CC BY
5
преимуществом этого состава была возможность точного учета динамики вновь синтезированного белка, недостаток — отсутствие оксигемоглобина, компенсировали обильным насыщением перфузата кислородом. Изучаемые токсические агенты подавали в перфузат непосредственно перед печенью с помощью микродозатора. Материал для исследования отбирали из венозной магистрали (оттекающей из печени) до введения пестицидов и по ходу перфузии. Содержание общего белка в перфузате определяли по методу Лоури, аминокислотный спектр определялся JI. М. Овсянниковой и М. А. Осиповой на автоанализаторе аминокислот К А—5 «Хитачи».
Полученные результаты показали, что добавление пестицидов к перфу-зату значительно снижает скорость синтеза белка из аминокислот':ой смеси. При сопоставлении аминокислотных спектров сыворотки крови при пер-оральном введении указанных пестицидов интактным крысам и в условиях перфузии выявлен однонаправленный характер изменений в обоих случаях. Наряду с этим перфузия изолированной печени при аминокислотном дисбалансе, соответствующем интоксикациям пестицидами, позволила установить, что нарушение белковообразовательной функции печени связано не только с их влиянием на белковый обмен, но и с конкретными изменениями соотношения аминокислот, которые они вызывают. Таким образом, была показана возможность применения метода перфузии изолированной печени крысы для качественной и количественной оценки влияния токсических веществ на белковообразовательную функцию печени.
Таким образом, на основании приведенных данных следует, что метод перфузии изолированной печени крысы может быть использован в гигиенической токсикологии для изучения процессов токсикодинамики и токсико-кннетики, математического моделирования и прогнозирования количественных параметров этих процессов на целом организме, выявления механизмов адаптации и комбинированного действия, сравнительного изучения терапевтической эффективности лекарственных препаратов, применяемых при интоксикациях, выявления механизма лечебного действия и его прогнозирования.
ЛИТЕРАТУРА. Арчаков А. И. Микросомальное окисление. M., 1975. — П/> п о в Т. А. — В кн.: Математические модели в биологии и исследование физиологических систем. Киев, 1975, с. 92—100. — Он ж е. — «Бюлл. экспер. биол», 1975, № 3, с. 122—124. — Попов Т. А., Овсянникова Л. М. — Тезисы докладов 5-й Всесоюзной научной конференции «Новейшие вопросы гигиены применения пестицидов». Киев, 1975, с. 132. — Попов Т. А., Великий H. Н., Пархомец П. К. — «Укр. б1ох1м. ж.», 1976, № 2, с. 202—208. — Hems R., Ross В. D„ Berry M. N. et a. — tBiochem. J.», 1966, v. 101, c. 284—292. — Ryoo H., TarverH.— «Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.)», 1968, v. 128, c. 760—772. — H e s t г i n S. — «J. biol. Chem.», 1949, v. 180, c. 249—261.
Поступила 17/1II 1976 г.
УДК 612.33.017.2:612.014.4*
Т. И. Бонашевская
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОЦЕССОВ АДАПТАЦИИ ПЕЧЕНИ К ВОЗДЕЙСТВИЮ НЕКОТОРЫХ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Институт общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
В последние годы появилось большое число исследований, посвященных проблеме адаптации. Морфологические реакции адаптации на органном уровне включают в себя, с одной стороны, адаптационные процессы паренхиматозных элементов органа, с другой — реализуются при участии клеток и основного вещества соединительнотканной стромы, сосудов, функциональные сдвиги в которых приводят к изменению тканевой проницае-
Исследуемые вещества и схемы экспериментов
M опыта Вещество Концентрация, мг/м* Путь введения в организм Длительность воздействия
1 Бензол 1,5; 15 мг/м3 Ингаляционно 3 м ее
2 Дихлорпропан (ДХП) 1,5; 9 > 3 мес
3 Трихлорпропан (ТХП) 0,45; 2 > 3 мес
4 Перхлорэтилен (ПХЭ) 4,5; 19 > 3 мес
5 4,4-диаминодифенил-
сульфон (ДДС) 0,05;, 0,1; 0,5 » 3 мес
6 Диметилацетамид (ДАА) 0,1; 0.5 » 3 мес
7 Четыреххлористый угле- 138 и 219 дней
род (CC1J 5 »
8 Диметилди хлорвинил- 1 1 мг/кг С питьевой водой
фосфат (ДДВФ) 50, "5 3 мес
9 Пентагексаметиленмела-
нин и оксаметилацета- Вытяжка из тка- Хвостовая аппли-
мид (апрнтол) ней и чистое ве- кация по 4 ч в
щество день 4 мес
10 Диметилакрилоксиэтил-
фосфонат (ДММФ) То же То же 4 мес
мости, микроциркуляторным нарушениям, инфильтративным процессам и т. д. В настоящем сообщении мы попытались проанализировать процессы адаптации в печени крыс при экспериментальном воздействии ряда органических веществ с помощью гистоферментативных методов исследования. Изученные вещества, их концентрации и дозы, а также путь поступления в организм представлены в таблице.
Морфологический анализ печени включал гистологические (окраска гематоксилин-эозином), гистохимические (изучение содержания РНК по методу Браше, гликогена по методу Хочксисса, липидов при окраске Суданом III) и гистоферментативные исследования окислительных ферментов — сукциндегидрогеназы (СДГ) нуклеотиддиафораз (НАД- и НАДФ-диафораз), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) с применением в качестве акцептора водорода соли нитротетразолиевого синего, а также неспецифической гидролазы АТФ-азы по методу Вахштейна и Мейзеля.
При изучении группы веществ, поступающих в организм ингаляционным путем в условиях хронических экспериментов, установлено, что при воздействии минимальных из исследуемых концентраций гистоструктура печени сохранена и не отличается от контрольных препаратов. При повышении концентраций веществ структурные сдвиги либо отсутствуют, либо имеют незначительные изменения, которые выражаются в наличии гипо-хромии ядер гепатоцитов, расположенных чаще вблизи центральных вен, иногда появлении здесь мелких вакуолей. Возможна также некоторая вариабельность ядер гепатоцитов и изменение тинкториальных свойств цитоплазмы печеночных клеток.
Можно отметить небольшие реактивные изменения со стороны интер-стициальной ткани в виде инфильтраци-и лимфоидных и плазмацитарных клеток вокруг триад, появления активированных форм купферовских клеток, формирования очажков РЭС. При максимальных концентрациях, кроме описанных изменений, иногда наблюдаются центральный хроматолиз ядер гепатоцитов и процессы кариолиза в отдельных клетках, преимущественно в центральных отделах печеночных долек, появление мелких вакуолей в цитоплазме клеток. Прогрессированию структурных изменений соответствует появление микроциркуляторных нарушений, выражающихся в расширении и полнокровии капиллярной сети, чаще вокруг центральных вен, изредка начальные признаки нарушения сосудистой проницаемости. При сопоставлении реакций, наблюдаемых в печени под влиянием атмосферных загрязнений, с реакциями при других путях поступления веществ (пероральном, перкутанном) выявлено, что гистоструктурные и гемодина-
Гистохимические сдвиги в печени в условиях химических воздействий.
о. б —[гликоген в печени контрольного животного (о) и опыте № 8 (б). Ув. 300 х; «. г — активность СДГ в печени в контроле («) и опыте ЛГ» 3 (г). Ув. 52.5 х: д. е — активность ЛДГ в контроле (д) и опыте 3 (г). Ув. 52.5X; ж. з — активность АТФ-азы в контроле (ас) и опыте Л'« 2 (з). Ув. 300 X .
мические изменения остаются в тех же параметрах и имеют аналогичную направленность. Описанная симптоматика носит неспецифический характер и обнаруживается при действии органических соединений различных классов. При повышении интенсивности химического воздействия с большим постоянством обнаруживается снижение содержания гликогена в различных отделах печеночных долек — в периферических, интермедиарных или центральных (см. рисунок, а, б). При изучении содержания РНК сдвиги менее отчетливы и в разных отделах печеночных долек могут иметь противоположную направленность; чаще наблюдается снижение количества пиронино-
фильных гранул в клетках центролобулярных отделов при интенсивной пиронинофилии гепатоцитов периферических отделов печеночных долек. При снижении содержания РНК в центре долек просветляется фон клетки, а число пиронинофильных структур, нередко неправильной или палочковидной формы, уменьшается, они оттесняются к плазматической мембране или формируют конгломераты, прилежащие к ядерной мембране. При окраске препаратов на жир в условиях воздействия максимальных из иссле-дуемыхчконцентраций иногда удается выявить мелкокапельные липидные включения. В сосудах обнаруживается накопление РаБ-положительного материала в области базальных мембран, указывающее на отложение здесь гликопротеидов. Этот комплекс гистохимических изменений в большей или меньшей степени характерен для всех исследуемых веществ и не зависит от путей их поступления в организм. При гистоферментативном анализе обнаружены определенные закономерности при введении низких концентраций веществ. В условиях санитарно-токсикологических экспериментов поступление в организм минимальных из исследуемых концентраций не влияет на активность окислительных ферментов. Однако в некоторых экспериментах (опыты № 3, 4, 5, 6) можно наблюдать повышение активности СДГ в минимальных из исследуемых концентраций. При повышении интенсивности химического воздействия в большинстве опытов наблюдается небольшое угнетение СДГ в центролобулярных отделах при сохранении или повышении активности фермента в периферических зонах (см. рисунок, в, г). Кинетика энзима Г-6-ФДГ аналогична СДГ. Процессы анаэробного гликолиза, оцениваемые по активности ЛДГ, или не менялись по сравнению с контролем, или усиливались (см. рисунок, д, е). Проведенное в ряде экспериментов исследование АТФ-азы (диметилацетамид, хлорпроизводные углеводороды) дало возможность установить небольшое снижение активности этого фермента в цитоплазме печеночных клеток при сохранении ее уровня по периферии и отчетливое повышение активности его в стенках крупных кровеносных сосудов, капиллярах и билиарной системе (см. рисунок, ж, д).
Обсуждая полученные данные, следует отметить, что при воздействии минимальных концентраций химических веществ в преобладающем большинстве санитарно-токсикологических экспериментов обнаруживается отсутствие в печени нарушений как структурного, так и обменного характера, что документирует полную сохранность внутриклеточного гомеостаза в печени на уровне контрольных показателей. При повышении концентрации химических веществ, а также в отдельных экспериментах на минимальном уровне воздействия наблюдалось повышение содержания РНК и усиление активности окислительных ферментов. Изменение внутриклеточного гомеостаза в сторону повышения его пластических ресурсов и биоэнергетики мы расцениваем как раннюю фазу адаптации, достигаемую развитием компенсаторных процессов. В реализации состояния адаптации принимает участие весь орган в целом, центральные отделы печеночных долек и периферия.
По мере проникновения веществ в клетки, в первую очередь центролобулярных отделов, в результате интенсивной нагрузки по окислению химических соединений в них уменьшается образование макроэрга АТФ, что, по мнению Г. П. Бабанова, является причиной релаксации митохондриаль-ных белков. Последнее приводит к снижению окислительных процессов. При снижении активности окислительных процессов в цикле Кребса энергообразование клетки обеспечивается усилением анаэробных процессов. Снижение активности АТФ-азы и СДГ, а также гликогена и РНК в клетках печени наряду с увеличением активности ЛДГ мы расцениваем как адаптационные сдвиги, связанные с процессами детоксикацин химических веществ. Уменьшение содержания РНК обусловлено универсальной реакцией клетки на введение химического вещества — дегрануляцией шероховатой эндо-плазматической сети, гиперплазией гладкой сети, в основе чего лежит, по-видимому, снижение синтеза РНК. Гликоген расходуется в связи с актива-
цией процессов анаэробного гликогенолиза. Поддержание состояния адаптации не только с(помощью компенсаторных процессов, но и ценой катабо-лических сдвигов в ограниченной части клеток характеризует, с нашей точки зрения, следующую фазу адаптации печени. Комплекс структурных, гистохимических и гистоферментативных процессов в печени при воздействии низких концентраций химических веществ в условиях санитарно-токси-кологических экспериментов ограничивался в основном этими фазами адаптации. В дальнейшем угнетение активности ферментов тканевого дыхания и анаэробного гликолиза, истощение пластических ресурсов клеток, развитие жировой дистрофии дают основание считать, что в части печеночных клеток наблюдается полом адаптационных механизмов с развитием реакций повреждения. В данном случае снижение пластических ресурсов клетки и ее биопотенциала связано, очевидно, не с повышенным их расходованием на детоксикацию, а с нарушунием процессов протео- и энзимосинтеза, обусловленных повреждением внутриклеточных органелл под влиянием токсического вещества и его метаболитов. Состояние адаптации печени к химическому воздействию, обеспечиваемое развитием компенсаторных процессов в преобладающей части клеток и сопровождаемое начальными повреждениями гепатоцитов в ограниченной зоне вокруг центральных вен, характеризует, на наш взгляд, более позднюю фазу адаптации. При воздействии максимальных из исследуемых концентраций, по-видимому, наблюдался переход из второй в третью фазу адаптации, границу между которыми провести трудно. По мере развития токсико-динамического процесса прогрессируют реакции повреждения, нарастая по глубине и протяженности, однако эту стадию интоксикации в хронических экспериментах в условиях принятых схем опытов мы нр наблюдали. Исключение составил опыт с 7-месячным введением CCI 4 в концентрации 5 мг/м:|, когда реакции повреждения в равной и даже преобладающей степени сосуществовали с адаптационными процессами. В этом эксперименте наблюдалась вакуольная жировая дегенерация значительной части паренхимы печени с резким снижением здесь уровня окислительных ферментов. В неповрежденной части паренхимы отмечались более выраженные адаптационные сдвиги, направленные на сохранение нарушенного гомеостаза органа и реализацию процессов деток-сикации и выведения химических веществ. Несмотря на усиление механизмов адаптации в части органа, последние не способны обеспечить состояние физиологической полноценности, поскольку значительная часть паренхимы органа повреждена. С нашей точки зрения, изменения, которые развиваются в неповрежденной части органа, следует считать адаптационными, а не компенсаторными, ибо термин «компенсаторные» несет в себе более ограниченный смысл и не позволяет охватить всю многогранность наблюдаемых процессов. Состояние органа, при котором в равной степени отражены реакции повреждения и адаптационные процессы, обеспечиваемые рядом сложных механизмов в сохраненных структурах, можно расценивать как состояние адаптированности.
В заключение следует отметить, что в печени развиваются стереотипные реакции структурного и обменного характера в ответ на химическую экспозицию независимо от специфических особенностей органических веществ и путей их введения, оцениваемые нами как адаптационные сдвиги, в развитии различных фаз которых имеет значение различная интенсивность воздействия.
При минимальных из действующих концентраций процессы адаптации обеспечиваются усилением биоэнергетических ресурсов за счет гиперплазии внутриклеточных органелл, а при большей интенсивности воздействия — не только компенсаторными реакциями, но и ценой катаболическнх сдвигов в ограниченной части органа. Эти ранние фазы адаптации подтверждаются применением гистоферментативных методов. Более выраженная интоксикация сопровождается отчетливыми альтеративными изменениями, прогрес-сирование которых приводит к ограничению адаптационных возможностей
и в конечном счете к дизадаптацнн органа. Реакции повреждения и адаптационные сдвиги имеют отчетливо выраженную топическую характеристику.
ЛИТЕРАТУРА. Б'абанов Г. П. Механизмы и границы адаптации при действии на организм неэлектролитов как химических факторов ^интенсивности. Ярославль, 1973.
Поступила 30/1V 1976 г.
УДК 615.9.07
Канд. мед. наук М. Б. Шпирт
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЯДОВ В КУЛЬТУТЕ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
Киргизский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и гигиены,
г. Фрунзе
Все более широкое применение в народном хозяйстве синтеза химических соединений вызывает необходимость в моделях, позволяющих за короткий срок определить свойства вещества и сделать заключение о целесообразности обстоятельного его исследования. Одна из таких моделей — культура клеток. Имеющиеся данные позволяют считать, что в культуре сохраняются контрольные механизмы, регулирующие рост клеток и их метаболизм. Поэтому процессы, ведущие к нарушению этих механизмов и появлению в клетках всевозможных изменений, протекают в формах, близких к имеющим место в живом организме (Н. П. Дубинин; Я- Е. Хесин).
Количественная токсикологическая оценка ядов при однократном и многократном действии их на культуры клеток основана на учете характеристики роста клеток и связанных с ним явлений. Она складывается из следующих этапов: культивирование клеток и внесение исследуемых веществ, количественная оценка морфологических изменений клеток в пробирках, камере Горяева и изучение цитостатических и цитотоксических свойств ядов в препарате..
Наиболее целесообразным с практической точки зрения является использование первично эксплантированной (эмбриональные фибробласты человека) или перевиваемых (клетки амниона человека, штамм клеток «Detroit») культур клеток, которые готовятся по общепринятой методике (М. И. Леви; Р. С. Дрейзен; О. Г. Анджапаридзе и соавт.; В. Д. Соловьев и Т. А. Бектемиров; Д. Пол).
Маточную культуру исследуемых клеток (200—250 тыс. в 1 мл) в синтетической питательном среде (50%—среды № 199, 20%—сыворотки крупного рогатого скота, 30% — гидролизата лактальбумина 0,5%) переносят в пробирки по 2 мл. В них пом- шаюг по одному предметному стеклу размером 15x10 мм. Карандашом по стеклу отмечают полоской верх пробирки для удобства последующего просмотра под микроскопом, затем, плотно закрывая их пробками, ставят в наклонном положении (под углом 5°) и инкубируют в термостате при 37°С. По получении сплошного пласта клеток на стенках пробирок и на предметном стекле (для первично эксплантированной культуры на 5-е сутки, для перевиваемой — на 2-е сутки) вносят 0,1 мл исследуемого вещества в 0,01% раствор спирта, приготовленного на питательной среде; часть пробирок для контроля культуры оставляется в исходном состоянии. Рекомендуемая концентрация этилового спирта не оказывает токсического эффекта на клетки в культуре. При необходимости использования другого растворителя следует предварительно подобрать такую его концентрацию, при которой вещество растворяется и токсических изменений в культурах клеток не возникает. При многократном действии внесение изучаемых веществ осуществляется следующим образом: ежедневно из пробирок «контроль клеток» удаляют 0,1 мл среды и добавляют такое
