CC BY
7
УДК 619:636.4:636.087.8
МУТАГЕННАЯ БЕЗАСНОСТЬ МИКРОКАПСУЛИРОВАННОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА «ЭНЗИМСПОРИН» С ФЕРМЕНТОМ, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КОРМЛЕНИИ СВИНЕЙ СЕЛЕКЦИИ «GENESUS»
ГОРОБЕЦ А. Ю.,
аспирант кафедры физиологии и химии имени профессора А.А. Сысоева, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 54-14-04.
ТРУБНИКОВ Д.В.,
кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии и химии имени профессора А.А. Сысоева, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 54-14-04.
ТРУБНИКОВА Е.В.,
доктор биологических наук, заведующий научно-исследовательской лабораторией НИЛ «Генетика», ФГБОУ ВО Курский государственный университет, тел. 70-32-34.
БЕЛОУС А.С.,
кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник научно-исследовательской лабораторией «Генетика», ФГБОУ ВО Курский государственный университет, тел. 70-32-34.
Реферат. В статье приведены результаты исследований на мутагенную безопасность микро-капсулированного пробиотического препарата «Энзимспорин» с трипсином кристаллическим, изготовленного по оригинальной технологии. Исследования основывались на индукции хромосомных аберраций in vivo и анализом клеток костного мозга у крыс с учётом пола и дозировок (однократное введение суточной терапевтической дозы, суточной субтоксической дозы, введение в течение 5 суток суточной терапевтической дозы). В качестве отрицательного контроля при этом был использован 1% клейстер на основе крахмала, в качестве положительного контроля был использован Циклофосфан. Анализ результатов не выявил ни дозозависимого, невоспроизводимого в разных сериях исследования статистически значимого превышения доли клеток с хромосомными аберрациями в получавших исследуемый препарат сериях исследования по сравнению с отрицательным и положительным контролями. На основании результатов исследования сделан вывод о мутагенной безопасности препарата, что дает основание для его дальнейшего применения в качестве добавки к применяемым кормам используемых в кормлении свиней селекции «Genesus».
Ключевые слова: микрокапсулированный пробиотический препарат с ферментом; «Энзимспорин»; крысы линии Wistar; мутагенез; хромосомная абберация; хромосомы; эвтаназия; цито-генетический препарат; лабораторные животные.
MUTAGENIC SAFETY OF MICROENCAPSULATED PROBIOTIC "ENZYMESPORINE" WITH AN ENZYME THAT IS USED IN THE FEEDING OF PIGS OF GENESUS GENETICS
GOROBETS A.Yu.,
post-graduate student of the Department of physiology and chemistry named after A.A. Sysoyev of FSBEI of HE Kursk State Agricultural Academy, tel. 54-14-04.
TRUBNIKOV D. V.,
candidate of Biological Sciences, associate Professor of the Department of physiology and chemistry named after A.A. Sysoyev of FSBEI of HE Kursk State Agricultural Academy, tel. 54-14-04.
TRUBNIKOVA E.A.,
doctor of Biological Sciences, Head of the Science and Research Laboratory "Genetika" of FSBEI of HE Kursk State University, tel. 70-32-34.
BELOUS A.S.
candidate of Medical Sciences, Senior Researcher at the Research Laboratory "Genetika" of FSBEI of HE Kursk State University, tel. 70-32-34.
Essay. In the article there are presented the results of researches of mutagenic activity of the microencapsulated probiotic preparation "Enzymesporine" with crystalline trypsin, that was made according to the original technology. The researches were based on on the induction of chromosomal aberrations in vivo and analysis of cells of bone marrow in rats taking into account gender and dosages (single injection of a daily therapeutic dose, daily subtoxic dose, administration during 5 days of a daily therapeutic dose). As negative control there was used 1% starch-based paste, as positive control there was used Cyclophosphane. Analysis of the results did not reveal neither a dose-dependent nor reproduced in different series of the research a statistically significant excess of the proportion of cells with chromosomal aberrations in the series of the research that received studied preparation in comparison with the negative and positive controls. On the basis of results of research there was made a conclusion about the mutagenic safety of the preparation, which gives grounds for its further use as an additive to the feeds used in feeding of pigs of Genesus genetics.
Keywords: Microencapsulated probiotic preparation with enzyme; "Enzymesporine"; Wistar rats; mutagenesis; chromosomal aberration; chromosomes; euthanasia; cytogenetic preparation; laboratory animals.
Введение. На сегодняшний день пробиоти-ческие препараты используются как средство, способное стимулировать иммунную реакцию организма и, тем самым, имеющее потенциал для сохранности и укрепления гомеостатиче-ских процессов [1. - C. 118-124, 2. - С. 443-454]. Также пробиотики могут быть применены в медицинских целях: среди полезных эффектов можно выделить профилактику колоректально-го рака (КРР), лечение и профилактику диареи, эрадикацию Helicobacter pylori, профилактику и лечение печеночной энцефалопатии, коррекцию иммунного ответа, противовоспалительную профилактику болезни кишечника; снятие синдрома раздраженного кишечника, колик; улуч-
шение всасываемости лактозы; лечение некротического энтероколита; облегчение течения неалкогольной жировой болезни печени; профилактика системных инфекций; облегчение функционального запора; и другие [3. - С. 9599, 4. - С. 77-84, 5. - С. 100-118].
В нашей работе был применён микрокапсу-лированный препарат «Энзимспорин» с ферментом (), произведённый по технологии, описанной в патенте РФ №2689164 [6] и усовершенствованной по методике, описанной в патенте РФ №2736377 [7].
Материалы и методы исследования. Схема эксперимента представлена на рисунке 1.
Крысы Rattus Norvegicus, линия Wistar, средний вес 250,44 ± 20,99 г
х1 - однократное введение препарата - эвтаназия на в 2-й день (через сутки после последней дозы). Первая часть
х5 - пятикратное введение препарата - введение препарата на 5-й день (через 5-6 часов после последней дозы). Вторая часть
Рисунок 1 - Схема эксперимента
Ухудшения состояния у тестируемых животных на протяжении всего времени не наблюдалось.
Выведение крыс из эксперимента осуществлялась наркотизацией этиловым эфиром.
Как видно из рисунка, эксперимент по проверке синтезированного МППФ «Энзим-спорин» был разделён на две части. В первой части манипуляции проводили в двух подгруппах: проверяли действие суточной терапевтической доза (Т 1) и действие субтоксической дозы (С 1) при однократном введении. Костный мозг получали на 25-м часу после введения веществ. В обе подгруппы были включены только самцы.
Во второй части манипуляции проводились как на самцах, так и на самках. Вещества вводили в терапевтической для человека дозе (Т 5). Костный мозг фиксировали на седьмом часу после введения.
Расчёт дозировок был сделан в соответствии с рекомендациями, описанными в рекомендации Миронова по проведению клинических испытаний [8].
Расчёт дозировок веществ, количества животных, количества цитогенетических препаратов при проведении проверки на мутагенную активность представлена в таблице 1.
В соответствии с общепринятыми методиками было стандартизировано проведено извлечение клеток и приготовление препаратов для цитогенетического анализа (от каждого животного по два стекла). С целью приготовления цитогенетических препаратов клеток костного мозга крови млекопитающих препараты подвергли окрашиванию и шифрованию. От каждого животного был проведён анализ по 100 метафаз. Для крыс были взяты в анализ, без наложений хромосом, округлые мета-фазные пластинки с модальным числом 42 (41-43). Были учтены в определённом количестве одиночные и парные фрагменты, обмены хромосом и хроматид, ахроматические пробелы (гепы), а также некоторое число клеток со множеством дефектов и клеток с тотальной хромосомной фрагментацией.
Для проведения цитогенетических исследований был использован извлечённый из костей (локтевой, большеберцовой и бедренной) костный мозг подопытных животных, подвергшийся вымыванию физическим раствором в небольшом количестве и помещённый в стерильные флаконы для доставки в генетическую лабораторию. Были получены прямым методом хромосомные препараты (без культивирования) [9].
Таблица 1 - Расчёт дозировок веществ, количества животных, количества цитогенетических
препаратов при проведении проверки на мутагенную активность М1ШФ «Энзимспорин»
№ Крысы Стекла
I группа. I подгруппа (Т 1) ^1, орально. 21 крыса) 21 42
1.1 МППФ «Энзимспорин» 280 мг/кг/сутки 7 14
1.2 1% клейстер 280 мг/кг/сутки 7 14
1.3 Циклофосфан 20 мг/кг/сут 7 14
Костный мозг. Выведение на 25-м часе после введения тестеров
I группа. II подгруппа (С 1) ^1, орально. 21 крыса) 21 42
2.1 МППФ «Энзимспорин» 2800 мг/кг/сутки 7 14
2.2 1% клейстер 2800 мг/кг/сутки 7 14
2.3 Циклофосфан 20 мг/кг/сут 7 14
Костный мозг. Выведение на 25-м часе после введения тестеров
II группа (Т 5). ^1, орально. 5 дней. 24 крысы (4+4)) 12+12 48
3.1 МППФ «Энзимспорин» 280 мг/кг/сутки 4+4 16
3.2 1% клейстер 280 мг/кг/сутки 4+4 16
3.3 Циклофосфан 20 мг/кг/сут 4+4 16
Костный мозг. Вывод через 6 часов после последнего ввода
Препараты: с одного животного - по 2 стекла; Анализ: с одного животного - по 100 метафаз
Сама процедура приготовления цитогене-тических препаратов проводилось в соответствии с рабочей схемой: костный мозг отмывали последовательно раствором №С1, чередуя центрифугирование и ресуспендирование дважды, каждый раз доводили объём до 10 мл, выдерживали при температуре 37°С до 1,5 часа. Клеточные культуры подвергали последовательно колхицинизации, гипотонизации и фиксации смесью этилового спирта с ледяной уксусной кислотой (фиксатор Корнуа, спирт: уксусная кислота / 3:1), нанесении клеточной взвеси на предметные стекла [10]. В течение 20 минут при температуре -10°С осуществляли первоначальную фиксацию. Далее с промежуточным центрифугированием был сменён фиксатор (2-3 смены). Прозрачность и бесцветность оценивались в качестве показателей завершенности фиксации у клеточной суспензии. На предметные стекла, будучи химически чистыми и охлаждёнными, была раскопана получившаяся клеточная взвесь.
После высушивания цитогенетические препараты маркировали и до анализа хранили при комнатной температуре.
Исследование цитогенетических препаратов проводилось с помощью микроскопа «ZEISS» (x900).
Использовали расчёт среднего значения и стандартного отклонения (S.D.), критерия Манна-Уитни и уровня статистической значимости для него. За уровень статистической значимости принимали р<0,05.
Результаты исследования. Проведённое изучение мутагенности экспериментального образца МППФ «Энзимспорин» методом индукции хромосомных мутаций и последующего учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих не выявило ни дозозависимого, ни воспроизводимого в разных сериях исследования статистически значимого превышения доли клеток с хромосомными аберрациями в получавших исследуемый препарат сериях исследования по сравнению с отрицательным и положительным контролями.
Средние значения по исследуемым группам представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Оценка и результаты цитогенетической активности кормовой добавки МППФ «Энзимспорин» в тесте по регистрации хромосомных отклонений в клетках костного мозга
на 100 иссляое энных клеток Количество клеток с храыосоыныыи понрежленнями Уровень
Условия жсперинента Количество клеток тепы Олиночные фрагменты Двойные фрагменты Обмены клетки с МП* 5наяииости (pi,pa,p3) **
Т 1
ЫППФ
«Энзииспорин» 700 1 ^1=0.75 1.27±0.40 0.13±0.13 0.33=0 23 О.ООьО.ОО 1.59=1.10
Отрицательный pl=0,77
контроль. 1% клейстер 700 2,55*0,70 1.55=0.42 0д3±0.13 1.56=0.45 ОД7±О.Г р2=0.01 рЗ=0.01
Положительный
контроль. Циклофосфан 700 26.12=122 13.49=1.25 1.42=0.13 729= 0.63 2-3iM)-33 14.13=1.76
С 1
ЫППФ
«Эншиспорин» 700 3.21=0.78 1.12=0.32 0,00ь0.00 1.21=0.43 025=0_Р 1-34=0.95
Отрицательный контроль. 1% клейстер 700 3.63=0,75 1.62=0.42 0,00ь0.00 123=027 О.ООьО.ОО 1.75=1.02 р 1=0.52 р2=0.01 рЗ=0_01
Положительный
контроль. Циклофосфан 700 25.00=1 J0 13.11=0.93 0,33*0,32 3.79=0.52 1.52=0 3 j 13.33=1.96
Т 5
ЫППФ
«Эншиспорин»
О хр НИЗ ray
контроль. 1°
клейстер
Положительный
контроль.
Цыклофосфза
300
S00
300
5.23=0.57
5.36=1,50
76.6(5=1.90
1.35*0.22
1.24=0.40
0.24=0.15
О.ООьО.ОО
32.62=2 J 5 2.62=0.31 25.^4=1.31 2.62=0.43
129=0.16
1.12=0.34
0.35=0.16
О.ООьО.ОО
223=0,10
1.95=1.41
34_36=3.()0
р 1=0.90 р2=0.01 рЗ=0.01
* - клетки с множественными (более 5 на метафазу) повреждениями
** р1, р2 и р3 - уровни статистической значимости для сравнения количества клеток с хромосомными повреждениями в группе МППФ «Энзимспорин» и группе «отрицательный контроль. 1-% клейстер, а также группе «положительный контроль. Циклофосфан», соответственно.
В группе животных, получавших МППФ «Энзимспорин» в суточной субтоксической дозе (х10 терапевтическая), число клеток, имеющие хромосомные отклонения, получено 1,34±0,95, что от данных группы отрицательного контроля по статистике не имело отличий (1,75±1,02 клеток), р1=0,52, но в группе положительного контроля значительно имело разницу от данных результатов (13,98±1,98), при р2=0,01. При сравнении показателей также были показаны значительные отличия по статистике между собой у групп отрицательного и положительного контроля (р3=0,01).
При 5-ти дневном введении суточной терапевтической дозы МППФ «Энзимспорин» (Т 5) показатель числа аберрационных клеток для анализа мутагенной индукции в группе тестируемого препарата набрал 2,23±0,70, что в группе отрицательного контроля также не сильно отличалось по статистике от их пока-
зателей (1,95±1,41), а от сведений по положительному контролю заметно отличалось по статистике (34,36±3,00), при р1=0,90 и р2=0,01, соответственно. Так же, как и в проведённых выше сопоставлениях, была выявлена для группы отрицательного и положительного контроля статистически значительная разница между результатами (р3=0,01).
Вывод. МППФ «Энзимспорин» в тесте на индукцию хромосомных мутаций в клетках костного мозга лабораторных животных не владеет мутагенной активностью и при последующей регистрации хромосомных повреждений. В соответствии с этим может быть использован в кормлении свиней в качестве кормовой добавки к основным кормам для профилактики кишечных расстройств, улучшения переваривающей способности, стимуляции роста и развития животных.
Список использованных источников
1. Калюжин О.В., Афанасьев С.С., Быков А.С. Пробиотики как стимуляторы противоинфек-ционного иммунного ответа в респираторном тракте // Терапевтический архив. - 2016. — Т. 88 (№5). — С. 118-124.
2. Влияние пробиотиков на продукцию цитокинов в системах in vitro и in vivo / О.В. Аверина, Е.И. Ермоленко, А.Ю. Ратушный, и др. // Медицинская иммунология. - 2015. — Т. 17 (№ 5)
— С. 443-454.
3. Плотникова Е.Ю., Захарова Ю.В. Место пробиотиков в современной клинической практике // Педиатрия. Consilium Medicum. - 2018. - №1. - С. 95-99.
4. Применение пробиотиков в составе комплексной терапии дисбиотических нарушений при некоторых заболеваниях кишечника / Г.К. Гуревич, Е.Л. Никонов, В.А. Заборова, и др. // Вопросы питания. - 2019. - Т. 88 (№ 1). - С. 77-84.
5. Стецюк О.У., Андреева И.В. Современные представления об эффективности и практические подходы к применению пробиотиков в клинической практике: фокус на Lactobacillus rhamnosus GG и Bifidobacterium lactis Bb-12 // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2019. - Т. 21 (№2). - С. 100-118.
6. Патент России №2689164. - 2019. Способ микрокапсуляции энзимспорина. Авт.: Д.В. Трубников, О.Б. Сеин, А.Ю. Горобец, Е.А. Трубникова.
7. Патент России №2736377. - 2020. Способ повышения эффективности препарата «Энзимспорин» в процессе микрокапсуляции. Авт.: А.С. Белоус, Д.В. Трубников, Е.В. Трубникова, А.Ю.Горобец, М.И. Карташов.
8. Хромосомы человека: атлас / А.Ф. Захаров, В.А. Бенюш, Н.П. Кулешов, Л.И. Барановская.
- М.: Медицина, 1982. - 264 с.
9. Современные методы хромосомного анализа в клинико-цитогенетических исследованиях / Т.А. Залетаева, Н.П. Кулешов, Д.В. Залетаев, О.Б. Барцева. - М.: Медицина, 1994. - 68 с.
10. Карпишенко А.И. - Медицинская лабораторная диагностика: программы и алгоритмы: справочник. - СПб.: Интермедика, 1997. - 304 с.
Spisok ispoFzovanny'x istochnikov
1. Kalyuzhin O.V., Afanas'ev S.S., By'kov A.S. Probiotiki kak stimulatory' protivoinfekcionnogo immunnogo otveta v respiratornom trakte // Terapevticheskij arxiv. - 2016. — T. 88 (№5). — S. 118124.
2. Vliyanie probiotikov na produkciyu citokinov v sistemax in vitro i in vivo / O.V. Averina, E.I. Ermolenko, A.Yu. Ratushny'j, i dr. // Medicinskaya immunologiya. - 2015. — T. 17 (№ 5) — S. 443454.
3. Plotnikova E.Yu., Zaxarova Yu.V. Mesto probiotikov v sovremennoj klinicheskoj praktike // Pediatriya. Consilium Medicum. - 2018. - №1. - S. 95-99.
4. Primenenie probiotikov v sostave kompleksnoj terapii disbioticheskix narushenij pri nekotory'x zabolevaniyax kishechnika / G.K. Gurevich, E.L. Nikonov, V.A. Zaborova, i dr. // Voprosy' pitaniya.
- 2019. - T. 88 (№ 1). - S. 77-84.
5. Steczyuk O.U., Andreeva I.V. Sovremenny'e predstavleniya ob e'ffektivnosti i prakticheskie podxody' k primeneniyu probiotikov v klinicheskoj praktike: fokus na Lactobacillus rhamnosus GG i Bifidobacterium lactis Vb-12 // Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya ximioterapiya. - 2019.
- T. 21 (№2). - S. 100-118.
6. Patent Rossii №2689164. - 2019. Sposob mikrokapsulyacii e'nzimsporina. Avt.: D.V. Trubnikov, O.B. Sein, A.Yu. Gorobecz, E.A. Trubnikova.
7. Patent Rossii №2736377. - 2020. Sposob povy'sheniya e'ffektivnosti preparata «E'nzim-sporin» v processe mikrokapsulyacii. Avt.: A.S. Belous, D.V. Trubnikov, E.V. Trubnikova, A.Yu.Gorobecz, M.I. Kartashov.
8. Xromosomy' cheloveka: atlas / A.F. Zaxarov, V.A. Benyush, N.P. Kuleshov, L.I. Baranovskaya.
- M.: Medicina, 1982. - 264 s.
9. Sovremenny'e metody' xromosomnogo analiza v kliniko-citogeneticheskix issledovaniyax / T.A. Zaletaeva, N.P. Kuleshov, D.V. Zaletaev, O.B. Barceva. - M.: Medicina, 1994. - 68s.
10. Karpishenko A.I. - Medicinskaya laboratornaya diagnostika: programmy' i algoritmy': spravochnik. - SPb.: Intermedika, 1997. - 304 s.
