследование. УЗИ органов малого гаэа. эндоскопическое исследование по показаниям, определяли концентрацию половых гормонов в крови. Мужчинам - общеклнннческое н урологическое обследование, анализ спермограммы, а также проверяли уровень половых гормонов.
Индукцию суперовуляцнн в лечебных циклах ЭКО осуществляли по стандартным протоколам [4]. Оплодотворение проводили в среде Fertilization medium (Fm) (SAGE) (объем среды бООмкл, SPS 10%) и оставляли на 1S-2G часов в условиях инкубатора. На следующий день пересаживали в Cleavage medium (Cm) (SAGE) (объем 20 мкл, SPS 10%) и оценивали качество эмбриона. На 3 день пересаживали в Blastocyst medium (Вт) (SAGE) (объем 30 мкл. SPS
Бнораднжалы н Антнок гад анты 2015 Тем 2.
10%). Среды забирали на исследование свободнорадикальных процессов поспе забора эмбрионов из чашки.
Процессы СРО измерялись методом регистрации хемилюмннесценцнн (ХЛ) - свечения, возннкаюшего при взаимодействии свободных радикалов, на хемилюминометре ХЛ-003 (Россия) [1]. В модельную систему, в которой инициировали образование АФК. добавляли 0.1 мл исследуемой среды. Уровень продуктов ттерекисного окисления липндов определяли по содержанию малонового диальдегнда в исследуемой среде набором фирмы «Агат». Общую антноксидантную активность определяли набором фирмы «Randox». Математическая обработка производилась с помощью программы Microsoft Excel 2000.
Результаты и обсуадеипе
На рисунке 1 приведены записи ХЛ модельной системы, генерирующей АФК. и влияние культуральных сред для оплодотворения и раэвнлия эмбрионов на интенсивность свечения.
I в ■
б:.-:
а -- ее
I J:.,.
Г з
£
^ 6 -
1.0=
е
Рис. 1. Записи ХЛ модельной системы при добавлении кульгуратьных сред 1 - записи ХЛ модельной системы, генерирующей АФК: 2 - добавление среды для оплодотворения; 3 - добавление среды для дробления: 4 - добавление среды
для культивирования бластоцист.
Таолнца 1. Показатели СРО в средах для оплодотворения, дробления и раавнтия __бластоцист в программах ЭКО_
Показатели Контроль Добавление среды
Fm (п=59) Cm (11=59) Bill (п=55)
Интенсивность
ХЛот 100 136х 123х 115*
контроля. %
ОАА. ммоль/л 3,4±0,09 2,4±0,07* 2,1±0,03* 1.9=0.06*
МДА. Д532шл 0,1 ±0,05 0,19±0.04 0,21 ±0.03 0.23±0.04
Статистически достоверные различия (р:: 0.05) отмечены о*
Биорэднкалы н Аликжсиданты 2015 Тем 2. Кз1
Запись ХЛ модельной системы. е которой вызывается образование АФК, характеризуется следующими параметрами: спонтанное свечение, быстрая вспышка в момент введения инициатора, патентный период, переходящий в медленную вспышку. Из рисунка видно, что добавление среды укорачивает латентный период свечения. Это свидетельствует об ускорении процессов инициирования СЮ в модельной системе в присутствии культуральных сред.
Таблица 2. Показатели СРО в средах для оплодотворения, дробления н развития
бластоцнст в программах ИКСИ
Показатели Контроль Добавление среды
Тт (п=59) Ст (п=59) Вт (п=55)
Интенсивность
ХЛ от 100 112 110 111
контроля. %
ОАА. ммоль/л 3,4±0,09 3.2=0.05 3.0=0.07 зл±о:о&
МДА. Д532вм 0,1 ±0,05 0,13 ±0.02 0,13±0.03 0.24±0.07
Статистически достоверные различия (р:: 0.05) отмечены {<*►>
Из таблицы 1 видно, что показатели хемилюминисценцнн модельной системы при добавлении сред были максимальными в случае со средой для оплодотворения. Это свидетельствует о способности среды, используемой для оплодотворения, поддерживать генерацию АФК. Минимальными эти показатели были в среде для развития бластоцнст. Уровни ОАА и МЛ А в средах, используемых для оплодотворения н культивирования эмбрионов, до и после развития эмбриона достоверно не различался.
Из таблицы 2 видно, что показатели хемилюминисценцнн модельной системы при добавлении сред, уровень ОАА и уровень МЛ А до и после развития эмбриона достоверно не различались.
Прн сравнении результатов культивирования обращает внимание факт отсутствия различии в процессах СРО прн ИКСИ. В го время как при ЭКО разница есть.
Таким образом, выявлено, что в среде для оплодотворения уровень СРО выше, чем в средах для культивирования эмбрионов. Уровень антиоксидантной активности и малонового диальдегнда в средах для оплодотворения и культивирования эмбрионов на ранннх этапах до и после развития эмбриона достоверно не различались.
Выводы
1. В процессе оплодотворения и культивирования эмбрионов прн ЭКО происходит изменение процессов СРО.
2. Повышение интенсивности СРО в средах для оплодотворения может бьпь связано с большим количеством клеток и является следствием активности не только образовавшегося эмбриона, но и клеток кумулюса и сперматозоидов.
Уровень малонового диальдегнда и АО А в среде достоверно не меняется в процессе культивирования эмбриона.
Бнорэднкалы н Аяпкжснданты 201 ^ Тем 2. Nsl
Список лптер ату р ы
1. Фархутпннов P.P.. Громенко Д.С. Воздействие бнофлафононлов прополиса на процессы лнпоперокендацнн в гонадах крыс при интоксикации полихлорнровэнными бнфеннламн '! Вопросы питания. 200&. №6.
2. Elder К.. Dale В. In vitro fertilization. М.. 20OS.
3. Gardner D.K.. Wale P.L. Analysis of metabolism to select viable human embryos for transfer. 2013.
4. Gardner D.K.. Surrey E.. Mmjarez D., Leitz A., Stevens J.. Schoolcraft W.B. Single blastocyst transfer: a prospective randomized trial. 2004.
5. Leese H.J.. Conaghan J.. Martin K.L., Hardy K. Early human embryo metabolism. 1993.
6. Maheshwari A.. Griffiths S.. Bhattacharya S. Global variations in the uptake of single embryo transfer. 2011.
