CC BY
74
-fi>
УДК 599.323.4:612.35:176
С. С. Грабовський1, О. С. Грабовська2 МОРФОМЕТРИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕЧ1НКИ ЩУР1В ЗА УМОВ ПЕРЕДЗАБ1ЙНОГО СТРЕСУ ТА ВИКОРИСТАННЯ Б1ОЛОПЧНО
АКТИВНИХ РЕЧОВИН
^beiecbKrn нацюнальний утверситет ветеринарног медицини та бютехнологш
iMem С. З. Гжицького вул. Пекарська, 50, Abeie 79010, Украгна, grbss@ukr.net 21нститут бюлоги тварин НААН, вул. В. Стуса, 38; м. Abeie, 79034, Украгна,
alice_grb@ukr.net
Дос^джували морфометричш характеристики ne4iH^ mypiB за умов передзабшного стресу на Mi використання бюлопчно активних речовин рослинного i тваринного походження: екстракти селезiнки, ехшаце! та лимоннику китайського, пророщене зерно. За введення екстракту селезiнки до корму протягом п'яти дшв перед забоем у тварин спостеркалися помipнi вiдхилення моpфологiчного стану печiнки, що свiдчить про антистресорш властивосп полiамiнiв, що метяться в екстракть Результати, отpиманi нами у модельному експерименп на щурах, можуть бути використаш у дослЦженнях на сыьськогосподарських тваринах з метою корекци впливу пеpедзабiйного (стресового) стану тварин та отримання яисно! продукци.
Ключовi слова: печтка, щури, передзабшний стрес, екстракти селезтки, ехтацег та лимоннику китайського, пророщене зерно
S. S. Grabovskyi1, O. S. Grabovska2 MORPHOMETRIC CHARACTERISTIC OF RATS LIVER UNDER PRE-SLAUGHTER STRESS AND USAGE OF BIOLOGICALLY
ACTIVE SUBSTANCES 1Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named
after S. Z. Gzhytskyj, 50, Pekarska St., Lviv, 79010, Ukraine, grbss@ukr.net 2Institute of Animal Biology NAAS, Lviv, 79034, st. V. Stus 38, Ukraine, alice_grb@ukr.net
We have studied morphometric parameters of rats' liver under stress conditions using the biologically active substances of plant and animal origin: spleen, Echinacea and Chinese lemon extracts, sprouted grain.
Aerosol introduction of spleen extract to the rats feed for five days before slaughter was caused to liver morphological state moderate deviation, indicating the antistressors properties of polyamines contained in this extract.
The results of model experiment on rats can be used in research of farm animals for correction of pre-slaughter stress influence and getting the receiving of quality industrial production.
Й
Keywords: liver, rats, pre-slaughter stress, spleen extract, Echinacea and Chinese lemon extracts, sprouted grain
С. С. Грабовский1, А. С. Грабовская2 МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕЧЕНИ ПРИ ПРЕДУБОЙНОМ СТРЕССЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
гЛьвовский национальный университет ветеринарной медицины и биотехнологий
имени С. З. Гжицкого, ул. Пекарская, 50, г. Львов 79010, Украина, grbss@ukr.net Чнститут биологии животных НААН, ул. В. Стуса, 38; г. Львов, 79034, Украина,
alice_grb@ukr.net
Исследовали морфометрические показатели печени крыс при предубойном стрессе на фоне использования биологически активных веществ растительного и животного происхождения: экстракты селезенки, эхинацеи и лимонника китайского, проросшее зерно. При введении дополнительно к корму экстракта селезенки в течение пяти дней перед убоем у животных наблюдаются умеренные отклонения морфологического состояния печени, что свидетельствует об антистрессорных свойствах полиаминов, содержащихся в экстакте. Результаты, полученные нами в модельном эксперименте на крысах, могут быть использованы в исследованиях на сельскохозяйственных животных с целью коррекции влияния предубойного (стрессового) состояния животных и получения качественной продукции.
Ключевые слова: печень, крысы, предубойный стресс, экстракты селезенки, эхинацеи и лимонника китайского, проросшее зерно
Сьогодш переоцшюються науковi уявлення щодо бюлопчно'1 ролi високоефективних низькомолекулярних метаболтв природного походження, як мають високу багатовекторну бюлопчну активтсть. Насамперед це стосуеться полiамiнiв (спермшу, спермЦину та путресцину), як беруть участь у рiзноманiтних обмшних процесах i ддать як iмуномодулятори й антистресори (Graboskyi, 2013; 2014a).
Не викликае сумнiвiв важлива роль речовин, що продукуються у надниркових залозах, у реалiзацií вЦповщ оргашзму на дiю стресового чинника (Emadali et al., 2005; Kim et al., 2010; Lou et al., 2009; Malhi & Kaufman, 2011). Печшка — багатофункцiональний орган, що вщграе важливу роль в метаболiзмi — бiосинтезi, секрецГí, детоксикацп i екскрецп рiзних речовин в уах процесах, якГ направленi на тдтримку гомеостазу. При цьому печшка постшно пiддаеться навантаженням i впливу рiзноманiтних чинникГв, пов'язаних не ильки з дiею токсичних речовин, але й стресу. Все це може привести до ушкодження печiнки i порушення ii функцГí. £ багато дослЦжень щодо характеристики змГн у печшщ пГд дiею рГзних стресових факторiв (Rutkowski et al., 2008; Kammoun et al., 2009; Lee, Scapa, Cohen & Glimcher, 2008).
Проте, однозначно! думки про морфологГчнГ та ультраструктурнi змши у печiнцi i, зокрема перед забоем не Гснуе, що пов'язано, насамперед, Гз рГзним за тривалГстю та моделями Гндукуванням стресу. Введення тканинних препаратГв викликае реакцГю зГ сторони гормонально! системи органГзму: збГльшуеться утворення адренокортикотропного гормону i стимулюеться видГлення кортикостеро!дГв та тдвишуеться продуктившсть тварин.
З метою нГвелювання стресу перед забоем тварини нами були проведет дослГдження впливу ГмуномодуляторГв природного походження. Аерозольне введення до рацюну екстракту селезГнки, в якому мГстяться полГамГни, мало найбГльший позитивний вплив на оргашзм тварин за умов передзабшного стресу (Graboskyi, 2013; 2014a; 2014b). З лГтературних джерел вГдомо, що у малих кГлькостях полГамши синтезуються майже усГма клГтинами органГзму, але основну частину ендогенних полГамшв синтезуе печГнка (Jung, Kim, Kwondo & Kim, 2012; Koponen et al., 2012; Tomasi et al., 2013).
Введення полГамшв, отриманих з екстракту селезГнки, як Гз застосуванням так i без використання ультразвуку, супроводжувалось тдвищенням загально! к1лькостГ полГамшв, а також збГльшенням концентрацп окремих Гз них: путресцину, спермГну та спермГдину у кровГ i тканинах (крГм нирок) курчат -бройлерГв. ВГрогГдно бГльший вмГст полГамГнГв спостерГгали у кровГ, печГнцГ та грудному м'язГ у курчат-бройлерГв, яким до основного рацюну вводили екстракт селезГнки, отриманий Гз застосуванням ультразвуку. НайбГльший вмГст полГамшв у печшщ, ймовГрно, пов'язаний з штенсивтшим синтезом !х у сташ стресу та з додатковим введенням до корму екстракту селезГнки, що свГдчить про необхГдшсть тдвищення концентрацп полГамГнГв у рацГонГ сГльськогосподарських тварин i птицГ перед забоем, оскГльки полГамГни Гнтенсивно використовуються оргашзмом за умов стресу, що було встановлено нашими попередшми дослГдженнями (Grabovskyi, 2014b).
Морфометричним дослГдженням виявляли, що у щурГв, яким задавали екстракт селезГнки, площа острГвщв Лангерганса тдшлунково! залози була найбГльшою, у щурГв контрольно! групи вГдзначали незначне локальне замщення жировою тканиною екзокринно! частини тдшлунково! залози, особливо в дГлянках навколо кровоносних судин, що було в межах норми. (Grabovskyi, 2014с).
НайбГльшу концентращю полГамГнГв виявлено у тдшлунковш залозГ, тимусГ та шших залозах, а також у печшщ, тобто в органах, де вГдбуваеться штенсивний синтез бГлкгв (Berdinskih, 1987; Scalabrino, 1981).
Метою роботи було дослГдити гГстологГчнГ характеристики печГнки за дп бГологГчно активних речовин рГзного походження у передзабГйний перГод.
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ
ДослГдження проводили на бГлих щурах лшп ВГстар, масою тГла 180-220 г, яких утримували у стандартних умовах вГварГю з необмеженим доступом до ISSN 2225-5486 (Print), ISSN 2226-9010 (Online). Бiологiчний вкникМДПУ. 2015. №1
-а
питно'1 води та корму. Щурам згодовували стандартний брикетований комб1корм для лабораторних тварин. Для дослЦжень було сформовано чотири групи: три дослЦш (I, II i Ill) та контрольну (IV) по п'ять шур1в у кожнш. Як б1олог1чно активн1 речовини (за п'ять дшв до забою тварин) використовували екстракт селезшки (I), екстракти ехшаце"! та лимоннику (II), пророщене зерно (III) — як антистресори та 1муномодулятори у передзабшний перюд. Екстракти на 70° спиртовому розчиш наносили на корм аерозольним розпиленням в об'ем1 0,6 мл/тварину. Тваринам контpольно'i групи (IV) таким же чином додавали до корму 70° розчин етанолу в аналогичному об'ем1. Щурам уах груп додатково до стандартного корму давали зерно (10 г/тварину). По!дання корму контролювали щоденно. У к1нц1 досл1ду вах тварин декап1тували почергово п1д етерним наркозом.
Уа б1оетичн1 норми витримано (зг1дно з) або в1дпов1дно до Европейською (о'1) конвенцИ' «Про захист хребетних тварин, як використовуються для експериментальних i наукових щлей» (Страсбург, 1986 p.) i «Загальних етичних принцип1в експерименив на тваринах», ухвалених Першим Нацюнальним конгресом з б1оетики (Кш'в, 2001) принцитв гуманност1, викладених у директив! Европейсько1 Спiльноти (Directive..., 2010).
Для пстолопчного досл1дження (Merkulov, 1969) вз1рщ тканин ф1ксували у 10 % нейтральному розчиш формалшу. П1сля цього 1х зневоднювали у ряд1 розчишв спирту з висх1дними концентрац1ями (70°, 80°, 90°, 96°), ущыьнювали у двох порщях хлороформу та заливали в парафш. На санному м1кротом1 виготовляли зр1зи завтовшки в1д 5 до 15 мкм, як1 фарбували гематоксилшом та еозином. Св1тлову мшроскошю i м1крофотографування г1стопрепарат1в зд1йснювали за допомогою м1кроскопа Olympus CX 41 та фотокамери Olympus С-5050. Морфометр1ю на тканинному р1вш проводили з використанням програми DP-Soft для мшроскопа Olympus CX 41.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ та 1х Обговорення
При пстолопчному досл1дженн1 було встановлено, що у шур1в I групи часточкова i рад1альна балкова будова печ1нки чгтко виражена. Гепатоцити пол1гонально1 форми з великими круглими ядрами. Хроматин в быьшосл ядер локал1зований бьля карюлеми. Мембрани кл1тин контурован1, границ1 м1ж ними ч1тко видим1. Цитоплазма переважно однородно забарвлена, базоф1льна. На тл1 таких кл1тин видьлялись гепатоцити з двома ядрами, в яких цитоплазма i ядра дещо базофiльнi (Рис. 1). Купфер1вськ1 кл1тини у центролобулярнш чатин1 б1льш витягнуто'1 форми, а у перипортальних дыянках дещо заокруглеш Ступ1нь базофый' в1дображае виражений р1вень синтетичних процес1в у кл1тин1.
Рис. 1. Печшка шурiв I групи. Гепатоцити з однородно зафарбованою цитоплазмою формують печiнковi балки. Гематоксилiн та еозин. Ок. 10, об. 20
У щурiв II групи порушень часточково'1 та балково'1 будови також не спостеркали, тодi як у щурiв III групи вiдмiчено часткове порушення балково'1 будови у центролобулярнш дiлянцi часточки, зумовлене помiрним мутним (набубнявшням) цитоплазми гепатоцитiв. Цитоплазма быьшосп клiтин неоднорiдно забарвлена, внутрiшньочасточковi катляри дещо розширенi. Печiнковi клiтини незначно збыьшеш у розмiрi, iз зернистою еозиноф1льною цитоплазмою, межi мiж клггинами слабо проглядаються (Рис. 2)
Рис. 2. Печшка щурiв III групи. Зернислсть цитоплазми гепатоцитiв, часткове порушення балково'1 будови. Гематоксилш та еозин. Ок. 10, об. 20
У щypiв IV фупи (кoнтpoль), cпocтepiгaли (набубнявшня), зepниcтy диcтpoфiю гeпaтoцитiв. Сepeд диcтpoфiчнo змiнeних клiтин виявляли двoядepнi гепатоцити та клггини з вeликими ядpaми (Риc. 3), шO/ можливо, спричинене впливом влacнe пepeдзaбiйнoгo cтpecy.
Рис 3. ^чшка шypiв кoнтpoльнoï фупи. Iнфiльтpaцiя клiтинних eлeмeнтiв нaвкoлo жoвчних пpoтoкiв. Гeмaтoкcилiн та eoзин. Ок. 10, o6. 10
Haвкoлo тpiaд cпocтepiгaли пoмipнy кpyглo-клiтиннy iнфiльтpaцiю та збiльшeння кiлькocтi зipчacтих клiтин. Дoдaвaння шypaм poзчинy eтaнoлy зyмoвилo poзвитoк зepниcтoï диcтpoфiï у цeнтpoлoбyляpнiй дыянщ чacтoчки (Риc. 4).
Риc. 4. ^чшка шypiв кoнтpoльнoï гpyпи. Зepниcтa диcтpoфiя гeпaтoцитiв. Гeмaтoкcилiн та eoзин. Ок. 10, o6. 100
ВИСНОВКИ
Найменш виражеш змiни у печiнцi було зафшсовано у rpyni лабораторних тварин, яким додатково до корму вводили багатий на бюлопчно активш речовини екстракт селезшки, що, на нашу думку, зумовлено позитивним впливом саме полiамiнiв.
Результати, отримаш у модельному експеримени на лабораторних тваринах в умовах вiварiю, можуть бути використанi у дослЦженнях на сiльськогосподарських тваринах з метою корекцп впливу стресового стану перед забоем тварин i отримання яюсно! продукцп. ПЕРСПЕКТИВИ ПОДАЛЬШИХ РОЗВ1ДОК
Дослiдження показниюв клiтинного iмyнiтетy у кровi домашнiх тварин при використант iмyномодyляторiв тваринного походження за умов передзабшного стресу.
ПЕРЕЛ1К ВИКОРИСТАНОÏ Л1ТЕРАТУРИ Distinct endoplasmic reticulum stress responses are triggered during human liver transplantation / A. Emadali, D. T. Nguyen, C. Rochon [et al.] // J. Pathol. — 2005. — V. 207. — P. 111-118.
Metformin regulates palmitate-induced apoptosis and ER stress response in HepG2 liver cells / D. S. Kim, S. K. Jeong, H. R. Kim [et al.] // Immunopharmacol Immunotoxicol. — 2010. — V. 32. — P. 251-257.
Endoplasmic reticulum stress involved in heart and liver injury in iron-loaded rats / L. X. Lou, B. Geng, Y. Chen [et al.] // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. — 2009. — V. 36. — P. 612-618.
Malhi H. Endoplasmic reticulum stress in liver disease / H. Malhi, R. J. Kaufman // Journal of hepatology. — 2011. — V. 54. — № 4. — P. 795-809. UPR pathways combine to prevent hepatic steatosis caused by ER stressmediated suppression of transcriptional master regulators / D. T. Rutkowski, J. Wu, S. H. Back [et al.] // Dev. Cell. — 2008. — V. 15. — P. 829-840.
GRP78 expression inhibits insulin and ER stress-induced SREBP-1c activation and reduces hepatic steatosis in mice / H. L. Kammoun, H. Chabanon, I. Hainault [et al.] // J. Clin. Invest. — 2009. — V. 119. — P. 1201-1215.
Lee A. H. Regulation of hepatic lipogenesis by the transcription factor XBP1 / A. H. Lee, E. F. Scapa, D. E. Cohen L. H. Glimcher // Science. — 2008. —V. 320. — P.1492-1496.
Грабовский С. С. Влияние биологически активных веществ разного происхождения на лабораторных животных в стрессовом состоянии / С. С. Грабовский // Сборник научных трудов SWorld. — 2013, Иваново : МАРКОВА АД. — Том 44. — Выпуск 3. — С. 13-15.
-а
й
Грабовський, С. С. Вплив 1муномодулятор1в природного походження на показники клггинного 1муштету i р1вень кортизолу в кров1 щур1в за умов стресу / С. С. Грабовський // Бюлопчш Студи. — 2014. — Том 8. — № 1. — С. 93-102. Грабовський С. С. Вмют полiамiнiв та ix корекщя у кров! та тканинах курчат-бpойлеpiв за умов стресу / С. С. Грабовський // Бюлопя тварин. — 2014. — Том 16. — № 2. — С. 18-25.
Грабовський, С. С. Морфометрична характеристика тдшлунково!" залози щур!в за умов передзабшного стресу при використанш бюлопчно активних речовин / С. С. Грабовський // Бюлопя тварин. — 2014. — Том 16. — № 4. — С. 15-21. Бердинских П. К. Полиамины и опухолевый рост / П. К. Бердинских, С. П. Залеток. — К. : Наукова думка, 1987. — 140 с.
Scalabrino G. Polyamines in mammalian tumors / G. Scalabrino, M. E. Ferioli // Advances in Cancer Research. — New York : Raven Press, 1981. — Vol. 35. — P. 151-268.
Jung Y. S, Kim S. J., Kwondo Y., Kim Y. C. Metabolomic analysis of sulfur-containing substances and polyamines in regenerating rat liver // Amino Acids. - 2012. - 42. - 6. - P. 2095-102. doi: 10.1007/s00726-011-0946-7.
Koponen, T., Cerrada-Gimenez, M., Pirinen, E. [et al.]. (2012). The activation of hepatic and muscle polyamine catabolism improves glucose homeostasis. Amino acids. 42 (2-3), 427-440. doi: 10.1007/s00726-011-1013-0.
Polyamine and Methionine Adenosyltransferase 2A Crosstalk in Human Colon and Liver Cancer / M. L. Tomasi, M. Ryoo, A. Skay [et al.] // Exp. Cell Res. — 2013. — V. 319. — № 12. — Р. 1902-11. doi: 10.1016/j.yexcr.2013.04.005.
Official Journal of the European Union L276/33. DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. 86/609/EC. 20.10.2010. Меркулов Г. А. Курс патологической техники. - Ленинград : Медицина. - 1969. -423 с.
References
Emadali, A., Nguyen, D.T., Rochon, C. Tzimas, G.N., Metrakos, P.P., Chevet, E. (2005). Distinct endoplasmic reticulum stress responses are triggered during human liver transplantation. J. Pathol. 207,111-118.
102 Бюлопчний eicHHK
Kim, D.S., Jeong, S.K., Kim, H.R., Kim. D.S., Chae, S.W., Chae, N.J. (2010). Metformin
regulates palmitate-induced apoptosis and ER stress response in HepG2 liver
cells. Immunopharmacol Immunotoxicol. 32, 251-257.
Lou, L.X., Geng, B., Chen, Y., Yu, F., Zhao, J., Tang, C.S. (2009). Endoplasmic
reticulum stress involved in heart and liver injury in iron-loaded rats. Clin.
Exp. Pharmacol. Physiol. 36, 612-618.
Malhi, H., Kaufman, R.J. (2011). Endoplasmic reticulum stress in liver disease.
Journal of hepatology. 54 (4), 795-809.
Rutkowski, D.T., Wu, J., Back, S.H., Callaghan, M.U., Ferris, S.P., Iqbal, J., Clark,
R., Miao, H., Hassler, J.R., Fornek, J., Katze, M.G., Hussain, M.M., Song,
B., Swathirajan, J., Wang, J., Yau, G.D., Kaufman, R.J. (2008). UPR pathways
combine to prevent hepatic steatosis caused by ER stressmediated suppression
of transcriptional master regulators. Dev. Cell. 15, 829-840.
Kammoun, H.L., Chabanon, H., Hainault, I., Luquet, S., Magnan, Ch., Koike, T.,
Ferré, P., Foufelle, F. (2009). GRP78 expression inhibits insulin and ER stress-
induced SREBP-lc activation and reduces hepatic steatosis in mice. J. Clin.
Invest.119,1201-1215.
Lee, A.H., Scapa, E.F., Cohen, D.E., Glimcher, L.H. (2008). Regulation of hepatic
lipogenesis by the transcription factor XBP1. Science. 320,1492-1496.
Graboskyi, S.S. (2013). Influence of BAS of various origin on laboratory animals at
stress condition. SWorld. 44 (3), 13-15.
= ISSN 2225-5486 (Print), ISSN 2226-9010 (Online). Бiологiчний вСникМДПУ. 2015. №1
-a
Grabovskyi, S.S. (2014a). Effect of natural immunomodulators influence on cellular immunity indices and Cortisol level in rat's blood at pre-slaughter stress. Studia Biologica. 8 (1), 93-102.
Grabovskyi, S.S. (2014b). Natural origin immunomodulators influence on cellular immunity indices in rabbits blood under stress. The Animal Biology. 16 (2), 1825.
Grabovskyi, S.S. (2014c). Morphometric characteristic of rats pancreas at pre-slaughter stress under using of biologically active substances. The Animal Biology. 16 (4), 15-21.
Berdinskih, P. K., Zaletok, S. P. (1987). Polyamines and tumour growth. K. : Naukova, dumka, 140 p.
Scalabrino, G., Ferioli, M. E. (1981). Polyamines in mammalian tumors. Advances in Cancer Research. New York : Raven Press. 35, 151-268.
Jung, Y. S, Kim, S. J., Kwondo, Y., Kim, Y. C. (2012). Metabolomic analysis of sulfur-containing substances and polyamines in regenerating rat liver. Amino Acids. 42(6), 2095-2102. doi: 10.1007/s00726-011-0946-7.
Koponen, T., Cerrada-Gimenez, M., Pirinen, E., Hohtola, E., Paananen, J., Vuohelainen, S., Tusa, M., Pirnes-Karhu, S., Heikkinen, S., Virkamaki, A., Uimari, A., Alhonen, L., Laakso, M. (2012). The activation of hepatic and muscle polyamine catabolism improves glucose homeostasis. Amino Acids. 42
(2-3), 427-440. doi: 10.1007/s00726-011-1013-0.
ISSN 2225-5486 (Print), ISSN 2226-9010 (Online). Eiоnогiцниu eicHUKMffnY. 2015. №1
104 Eio^oriHHHH eicHHK
Tomasi, M.L., Ryoo, M., Skay, A., Tomasi, I., Giordano, P., Mato, J.M., Lu, S.C. (2013). Polyamine and Methionine Adenosyltransferase 2A Crosstalk in Human Colon and Liver Cancer. Exp. Cell Res. 319 (12), 1902-1911. doi: 10.1016/j.yexcr.2013.04.005. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union L276/33. 86/609/EC. 20.10.2010. Merkulov, G.A. (1969). Pathology Technique Course. Leningrad: Medicine.
Поступила в редакцию 17.02.2015 Как цитировать:
Грабовський, С.С., Грабовська, О.С. (2015). Морфометрична характеристика печшки щурiв за умов передзабшного стресу та використання бюлопчно активних речовин. Биологический вестник Мелитопольского государственного педагогического университета имени Богдана Хмельницкого, 5 (1), 94-104. cross"* http://dx.doi.org/10.7905/bbmspu.v5il.965
© Грабовський. Грабовська, 2015
Users are permitted to copy, use, distribute, transmit, and display the work publicly and to make and distribute derivative works, in any digital medium for any responsible purpose, subject to proper attribution of authorship.
гмж^н
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 3.0 License.
