CC BY
4
246
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
ВЛИЯНИЕ ЛИГАНДОВ РЕЦЕПТОРА ЭФР НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
М.В. Харченко1, Р.С. Каменцева1, Е.С. Корнилова1, 2
1 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: эндометриальные мезенхимные стро-мальные клетки, рецептор эпидермального фактора роста, дифференцировка, пролиферация, EGF, TGF-a, AREG, Hyper.
Общепринятые представления о передаче сигнала и эндоцитозе рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) получены при исследовании постоянных линий трансформированных клеток эпителиального происхождения (например, линий HeLa и A549), обладающих повышенной экспрессией рецептора. Однако, по нашим данным, повышенная экспрессия EGFR наблюдается также и в эндометриальных мезенхимных стромальных клетках (энМСК) человека, а также в МСК других типов. Поскольку МСК можно рассматривать как модель нормальных клеток в культуре, актуальной задачей является изучение роли сигнальной системы, опосредуемой EGFR, в регуляции функционирования этих клеток. Известно, что сигналы EGFR стимулируются его лиган-дами, различающимися, в частности, по аффинности к рецептору. Так, в отличие от EGF и TGF-a, низкоаффинный лиганд амфирегулин (AREG) не вызывает интерна-лизацию EGFR как в энМСК, так и в HeLa. Также обнаружено, что AREG не влияет на пролиферацию в энМСК, тогда как EGF и TGF-a ее ускоряют. Опухолевые клетки, напротив, быстрее пролиферируют в присутствии AREG. Методом проточной цитометрии мы оценили концентрацию пероксида водорода в цитоплазме клеток HeLa и энМСК, которые были трансфекцированы лентиви-русами, несущими ген сенсора к H2O2 — белка Hyper. Образование H2O2 в ходе эндоцитоза связано с активацией NADPH-оксидазы на мембранах эндосом и ли-зосом. Повышение цитоплазматической концентрации H2O2 приводит к увеличению интенсивности эмиссии Hyper при его возбуждении монохроматическим излучением 488 нм и к уменьшению — при возбуждении световой волной 405 нм. Hyper-ratio (F488/F405) прямо пропорционально концентрации H2O2. Так, в суспензионных пробах клеток линии HeLa, к которым был добавлен EGF, Hyper ratio оказался выше, чем в контрольных, уже через 10 мин после добавления фактора роста и продолжает увеличиваться, выходя на плато после 30 мин. В то же время, добавление EGF в энМСК не отразилось на Hyper ratio. Инкубация энМСК с 8-Br-cAMP и прогестероном приводила к стимуляции децидуальной диффе-ренцировки клеток. Однако, добавление EGF и TGF-a одновременно с 8-Br-cAMP и прогестероном препятствует стимуляции децидуальной дифференцировки, причем этот эффект опосредуется EGFR-зависимыми сигнальными путями, поскольку блокируется AG1478 — ингибитором тирозинкиназной активности EGFR. Кроме того, AG1478 значительно повышает секрецию IGFBP1 даже при дифференцировке в отсутствие лигандов EGFR. В отличие от первых двух лигандов, AREG не препятствовал дифференцировке. Мы предполагаем, что эффект EGF и TGF-a регулируется на уровне эндоцитоза лиганд-ре-цепторных комплексов, подавляя дифференцировку
на пролиферативной стадии цикла, в то время как AREG функционирует на секреторной стадии. Работа поддержана грантом РФФИ № 20-04-00927.
АКТИВАЦИЯ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ NOTCH
В ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ПРИВОДИТ
К ИЗМЕНЕНИЮ РЕПЕРТУАРА ГИСТОНОВ 1
И.А. Хворова1, Е.А. Репкин2, Д.А. Переплетчикова1,
Д.А. Костина1, А.Б. Малашичева1, А.А. Лобов1
1 Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: Notch, гистон 1, эндотелий, HUVEC, гисто-
новый код, эпигеном, секретом, напряжение сдвига.
Эндотелий, выстилающий стенки сосудов и капилляров, играет ключевую роль в функционировании сердечно-сосудистой системы и передачи сигналов из кровотока в подлежащие ткани. Нарушения функции эндотелия, эндотелиальная дисфункция, связана с широким спектром заболеваний и восстановление функции эндотелия — это перспективная терапевтическая мишень [1].
Известно, что поддержание базового уровня активации сигнального пути Notch в эндотелии необходимо для поддержания эндотелиального фенотипа, а дисре-гуляция Notch связана с эндотелиальной дисфункцией [2]. Сигнальный путь Notch имеет дозозависимый эффект [3], и мы предполагаем, что длительная гиперактивация этого сигнального пути может приводить к накоплению эпигенетических изменений, которые значительно повышают риски развития сердечно-сосудистых заболеваний.
Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели анализ пост-трансляционных модификаций гистонов и изменений секретомного профиля эндотелиальных клеток в ответ на активацию сигнального пути Notch. Активацию Notch проводили при помощи лентивирусной трансдук-ции эндотелиальных клеток пупочного канатика человека (HUVEC) конструкцией для сверхэкспрессии внутриклеточного домена NOTCH1 (N1ICD). После трансдукции N1ICD или контрольной конструкцией, проводили сбор секретома и выделение гистонов, после чего образцы анализировали при помощи протеомики-дробовика на платформе TimsToF Pro (Bruker).
Активация сигнального пути Notch приводила к понижению уровнях PTX3, SERPINE1 и THBS1 в секретоме эндотелиальных клеток. Секреция этих белков эндотелием играет важное значение в поддержании гомеостаза, и снижение их экспрессии под действием Notch хорошо согласуется с литературными данными о том, что дисре-гуляция этого сигнального пути приводит к эндотелиаль-ной дисфункции.
При анализе гистонов мы не нашли статистически достоверных различий в пост-трансляционных модификациях гистонов 2 и 3, однако выявили существенное изменение экспрессии нескольких гистонов 1 (H1). Активация сигнального пути Notch приводит к повышению экспрессии N-ацетилированных форм H1-0, H1-3, H1-4, H1-5, H1-10. Гистон 1 изучен меньше других ги-стонов, однако мы предполагаем, что как и в случае других гистонов, изменение репертуара гистонов 1 может быть связано с эпигенетической регуляцией экспрессии генов. Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ № 18-14-00152.
Гены & Клетки XVII, №3, 2022
