CC BY
4
ядер флуоресцентным красителем Hoechst33342, пролиферацию оценивали при помощи набора Click-iT™ EdU Cell Proliferation Kit. Также оценивался митохондриаль-ный потенциал клеток при помощи TMRM Assay Kit.
В результате было продемонстрировано, что модификация аминослоем поверхности поликапролактона значимо повышает заселение скаффолда эндотелиаль-ными клетками. Причем импульсный режим нанесения полимера позволяет формировать полимерный слой, значимо больше стимулирующий пролиферацию и образование полноценного слоя эндотелиальных клеток.
Таким образом представленная в работе модификация поверхности инертных синтетических волокон аминогруппами позволяет значимо повысить скорость заселения их эндотелиальными клетками от пациента, тем самым повысить качество импланта, снизить риск тромбообразования и повысить успешность шунтирования. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (№ 20-52-26020).
Литература:
1. Goh E.T., Wong E., Farhatnia Y., Tan A., Seifalian A.M. Int. J. Mol.
Sci., vol. 16, 1, pp. 597-627, 2015.
МЕМБРАННЫЕ ВЕЗИКУЛЫ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК СО СВЕРХЭКСПРЕССИЕЙ TRAIL ИНДУЦИРУЮТ АПОПТОЗ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ У КСЕНОГРАФТНОЙ МОДЕЛИ МЫШЕЙ С АДЕНОКАРЦИНОМОЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
В.В. Соловьева, Т.В. Пухальская, Д.С. Чулпанова, А.А. Ризванов
Казанский федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: solovYOvavv@gmail.com
Ключевые слова: мезенхимные стволовые клетки, TRAIL, внеклеточные везикулы, апоптоз, рак молочной железы, терапия онкологических заболеваний.
Лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с фактором некроза опухоли (TRAIL) является одним из наиболее перспективных среди терапевтических цитокинов, которые избирательно индуцирует апоптоз в опухолевых клетках. Доставка TRAIL в очаг опухоли с помощью мембранных везикул мезенхимных стволовых клеток (МСК) представляет интерес в качестве нового метода бесклеточной терапии онкологических заболеваний.
В настоящей работе индуцированные мембранные везикулы (иМВ) из генетически модифицированных МСК-TRAIL получали путем обработки клеток цитоха-лазином В (Sigma-Aldrich, США). Противоопухолевый эффект иМВ-TRAIL исследовали на ксенографтной модели мышей с аденокарциномой молочной железы. Эксперименты проводили в соответствии с протоколами, утвержденными локальным этическим комитетом Казанского (Приволжского) федерального университета (КФУ). Для создания опухолей иммунодефицитным мышам подкожно вводили клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7. При достижении опухоли размера 100 мм3 животным вводили 50 мкг на-тивных иМВ или иМВ-TRAIL в 20 мкл физраствора, либо 20 мкл физраствора в качестве контроля. Инъекции иМВ осуществляли в область опухоли в течение 12 дней
с интервалом в два дня. Уровень экспрессии апоптотиче-ских генов CAS8, BCL-2 и BAXи уровень белка САБЭ в го-могенатах опухоли определяли с помощью ПЦР в режиме реального времени и вестерн блот анализом.
Было показано увеличение уровня мРНК гена CAS8 в 1,8 раз в группе мышей, получавших инъекции иМВ-ТПАЩ по сравнению с контролем. Экспрессия анти-апоптотического гена BCL-2 в этой же группе животных не изменилась, в то время как уровень мРНК проапоп-тотического гена BAX был увеличен в 1,4 раза, что указывает на активацию апоптотического каскада и индукцию гибели опухолевых клеток. Вестерн блот анализ выявил увеличение уровня ключевого белка апоптоза САБЭ в 1,7 раз у животных, получавших инъекции иМВ-ТПАЩ по сравнению с контролем.
Полученные результаты указывают на то, что иМВ-ТПА11_ способны активировать внешний сигнальный путь апоптоза и индуцировать гибель опухолевых клеток у мышей с ксенографтной моделью аденокарциномы молочной железы. Таким образом, использование иМВ-ТПА1_ может стать эффективным инструментом для терапии рака молочной железы. Работа выполнена за счет средств программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и гранта Российского научного фонда № 18-74-10044.
МУТАЦИЯ В ГЕНЕ GLUD2 ПРИВОДИТ К СНИЖЕНИЮ КОЛИЧЕСТВА АКТИВНЫХ МИТОХОНДРИЙ В НЕЙРАЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИПСК ПАЦИЕНТА С БОЛЕЗНЬЮ ПАРКИНСОНА
Д.А. Сорогина1, 2, Е.С. Дроздова1, 2,
Е.В. Григорьева2, С.В. Павлова2, А.А. Малахова2,
С.П. Медведев2, С.М. Закиян2
1 Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия
2 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск, Россия
e-mail: d.sorogina@g.nsu.ru
Ключевые слова: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, нейральная дифференцировка, болезнь Паркинсона, глутаматдегидрогеназа 2-го типа.
Болезнь Паркинсона (БП) — нейродегенеративное заболевание, обусловленное гибелью дофаминерги-ческих нейронов черной субстанции среднего мозга. Наследственная форма БП может быть вызвана мутациями в различных генах, одним из которых является ген GLUD2. Этот ген кодирует митохондриальный фермент глутаматдегидрогеназу 2-го типа, участвующую в окислительном дезаминировании глутамата. Мутация d492T>G в гене GLUD2 ведет к усилению работы фермента, что в свою очередь приводит к гибели дофаминер-гических нейронов [1].
Для изучения фенотипического проявления мутации d492T>G в гене GLUD2 были получены линии ИПСК путем репрограммирования мононуклеарных клеток периферической крови пациента мужского пола, гемизи-готного по данной мутации. Для получения релевантного типа клеток была проведена направленная дифференци-ровка ИПСК пациента и условно здоровых людей в астро-глиальные клетки и дофаминергические нейроны.
Оценка фенотипического проявления данной мутации проводилась с помощью конфокальной микроскопии
и статистического анализа. Полученные производные окрашивались митотрекером и потенциал-зависимым красителем TMRM. Статистический анализ показал, что в полученной клеточной модели количество активных митохондрий в нейральных производных ИПСК пациента с мутацией достоверно (p-value < 0,05) ниже, чем в контрольных линиях
Таким образом, мы показали, что мутация в гене GLUD2, вероятно, приводит к снижению количества активных митохондрий в астроцитах и дофаминергических нейронах, это может быть связано с перенасыщением цикла Кребса и образованием большого количества АФК. В результате усиленной работы фермента митохондрии разрушаются, что является одной из основных причин развития болезни Паркинсона [2]. Работа поддержана грантом РНФ № 19-75-20063.
Литература:
1. Plaitakis A. et al. Eur. J. Hum. Genet. 2010 183. 2009. Vol. 18.
№ 3. P. 336-341.
2. Malkus K.A., Tsika E., Ischiropoulos H. Mol. Neurodegener.
2009. Vol. 4. № 1.
ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОСВЯЗЕЙ МЕЖДУ БИОМАРКЕРАМИ НАКОПЛЕНИЯ СЕНЕСЦЕНТНЫХ КЛЕТОК НА СИСТЕМНОМ, ТКАНЕВОМ И КЛЕТОЧНОМ УРОВНЯХ ПРИ СТАРЕНИИ
А.Г. Сорокина1, Я.А. Орлова1, 2, О.А. Григорьева1,
Е.С. Новоселецкая1, Н.А. Басалова1,
Н.А. Александрушкина1, М.А. Виговский1, 2,
К.И. Кириллова1, А.В. Балацкий1,
Л.М. Самоходская1, 2, Н.В. Данилова1, 2,
У.Д. Дьячкова2, В.В. Какоткин2, Д.А. Асратян1,
Ж.А. Акопян1, 2, А.Ю. Ефименко1, 2
1 Медицинский научно-образовательный центр МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: drsorokinaag@gmail.com
Ключевые слова: сенесцентные клетки, старение, биомаркер, p16INK4a, скорость пульсовой волны, возраст-ассоци-ированные заболевания, секреторный фенотип, ассоциированный со старением.
Понимание биологических механизмов процессов старения необходимо для предупреждения и замедления развития возраст-ассоциированных заболеваний (ВАЗ). Одной из ведущих причин старения организма считается накопление в различных тканях т. н. сенесцентных, или стареющих, клеток (СК). Клеточное старение является необходимым для обновления тканей и их регенерации, но избыточное накопление СК приводит к активации хронического асептического воспаления, дисфункции тканей и развитию ВАЗ. В настоящее время активно разрабатываются подходы к селективной элиминации СК, контролю их активности и реверсии сенесцентного состояния[1].
Для оценки вклада СК в развитие старения и патогенез ВАЗ необходимы релевантные и надежные биомаркеры таких клеток. В качестве такого биомаркера часто используется экспрессия ингибиторов клеточного цикла (например, р16/INK4a). В клинической практике маркерами ВАЗ являются жесткость сосудистой стенки, некоторые гемодинамические и метаболические параметры, а также содержание отдельных цитокинов и факторов
роста в крови. В данной работе мы изучали взаимосвязи между установленными клиническими системными биомаркерами старения и развития ВАЗ и биомаркерами СК на тканевом и клеточном уровнях.
В исследование было включено 38 пациентов старше 65 лет (средний возраст 70 ± 4,9лет), у которых проводили оценку традиционных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, жесткости артериальной стенки, а также получали биоматериалы (периферическая кровь, кожа, подкожная жировая клетчатка), из которых затем выделяли различные типы клеток (мононуклеарные клетки крови (МНК), фибробласты (ФБ) и мезенхимные стромальные клетки (МСК)), а также проводили гистологический анализ биоптатов с целью оценки различных маркеров СК.
С помощью корреляционного анализа была подтверждена сильная значимая связь экспрессии р16 в тканях с возрастом (г=0,6, р<0,001), что соответствует литературным данным [2], на организменном уровне выявлена его связь со скоростью пульсовой волны (г=0,394, р=0,015), уровнем УСАМ-1 (г=0,312, р=0,006) в системном кровотоке и уровнем мРНК р16 в МНК (г=0,380, р=0,046). Статистически значимые корреляции были выявлены с показателями пролиферации ФБ и МСК в культуре и приобретением клетками секреторного фенотипа, ассоциированного со старением (БАБР): так, уровень р16 значимо коррелировал с уровнем 11_-6 (сильная связь) и МСР-1 (слабая связь) в секретоме клеток. Результаты многофакторного линейного регрессионного анализа подтвердили, что независимо от возраста с экспрессией р16 связаны показатели пролиферации выделенных клеток и 1_-6 в составе БАБР.
Таким образом, мы установили наличие взаимосвязей между биомаркерами накопления СК в тканях и в клетках, выделенных из этих тканей в культуру, а также выраженностью клинических биомаркеров старения. Полученные данные необходимы для успешной трансляции в клинику подходов, направленных на регуляцию содержания СК в различных тканях. Исследование выполнено в рамках государственного задания МНОЦ МГУ им. М.В. Ломоносова.
ФИБРОБЛАСТЫ, ТУЧНЫЕ КЛЕТКИ, МАКРОФАГИ ДЕСНЫ У БОЛЬНЫХ ПАРОДОНТИТОМ ПОСЛЕ ЛАЗЕРНОЙ ТЕРАПИИ
Е.М. Сперанская
ФГБОУ ВО Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова, Чебоксары, Россия
e-mail: ne28@bk.ru
Ключевые слова: фибробласты, макрофаги, тучные клетки, CD68, пародонтит, диодный лазер.
Фибробласты десны участвуют в воспалительных реакциях и ремоделировании структур пародонта за счет продукции цитокинов, которые активируют миграцию тучных клеток и макрофагов, способствуя восстановлению тканей [1, 2, 3, 4].
Целью исследования стало изучение механизмов, направленных на регуляцию численности десневых фибро-бластов, тучных клеток и макрофагов при хроническом воспалении у людей молодого возраста (20-40 лет).
Материалы и методы. Проанализированы 32 образца десны человека 20-40 лет, полученных при биопсии. Все пациенты были разделены на 3 группы: контрольная
