ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫЙ ПРОДУКТ ИЗ ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ РАН
А.А. Кондратенко, Д.В. Товпеко, Л.И. Калюжная, В.Е. Чернов
Военно-медицинская академия им.СМ. Кирова, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: kondraa24@gmail.com
Ключевые слова: регенеративная медицина, раневое покрытие, Вартонов студень пуповины человека, децеллюляри-зация, неиммуногенность, цитотоксичность.
Создание продуктов для реконструкции поврежденных тканей является актуальной задачей биомедицинских исследований. В лаборатории тканевой инженерии Военно-медицинской академии изготовлен неиммуно-генный биотехнологический продукт, состоящий из бесклеточного Вартонова студня пуповины человека, обладающего регенеративными свойствами.
Цель исследования — оценить влияние биотехнологического продукта из пуповины на метаболическую активность фибробластов дермы человека in vitro и заживление ран in vivo.
Метод детергентной децеллюляризации Вартонова студня в нашей модификации позволил получить тканеинженерный продукт, сохраняющий регенеративные свойства исходного биоматериала [1]. Цитотоксичность продукта тканеинженерного продукта исследовали с помощью колориметрического теста метаболической активности дермальных фибро-бластов человека. Влияние препарата на заживление полнослойных кожных ран изучали на белых мышах. Животным контрольной группы тканеинженерный продукт в рану не вводили.
Биотехнологический продукт не проявляет цито-токсических свойств. Формирование грануляционной ткани на дне дефекта протекает более динамично при наличии в ране бесклеточного продукта. Он послужил адгезивной подложкой для клеток с фибробластопо-добной морфологией. При этом массивной лейкоцитарной инфильтрации и отека в перифокальных областях не выявлено.
Нецитотоксический бесклеточный матрикс пуповины человека может быть идеальным субстратом для адгезии и колонизации пациент-специфическими клетками при использовании в качестве раневого покрытия при глубоких повреждениях кожи и мягких тканей [2].
Литература:
1. Калюжная-Земляная Л.И., Чернов В.Е., Пат. РФ № 2745995. Приоритет изобретения 16 сентября 2020 г.
2. Калюжная Л.И., Соколова М.О., Чернов В.Е и соавт. Гены & Клетки — 2021. — Т. XVI — № 3. — С.72-79.
ВЛИЯНИЕ МУТАЦИИ G2019S В КИНАЗЕ LRRK2 НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МИТОХОНДРИЙ И МИТОФАГИЮ В ИЗОГЕННОЙ КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
И.В. Копылова1, К.С. Майорова1,
В.А. Вигонт2, Д.А. Грехнев2, А.Н. Богомазова1,
О.С. Лебедева1, М.А. Лагарькова1, 3
1 ФГБУ ФНКЦ Физико-химической медицины ФМБА, Москва, Россия
2 ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
3 ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: ikopylova.msu@gmail.com
Ключевые слова: болезнь Паркинсона, дофаминэргиче-ские нейроны, митохондрии, окислительный стресс, клеточные модели, митофагия, ИПСК, технология CRISPR/Cas9.
Болезнь Паркинсона (БП), приводящая к дегенерации дофаминэргических нейронов (ДН), значительно снижает уровень жизни пациентов и при прогрессировании приводит к их смерти. В качестве одной из составляющих патогенеза БП рассматривают митохондриальную дисфункцию в ДН. Для исследования патогенеза БП на клеточном и субклеточном уровнях в настоящее время используют модели на основе ДН, которые получают путем дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) пациентов с наследственными формами БП. В качестве контроля при этом используют изогенные линии ИПСК, в которых патогенная мутация исправлена. Это позволяет избежать влияния на результаты исследования индивидуального генетического фона пациента.
Аутосомно-доминантная мутация G2019S в гене PARK8, кодирующем киназу LRRK2, является наиболее частой причиной наследственных форм БП. В норме LRRK2 участвует в поддержании цитоскелета, обмене митохондрий, ауто- и митофагии [1; 2; 3]. В нашей лаборатории из ИПСК пациента с мутацией G2019S при помощи технологии CRISPR/Cas9 были получены изогенные линии ИПСК с различными аллельными состояниями гена PARK8. Для моделирования БП изогенные линии ИПСК и линии ИПСК от здоровых доноров дифференцировали в функционально активные постмитотические ДН с чистотой популяции 90-99%. Изменения морфологии нейритов, количества и локализации аутофагосом и митохондрий в ДН в зависимости от аллельного состояния PARK8 согласуются с данными литературы [4], что свидетельствует о возможности применения этой системы для моделирования БП. В данной работе с использованием созданной модели БП мы изучали функциональное состояние митохондрий и митофагию в ДН.
Нами показано, что мембранный разобщитель СССР достоверно усиливает митофагию в ДН пациента, если в нейронах присутствует хотя бы одна нормальная копия гена PARK8, но не в ДН, полученных из ИПСК здоровых доноров, что говорит о большей чувствительности ДН пациента к стрессовым воздействиям. Индуктор аутофагии трегалозу рассматривают в качестве возможного средства вспомогательной терапии при ней-родегенеративных заболеваниях [5]. Нами продемонстрирована способность трегалозы активировать митофагию в ДН и повышать митохондриальный мембранный потенциал во всех линиях нейронов, кроме линии, гомозиготной по мутации G2019S. Требуются
дальнейшие исследования для изучения влияния трега-лозы на функциональную активность ДН. Мы благодарим Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФНКЦ ФХМ ФМБА за предоставление ресурсов для этого проекта.
Литература:
1. Plowey E.D. et al. J. of Neunochemistny. 2008. V. 105. № 3. P. 1048.
2. Wang X. et al. Human Molecular Genetics. 2012. V. 21. № 9. P. 1931.
3. Singh F. et al. Elife. 2021. V. 10. P. e67604.
4. Yue M. et al. Neurobiology of Disease. 2015. V. 78. P. 172.
5. Wang Y. et al. Neurotoxicity Research. 2018. V. 34. № 1. P. 109.
РОЛЬ РЕЦЕПТОРА ЭПИДЕРМАЛЬНОГО РОСТА И ЕГО ЛИГАНДОВ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
Е.С. Корнилова1, 2, М.В. Харченко1, Р.С. Каменцева1
1 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: elena.kornilova@gmail.com
Ключевые слова: эндометриальные мезенхимные стро-мальные клетки, рецептор эпидермального фактора роста, лиганды, эндоцитоз, пролиферация, дифференцировка.
В последние годы существенный прогресс был достигнут в выявлении специфических механизмов регуляции жизнедеятельности меземхимных стволовых клеток, однако участие в функционировании МСК сигнальных систем, традиционно считающихся типичными для нестволовых клеток организма, практически не изучены. К таким системам относится тирозинкиназный рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и его лиганды. Интересно, что трансформированный статус линий, полученных из карцином, связывают с оверэк-спрессией EGFR, тогда как по нашим данным уровень EGFR в стромальных клетках эндометрия человека (энМСК), также как и в МСК другого тканевого происхождения, сравним с таковым в клетках линий HeLa и А549, при сохранении «нормальности» энМСК. Очевидно, сравнительный анализ функционирования EGFR-зависимой системы в МСК и опухолевых клетках представляется весьма актуальным.
Сигнальная функция EGFR определяется активацией тирозинкиназы рецептора при формировании комплексов с его лигандами. К настоящему времени известно 7 лигандов, различающихся по аффинности к рецептору и сигнальным ответам, что позволяет осуществлять тонкую настройку системы в зависимости от контекста. Считается, что связывание лиганда с рецептором на плазматической мембране приводит к активации сигнальных каскадов и интернализации лиганд-рецептора в эндосо-мы. Мы обнаружили существенные отличия в организации эндоцитозного аппарата, динамики эндоцитоза и продукции перекиси водорода в энМСК по сравнению с HeLa под действием высокоаффинных лигандов EGF и TGF-a. Существенно, что в энМСК, в отличие от HeLa, уровень рецептора после его деградации в лизосомах не восстанавливается после удаления лигандов из среды. Показано, что EGF и TGF-a стимулируют пролиферацию энМСК, но не HeLa, в то время как низкоафинный лиганд AREG
не интернализуется в клетках обоих типов, оказывая ми-тогенный эффект только на Не1_а. Анализ влияния лигандов БЭРП на децидуальную дифференцировку энМСК показал, что БЭР и ТЭР-а, но не АПБЭ, подавляют этот процесс БЭРП-зависимым образом. Мы предполагаем, что сигнальная система рецептора БЭР и его лигандов может быть вовлечена в координацию фаз цикла, в частности, за счет контроля уровня и рецептора, и его лигандов как с помощью эндоцитоза, так и синтеза этих белков. Обсуждаются возможные механизмы «диалога» лигандов к рецептору и причины различий в ответах энМСК и трансформированных клеток. Работа частично финансировалась за счет средств гранта РФФИ № 20-04-00927.
МАЛАЯ СУБПОПУЛЯЦИЯ КЛЕТОК, НЕСУЩИХ НА ПОВЕРХНОСТИ ИНСУЛИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР, РЕГУЛИРУЮТ АДИПОГЕННУЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ
Е.Р. Корчагина, Н.С. Волошин, К.Ю. Кулебякин
Кафедра биохимии и молекулярной медицины, Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: korchagina.liza@mail.ru
Ключевые слова: МСК, адипогенез, инсулиновый рецептор, инсулинорезистентность.
В последнее время появляется все больше данных об особых функциональных популяциях жировой ткани, которые обнаруживаются как среди предшественников адипоцитов — в мезенхимных стволовых клетках (МСК) [1], так и среди зрелых клеток жировой ткани, в которой существует минимум 3 различных функциональных популяции клеток [2]. В ходе наших работ было показано наличие в первичной культуре МСК жировой ткани малой субпопуляции клеток, несущих на поверхности ин-сулиновый рецептор, и их возможное регуляторное влияние на адипогенную дифференцировку культуры. Для изучения данного явления была выбрана модель нарушения функции — первичная культура МСК жировой ткани доноров с подтверждённой инсулинорезистентностью.
Первичные культуры подвергали иммунохимическо-му окрашиванию антителами к внеклеточному домену инсулинового рецептора и выделяли малую субпопуляцию методом проточной цитометрии. Далее проводили адипогенную дифференцировку в присутствии инсулина в условиях неконтактного сокультивирования малой субпопуляции с обеднённой данными клетками. Оценка диф-ференцировки проводилась при помощи определения транскриптов PPARy и AdipoQ (RealTime PCR) и флуоресцентной микроскопии с окрашиванием NileRed и DAPI.
При выделении малой субпопуляции обнаружилось, что содержание данных клеток у здоровых и инсулинре-зистентных доноров различается (5-12% и 0-3,5% соответственно). Малая субпопуляция не отвечает на ади-погенную дифференцировку, в то время как обеднённая популяция дифференцируется менее интенсивно, чем интактная. При неконтактном сокультивировании обнаруживается усиление дифференцировки обеднённой субпопуляции, полученной из здоровой ткани. Усиление дифференцировки происходит как в случае сокульти-вирования с малой субпопуляцией того же происхождения, так и с выделенной из инсулинорезистентной ткани. Одновременно с этим, инсулинрезистентная обеднённая субпопуляция не показывает усиления дифференцировки