CC BY
13
блеомицина и через 14 дней интратрахеально вводили суспензию исследуемых ВВсенМСК, ВВконтрМСК в качестве положительного контроля или раствор DMEM в качестве отрицательного контроля. Мышам выполняли МРТ легких в динамике и на 28 день после введения блеомицина после эвтаназии забирали бронхоальвеоляр-ный лаваж (БАЛ) и легкие для гистологической оценки.
Нам удалось показать, что по результатам МРТ баланс регенерации в легких молодых мышей при лечении блеомицин-индуцированного фиброза смещается в сторону восстановления нормальной ткани при введении как ВВконтрМСК, так и ВВсенМСК на 1 4 день терапии (хотя для последних намечается тенденция к снижению эффективности).
У старых мышей терапия ВВконтрМСК способствует эффективному восстановлению функциональной ткани, в то время как ВВсенМСК оказываются не способны уменьшить площадь повреждения легких.
Помимо показанной нами ранее способности се-кретома МСК подавлять дифференцировку миофибро-бластов, важным механизмом его антифибротического действия in vivo может выступать модуляция местного иммунного ответа. Проанализировав состав (БАЛ) старых и молодых мышей с блеомицин-индуцированным фиброзом легких, мы обнаружили значительное повышение базального суммарного количества клеток основных гемопоэтических линий в БАЛ старых мышей и в этой же группе выявили тенденцию к снижению после введения ВВконтрМСК, но не ВВсенМСК.
Таким образом, индуцированная профиброзным микроокружением сенесценция МСК приводит к снижению антифибротического потенциала секретируемых этими клетками ВВ, что проявляет себя особенно ярко при наличии сопутствующих возраст-ассоциированных изменений в тканях, за счет механизмов, не ограничивающихся дифференцировкой миофибробластов в зоне повреждения. Исследование выполнено при поддержке РФФИ (№ 19-29-04172).
RTCA-ПРОФИЛИРОВАНИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК В РАМКАХ ЭКСПЕРТИЗЫ КАЧЕСТВА
М.А. Водякова, Е.В. Мельникова, В.А. Меркулов
ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России, Москва, Россия e-mail: [email protected]
Ключевые слова: клеточная линия, подлинность, экспертиза качества, биомедицинский клеточный продукт, высокотехнологический лекарственный препарат
В рамках экспертизы качества при государственной регистрации клеточных продуктов подтверждается подлинность клеточной линии. Пролиферативная активность клеточной линии является одной из характеристик ее подлинности. Перспективным методом определения пролиферативной активности является использование клеточного анализатора в режиме реального времени xCELLigence.
Цель исследования — получить и сравнить RTCA-профили (real time cell analyzer) клеточной линии МСК Ж^122 на 10 и 12 пассажах.
Клеточная линия МСК Ж^122 — МСК из ЖТ 42-летнего донора получена из «Коллекции клеточных культур для биотехнологических и биомедицинских исследований (общебиологического и биомедицинского направления)» (уникальная научная установка)
Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. RTCA-профили получали с помощью клеточного анализатора xCELLigence RTCA DP (Agilent, США) по протоколу анализа клеточного индекса производителя в течение 120 ч.
Были показаны различные кинетические профили на 10 и 12 пассажах. Время удвоения клеток составило 41 ч для 10 пассажа и 54 ч — для 12. Максимальный клеточный индекс для 10 пассажа достигал 6, в то время как для 12 пассажа это значение было не выше 4,7. Скорость пролиферации на 10 пассаже была в 1,3 раза выше. Полученные результаты свидетельствуют о том, что RTCA-профилирование способно показывать не только разницу между различными клеточными линиями, но и разницу между пассажами одной клеточной линии, что характеризует метод как высокоточный и пас-сажеспецифичный и допускает возможность его применения при оценке качества продуктов на основе жизнеспособных клеток человека. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00001-22-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 121021800098-4).
НАРУШЕНИЯ ГОМЕОСТАЗА ЖИРОВОЙ ТКАНИ ПРИ СТАРЕНИИ СВЯЗАНЫ С РАЗВИТИЕМ ИНСУЛИНОРЕЗИСТЕНТНОСТИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК
Е.С. Войнова1, П.А. Тюрин-Кузьмин1, К.Ю. Кулебякин1, О.А. Григорьева2, Е.С. Новоселецкая2, Н.А. Басалова2, Н.А. Александрушкина2, М.С. Арбатский2, М.А. Виговский2, А.А. Зиновьева1, Е. Бахчинян1, А.Ю. Ефименко2
1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт регенеративной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: старение, мезенхимные мультипотент-ные стромальные клетки, инсулинорезистентность, внеклеточные везикулы, секретом МСК.
В пожилом возрасте часто развивается ожирение и диабет 2 типа — заболевания, связанные с нарушениями обмена жировой ткани. За обновление жировой ткани ответственны мультипотентные мезенхимные стромаль-ные клетки (МСК), дифференцирующиеся под действием инсулина. Именно с нарушением чувствительности к данному гормону связывают метаболические нарушения, возникающие при старении.
Цель нашего исследования — выяснение механизмов нарушения чувствительности МСК к инсулину при старении.
Методы. В работе использовались МСК подкожной жировой клетчатки, полученные от молодых и пожилых доноров, а также репликативно состарившиеся МСК, проявляющие признаки сенесценции. Для стимуляции дифференцировки МСК использовали редуцированный адипогенный коктейль (инсулин, дексаметазон, IBMX). Четвертый компонент — индометацин — прямой активатор мастер-гена адипогенной дифференцировки PPARy не использовался, так как нашей задачей было изучение физиологических путей активации данного фактора.
Для оценки эффективности дифференцировки использовали цитофлуоресцентное окрашивание красителем NileRed. Методом ПЦР в реальном времени оценивалась экспрессия ключевых маркеров дифференцировки. Внеклеточные везикулы (ВВ) получали кондиционированием клеток в течение 2 суток. Для концентрирования ВВ использовали центрифужные ультрафильтры-концентраторы. Для оценки активности инсулин-зависимых внутриклеточных сигнальных каскадов использовался метод иммуноблоттинга.
Результаты. При старении происходило значительное снижение адипогенного потенциала МСК, связанное с развитием инсулинорезистентности. Это было обусловлено повышением базального уровня активации Erk1/2 и Akt — основных участников инсулиновой сигнализации. Далее мы выяснили, участвует ли секретом се-несцентных МСК в развитии их инсулинорезистентности. Проанализировав транскриптом секретома сенесцент-ных МСК в сравнении с молодыми, мы обнаружили, что сенесцентные МСК продуцировали ВВ с повышенным содержанием микроРНК, мишенями которых являются молекулы, участвующие в развитии и регуляции адипо-генных сигналов в клетке и в сигнальном ответе на инсулин. Добавление ВВ от молодых МСК к сенесцентным клеткам восстанавливало адипогенный потенциал, а добавление ВВ от сенесцентных МСК к молодым клеткам — снижало. Добавление к молодым МСК ВВ от сенесцент-ных клеток приводило к повышению в них базального уровня активации Erk и Akt.
Таким образом, при старении происходит снижение адипогенного потенциала МСК, связанное индукцией инсулинорезистентности компонентами секретома се-несцентных клеток. Исследование поддержано грантом РФФИ № 19-29-04172 мк.
ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ЭЛЕКТРОПРОВОДЯЩИЙ
МАТЕРИАЛ НА ОСНОВЕ КОМПОЗИТА
ХИТОЗАН-СЕРЕБРО С ДОБАВЛЕНИЕМ
ПОЛИЭТИЛЕНОКСИДА
Д.А. Волков1, И.Е. Ребров2, Т.Е. Григорьев1
1 НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
2 ИЭЭ РАН, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: электроспиннинг, хитозан, серебро, поли-
этиленоксид, электропроводящие материалы.
В последнее время технология электроспиннинга стала универсальным методом получения нетканых материалов с довольно обширной возможностью использовать их в разных областях, включая медицину. В частности, ряд различных нановолокон на основе хи-тозана привлекает большое внимание благодаря возможности их применения в таких направлениях, как тканевая инженерия [1], доставка лекарств [2] и т. д. Одним из перспективных наполнителей хитозановых волокон являются наночастицы серебра, обладающие рядом отличительных антибактериальных, оптических и электропроводящих свойств.
В данной работе наночастицы серебра сферической формы были получены в хитозановом растворе в уксусной кислоте, где хитозан выступал в роли восстановителя. С применением метода электроформования, описанном в работе [3] (рабочее напряжение составляло и=18кВ), были получены материалы на основе хито-зан-серебро с добавлением полиэтиленоксида, который
использовался для улучшения характеристик формуемого раствора для электроспиннинга.
Коллекторная система при формовании представляла собой 2 электрода напротив друг друга на расстоянии 4 см, что позволило получить образцы размером 2x4 см. Сопротивление полученных материалов по направлению укладки волокон составляло ~15 ГОм. Также было определено, что наночастицы серебра распределены по объёму волокна, размер волокон при этом неоднородный: от ~30 нм до ~1 мкм.
Вследствие высокой биологической активности хи-тозана и включению электропроводящих наночастиц серебра полученный материал перспективен для использования в качестве матрикса для ориентированного выращивания клеточных культур мышечных и нейронной тканей. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках соглашения № 075-15-2021-1357.
Литература:
1. Shabnam M., Javad M., Behnaz B. et al. International Journal of Biological Macromolecules. 2019. V. 140. P. 278.
2. Jiankang S., Stefan J.A., Jinlong S. et al. Nanomedicine: Nano-technology, Biology, and Medicine. 2016. V. 12 P. 1357.
3. Kashin A.V., Rebrov I.E., Khomich V.Yu. Applied physics. 2018. V. 3. P. 85.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА ЗАЖИВЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО ОЖОГА
М.В. Волкова1, В.В. Бояринцев1,
А.В. Трофименко1, С.П. Рыбалкин2, Е.В. Ковалева2,
Г.И. Фильков1, М.О. Дурыманов1
1 Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет), Долгопрудный, Россия
2 Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА России, НИЦ ТБП — филиал, Серпухов, п. Большевик, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: стволовые клетки, гипоксия, нормоксия, доклинические исследования, животная модель
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) являются одной из потенциальных стратегий лечения различного рода травм благодаря их способности стимулировать заживление и регулировать иммунный ответ. Культивирование клеток ex vivo в условиях пониженного содержания кислорода способствует усилению регенеративных свойств МСК [1-3]. Целью работы являлось экспериментальное изучение эффективности МСК, выращенных в условиях нормоксии и гипоксии, на экспериментальной модели химического ожога в условиях гипоксии и гипотермии.
Для проведения исследований использовались охарактеризованные МСК, выделенные из красного костного мозга мышей Balb/c. Одну клеточную популяцию культивировали в условиях нормоксии (21 % O2), другую — в условиях физиологической гипоксии (5 % O2). Химический ожог у животных получали с помощью 40 % раствора гидроксида калия. В течение двух суток (до и после нанесения травмы) животные находились в климатической камере в условиях гипотермии и гипоксии (4 оС, 15 % O2). Через сутки после нанесения травмы
