CC BY
8
Для оценки эффективности дифференцировки использовали цитофлуоресцентное окрашивание красителем NileRed. Методом ПЦР в реальном времени оценивалась экспрессия ключевых маркеров дифференцировки. Внеклеточные везикулы (ВВ) получали кондиционированием клеток в течение 2 суток. Для концентрирования ВВ использовали центрифужные ультрафильтры-концентраторы. Для оценки активности инсулин-зависимых внутриклеточных сигнальных каскадов использовался метод иммуноблоттинга.
Результаты. При старении происходило значительное снижение адипогенного потенциала МСК, связанное с развитием инсулинорезистентности. Это было обусловлено повышением базального уровня активации Erk1/2 и Akt — основных участников инсулиновой сигнализации. Далее мы выяснили, участвует ли секретом се-несцентных МСК в развитии их инсулинорезистентности. Проанализировав транскриптом секретома сенесцент-ных МСК в сравнении с молодыми, мы обнаружили, что сенесцентные МСК продуцировали ВВ с повышенным содержанием микроРНК, мишенями которых являются молекулы, участвующие в развитии и регуляции адипо-генных сигналов в клетке и в сигнальном ответе на инсулин. Добавление ВВ от молодых МСК к сенесцентным клеткам восстанавливало адипогенный потенциал, а добавление ВВ от сенесцентных МСК к молодым клеткам — снижало. Добавление к молодым МСК ВВ от сенесцент-ных клеток приводило к повышению в них базального уровня активации Erk и Akt.
Таким образом, при старении происходит снижение адипогенного потенциала МСК, связанное индукцией инсулинорезистентности компонентами секретома се-несцентных клеток. Исследование поддержано грантом РФФИ № 19-29-04172 мк.
ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ЭЛЕКТРОПРОВОДЯЩИЙ
МАТЕРИАЛ НА ОСНОВЕ КОМПОЗИТА
ХИТОЗАН-СЕРЕБРО С ДОБАВЛЕНИЕМ
ПОЛИЭТИЛЕНОКСИДА
Д.А. Волков1, И.Е. Ребров2, Т.Е. Григорьев1
1 НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
2 ИЭЭ РАН, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: электроспиннинг, хитозан, серебро, поли-
этиленоксид, электропроводящие материалы.
В последнее время технология электроспиннинга стала универсальным методом получения нетканых материалов с довольно обширной возможностью использовать их в разных областях, включая медицину. В частности, ряд различных нановолокон на основе хи-тозана привлекает большое внимание благодаря возможности их применения в таких направлениях, как тканевая инженерия [1], доставка лекарств [2] и т. д. Одним из перспективных наполнителей хитозановых волокон являются наночастицы серебра, обладающие рядом отличительных антибактериальных, оптических и электропроводящих свойств.
В данной работе наночастицы серебра сферической формы были получены в хитозановом растворе в уксусной кислоте, где хитозан выступал в роли восстановителя. С применением метода электроформования, описанном в работе [3] (рабочее напряжение составляло и=18кВ), были получены материалы на основе хито-зан-серебро с добавлением полиэтиленоксида, который
использовался для улучшения характеристик формуемого раствора для электроспиннинга.
Коллекторная система при формовании представляла собой 2 электрода напротив друг друга на расстоянии 4 см, что позволило получить образцы размером 2x4 см. Сопротивление полученных материалов по направлению укладки волокон составляло ~15 ГОм. Также было определено, что наночастицы серебра распределены по объёму волокна, размер волокон при этом неоднородный: от ~30 нм до ~1 мкм.
Вследствие высокой биологической активности хи-тозана и включению электропроводящих наночастиц серебра полученный материал перспективен для использования в качестве матрикса для ориентированного выращивания клеточных культур мышечных и нейронной тканей. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках соглашения № 075-15-2021-1357.
Литература:
1. Shabnam M., Javad M., Behnaz B. et al. International Journal of Biological Macromolecules. 2019. V. 140. P. 278.
2. Jiankang S., Stefan J.A., Jinlong S. et al. Nanomedicine: Nano-technology, Biology, and Medicine. 2016. V. 12 P. 1357.
3. Kashin A.V., Rebrov I.E., Khomich V.Yu. Applied physics. 2018. V. 3. P. 85.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА ЗАЖИВЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО ОЖОГА
М.В. Волкова1, В.В. Бояринцев1,
А.В. Трофименко1, С.П. Рыбалкин2, Е.В. Ковалева2,
Г.И. Фильков1, М.О. Дурыманов1
1 Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет), Долгопрудный, Россия
2 Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА России, НИЦ ТБП — филиал, Серпухов, п. Большевик, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: стволовые клетки, гипоксия, нормоксия, доклинические исследования, животная модель
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) являются одной из потенциальных стратегий лечения различного рода травм благодаря их способности стимулировать заживление и регулировать иммунный ответ. Культивирование клеток ex vivo в условиях пониженного содержания кислорода способствует усилению регенеративных свойств МСК [1-3]. Целью работы являлось экспериментальное изучение эффективности МСК, выращенных в условиях нормоксии и гипоксии, на экспериментальной модели химического ожога в условиях гипоксии и гипотермии.
Для проведения исследований использовались охарактеризованные МСК, выделенные из красного костного мозга мышей Balb/c. Одну клеточную популяцию культивировали в условиях нормоксии (21 % O2), другую — в условиях физиологической гипоксии (5 % O2). Химический ожог у животных получали с помощью 40 % раствора гидроксида калия. В течение двух суток (до и после нанесения травмы) животные находились в климатической камере в условиях гипотермии и гипоксии (4 оС, 15 % O2). Через сутки после нанесения травмы
животным вводили суспензию МСК или физраствор по периметру раны.
Подкожная инъекция МСК-гипоксия способствовала ускорению деквамации струпа в 2,3 и 1,4 раза, а также способствовала уменьшению площади раны в 1,2 и 2,3 раза по сравнению с группами МСК-нормоксия и контроль соответственно. Таким образом, суспензия МСК, выращенных в гипоксии, является перспективным способом лечения ожогов, в том числе полученных в экстремальных для организма условиях гипотермии и гипоксии. Работа выполнена при поддержке гранта по соглашению от 28 ноября 2018 года № 14.575.21.0179 (идентификатор проекта RFMEFI57518X0179), заключенному между Минобрнауки РФ и МФТИ.
Литература:
1. Han Y. et al. Cells. 2019. V. 8 (8). P. 886.
2. Fan X.L. et al. Cellular and molecular life sciences. 2020. V. 77 (14). P. 2771-2794.
3. Samal J.R. K. et al. Advanced Healthcare Materials. 2021. V. 10 (6). P. 2002058.
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ИПСК
ИЗ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА С МУТАЦИЕЙ
В ГЕНЕ GNAO1 ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ
НАСЛЕДСТВЕННОЙ ЭПИЛЕПСИИ
Е.А. Воловиков1, 2, Д.М. Спирин1, 2,
А.Н. Богомазова1
1 ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА России, Москва, Россия
2 Биологический факультет, МГУ
им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: ИПСК, GNAO1, нейроны, эпилепсия
Ген GNAO1 кодирует альфа-субъединицу гетеротри-мерного комплекса G-белков. Мутации в этом гене являются причиной ранней эпилептической энцефалопатии 17-го типа (РЭЭ17) [1]. Известно две белковых изофор-мы GNAO1 [2], но их функциональная значимость изучена недостаточно. Существующие животные модели РЭЭ17 не полностью воспроизводят молекулярную патологию заболевания [3]. Ввиду того, что РЭЭ17 является наследственным заболеванием с ранним появлением первых симптомов, особый интерес представляют молекулярные механизмы патогенеза на ранних стадиях развития организма. Таким образом, целью нашей работы стала разработка клеточной модели РЭЭ 17-го типа и изучение функций GNAO1 в эмбриогенезе.
Нами были получены фибробласты кожи от пациента с диагностированной РЭЭ17, которые затем репрограммировали до плюрипотентного состояния неинтегративным методом. Полученные ИПСК были охарактеризованы и обладают нормальным кариотипом. Направленной дифференцировкой из ИПСК с мутацией в гене GNAO1 и из ИПСК здоровых доноров были получены культуры нейронов и органоиды мозга. Экспрессию обеих белок-кодирующих изоформ GNAO1 в ИПСК, нейрональных предшественниках и органоидах показали на уровне РНК. Методом ИЦХ было показано, что в ИПСК GNAO1 локализован преимущественно в ядре, в то время как в зрелых нейронах он локализован преимущественно в цитоплазме.
Полученные данные позволяют предположить, что роль GNAO1 в раннем эмбриональном развитии
отличается от таковой в зрелом мозге и могут послужить базой для дальнейших исследований.
Литература:
1. Feng H. et al. Neurobiol Dis. 2018. 116:131-141
2. Murtagh J.J. Jr et al. Mol Cell Biol. 1991. 11(2):1146-1155
3. Feng H. et al. PLOS ONE. 2019. 14(1):e0211066
РЕГУЛЯЦИЯ АДИПОГЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ГЛЮКАГОНОПОДОБНЫМ ПЕПТИДОМ-1
Н.С. Волошин1, К.Ю. Кулебякин1, 2
1 Кафедра биохимии и молекулярной медицины, Факультет Фундаментальной Медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Лаборатория молекулярной эндокринологии, Институт регенеративной медицины МНОЦ МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: мезенхимные стволовые/стромальные клетки, адипогенная дифференцировка, адипогенез, ГПП-1, лираглутид, ДПП-4, алоглиптин.
В современном мире заболеваемость ожирением и сахарным диабетом неуклонно растет. В то же время фармакологическая индустрия предлагает все больше методов борьбы с этими заболеваниями, в частности, становятся популярнее препараты, относящиеся к сигнальной системе глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1) — агонисты рецептора ГПП-1 и ингибиторы ДПП-4. Однако в современной литературе данные о влиянии глюкагоноподобного пептида-1 на адипогенез, нарушение которого является ключевым звеном патогенеза метаболического синдрома, противоречивы: в исследованиях на клетках мыши продемонстрировано положительное влияние ГПП-1 на адипогенез [1], в то время как на клетках человека показано обратное [2]. Но работы, проведенные на клетках человека, обладают рядом недостатков, например, нет работ, проведенных на клетках, полученных от здоровых доноров.
Целью нашей работы является исследование влияния ГПП-1, его комбинации с ингибитором ДПП-4 алоглипти-ном, а также агониста ГПП-1 лираглутида на адипоген-ную дифференцировку мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) из подкожной жировой клетчатки живота, полученных от здоровых доноров.
Оценка адипогенной дифференцировки ММСК производилась при помощи флуоресцентной микроскопии с окраской Nile Red на 14-й день, ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией на гены-маркеры адипо-генной дифференцировки — PPARy и адипонектин. Также оценка динамики адипогенной дифференцировки производилась при помощи фазово-контрастной микроскопии клеток на протяжении нескольких дней с последующим автоматическим подсчетом клеток с жировыми каплями при помощи свёрточных нейронных сетей из модуля NIS. ai в ПО NIS Elements AR.
Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что ни лираглутид, ни комбинация ГПП-1 с ингибитором ДПП-4 алоглиптином не влияют на накопление клетками жировых капель, однако лираглутид значимо изменяет экспрессию адипонектина и PpARy, что наблюдается в гораздо меньшей степени для комбинации ГПП-1 и ало-глиптина и совсем не наблюдается для только ГПП-1.
