CC BY
60
№ 2 - 2007 г. 14.00.00 медицинские науки
УДК 616.36:616-004]-091.8
МИКРО- И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ТКАНЕВОГО МИКРОРАЙОНА ПЕЧЕНИ КРЫС В ОСТРОМ ПЕРИОДЕ ПОСЛЕ ОБЩЕЙ УПРАВЛЯЕМОЙ ГИПЕРТЕРМИИ
А.В. Ефремов, Ю.В. Пахомова, С.В. Мичурина, А.Д. Белкин, Г.М. Вакулин, А.В. Игнатова
ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава (г.
Новосибирск)
В современной медицине широко используются как медикаментозные, так и не медикаментозные методы воздействия на организм, одним из которых является гипертермия, применяемая в народной медицине уже несколько тысячелетий с лечебнопрофилактической целью.
Научные исследования показали, что воздействие на организм общей управляемой гипертермии (ОУГ) при температуре выше 40-41 °С приводит к гибели клеток, бактерий и вирусов. Однако ОУГ может оказывать на организм человека не только лечебное, но и неблагоприятное воздействие.
Патоморфологическое и ультрамикроскопическое исследование тканевого микрорайона печени в остром периоде после ОУГ позволило выявить разнообразие адаптивных реакций в ответ на действие высокой температуры.
Ключевые слова: гипертермия, адаптивные реакции
Введение. В современной медицине широко используются как медикаментозные, так и не медикаментозные методы воздействия на организм, одним из которых является гипертермия, применяемая в народной медицине уже несколько тысячелетий с лечебнопрофилактической целью.
Гипертермия ("гипер" (hyper) - высокий, сверх; "термия" (thermo, thermia) - тепло, нагрев)
- состояние, вызванное искусственным согревание всего тела (total body hyperthermia) или его части (regional hyperthermia) до уровня, превышающего границы обычного теплового режима организма, а точнее рубеж 370С [7]. Под термином "гипертермия" следует понимать повышение температуры тела, при условии обычного врачебного контроля, сверх допустимого предела 40-410С, а под термином <управляемая гипертермия> следует
понимать медицинский вариант метода гипертермии, допускающий повышение температуры сверх 410С, но требующий применения особой техники безопасности и участия специалистов.
Научные исследования показали, что воздействие на организм общей управляемой гипертермии (ОУГ) при температуре выше 40-410С приводит к гибели клеток, бактерий [6] и вирусов. Однако ОУГ может оказывать на организм человека не только лечебное, но и неблагоприятное воздействие.
Известно, что пребывание организма в условиях гипертермического воздействия приводит к метаболическим и функциональным изменениям на трех уровнях: молекулярном, клеточном и тканевом [2]. Рассматривая действие ОУГ на организм, следует иметь ввиду два возможных пути развития последующих изменений: во-первых, повышение температуры различных органов и тканей и непосредственное влияние температурного фактора на их структуру и обмен веществ в них, на их функцию, на структуру отдельных клеток и макромолекул [1], а во-вторых, включение различных механизмов адаптации с последующим влиянием на организм тех сдвигов, которые происходят вследствие борьбы организма за постоянство температуры тела [5].
Цель исследования: изучить микро- и ультраструктурные особенности адаптивных реакций тканевого микрорайона печени у крыс в остром периоде после ОУГ.
Материалы и методы. Объект исследования. Исследования проведены на 169 крысах -самцах линии Wistar (возраст 2,5 мес.). Животные содержались в условиях вивария при температуре воздуха 20-220С при стандартном рационе и свободном доступе к воде, что является важным для избежания неучтенных ненормированных стрессирующих воздействий.
С целью изучения особенностей адаптивных реакций, возникающих в остром периоде после действия ОУГ, экспериментальные животные были разделены на 4 группы в зависимости от сроков с момента воздействия: 1 группа - контроль (п = 41); 2 группа - 5 часов с момента перегревания (п = 50); 3 группа - 1-е сутки с момента перегревания (п = 37); 4 группа - 3-и сутки с момента перегревания (п = 41).
Экспериментальная модель. Разогревание животных производилось в полном соответствии со "Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных" [3], который предполагает разогревание объекта исследования в резервуаре стандартной термобани ТБ-110 при погружении в горячую воду до уровня шеи. Температурный режим нагрева горячей воды-теплоносителя составил 45 °С. Данную температуру можно считать оптимальной при моделировании ОУГ, так как более высокие значения приводят к гибели животных.
Уровень гипертермии, при котором прекращали разогревание, определялся ректальной температурой 43,50С (стадия теплового удара).
Термометрия осуществлялась с помощью дифференциальной термопары (медь-константан), подключенной к высокочувствительному микровольтметру-микроамперметру постоянного тока типа Ф 116/2, что позволяло с высокой точностью измерять даже небольшие перепады температур. Медные концы дифференциальной термопары подключали к измерительному прибору, при этом если спаи термопар находились при одинаковой температуре, то Тэдс равнялась 0 °С. Проверка и градуировка дифференциальной термопары осуществлялись путем погружения одного из ее спаев в
тающий лед (сосуд Дьюара), где температура составляла 0°С, а другого - в горячую воду определенной температуры, значение которой фиксировали точным ртутным термометром. При этом измеряли Тэдс на выходе дифференциальной термопары. При измерении ректальной температуры нагреваемых животных один из спаев дифференциальной термопары вводили в прямую кишку на глубину 3-4 см, а второй опускали в тающий лед (сосуд Дьюара). Таким образом, температурная разница между 0°С и ректальной температурой выражалась в микровольтах на шкале микровольтметра-микроамперметра. Непрерывное в ходе всего опыта и точное (до десятых долей градуса) измерение ректальной температуры позволяло извлекать животных из термобани в критический момент - на высоте развития теплового удара, что обеспечило их 100 % выживаемость.
Методика забора морфологических препаратов. Материал забирали под эфирным наркозом после декапитации животных. Кусочки печени фиксировали в нейтральном формалине. Сразу после пропитки ткани печени парафином (при 58°С) на санном микротоме делали парафиновые срезы толщиной 7 мкм и проводили их депарафинизацию в серии спиртов. Далее срезы промывали в течение 3 мин. в дистиллированной воде и помещали на 5 мин. в стандартный фосфатный буфер (ФБ) с рН 7,4 для последующей обработки. Для каждого из этапов эксперимента использовали 5-7 животных, от каждого из которых получали соответственно 5-7 блоков.
Методика электронной микроскопии. Для ультраструктурного исследования кусочки печени крыс (по 5 от органа каждого животного) величиной менее 1 мм3 фиксировали методом двойной фиксации: вначале в 4 % параформальдегидном изотоническом 0,1М фиксаторе на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,4) при комнатной температуре в течение 2 часов, затем после промывки в течение 15 мин. в охлажденном буфере Миллонига образцы в течение 1 ч дополнительно фиксировались на холоде в 1 % осмиевом фиксаторе на 0,2 М какодилатном буфере (рН 7,4) с добавлением в него 1,5 % ферроцианида калия. После дегидратации образцов в серии спиртов возрастающей концентрации они заключались в эпон-812.
Ультратонкие срезы толщиной 35-45 нм получали с эпоновых блоков на ультратоме LKB-8800, контрастировали вначале насыщенным водным раствором уранилацетата при 40°С в течение 40 мин, а затем - цитратом свинца при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 20 мин. После напыления углерода в вакууме контрастированные срезы изучались в электронном микроскопе JEM-7А. Изучению ультратонких срезов предшествовало исследование в световом микроскопе полутонких срезов (1 микрон), окрашенных толуидиновым синим, с целью прицельной ультратомии выбираемых на них различных зон печени. Определяли объемные, поверхностные и численные плотности органоидов, включений, везикулярных структур.
Результаты исследований и их обсуждение. Через 5 часов с момента окончания ОУГ в печени крыс микроскопически выявлены гемолимфоциркуляторные нарушения в виде чередования участков расширенных внутридольковых кровеносных синусоидных капилляров печени с участками их спазмирования.
В области триад наблюдалось значительное расширение междольковых сосудов (артерий и вен) и лимфатических пространств Малла. Центральные вены печени на этом сроке после ОУГ дилятированы, поддольковые вены значительно расширены и вокруг них определяются расширенные лимфатические коллекторы, что свидетельствует о застойных явлениях и нарушении оттока крови из органа. В области триад междольковые вены переполнены кровью, в некоторых местах стенки вен разорваны, в результате чего
происходит их объединение с лимфатическими пространствами Малла (рис. 1). Также отмечаются участки лимфоидной инфильтрации вокруг сосудов как в области триад, так и внутри печеночных долек (рис. 2). В ядрах гепатоцитов наблюдаются выраженные изменения (кариопикноз, кариолизис, кариорексис), в результате чего многие клетки лишены ядер. Цитоплазма большинства гепатоцитов вакуолизирована, особенно в перисунусоидальной области, где наблюдаются зоны обводнения. Отмечено просветление цитоплазмы в примембранной области, в обменном и биллиарном полюсах гепатоцитов. В кровеносных синусоидных капиллярах определяются сладжированные эритроциты, пенистые макрофаги и лимфоциты. Наряду с апоптотически измененными гепатоцитами наблюдается много диплокариоцитов.
На первые сутки с момента ОУГ в печени крыс микроскопически выявлено сохранение гемодинамических нарушений с преобладанием баллонообразно расширенных капилляров во всех печеночных дольках (рис. 3). Реже, по сравнению с предыдущим сроком, встречаются гепатоциты с деструктивно измененными ядрами и цитоплазмой, увеличивается количество диплокариоцитов. В области триад лимфатические пространства Малла расширены и заполнены лимфоидными элементами.
Ультраструктурно выявлено довольно частое сужение синусоидов в печени, нередкое сладжирование в них эритроцитов и появление в просветах кровеносных терминалей хлопьевидного диффузного материала, что обусловлено, по-видимому, синтезом в печени белков теплового шока и отложением фибрина в пространствах Диссе в условиях гипоксии.
Обращает на себя внимание нечеткость плазмолемм гепатоцитов, клеток стромы -эндотелиоцитов и клеток Купфера (рис. 4), что, вероятно, связано с изменением свойств мембран, которое, в свою очередь, приводит к повышению их повреждаемости, вызывающей деструктивные изменения как клеток эндотелиальной выстилки синусоидов в виде расширения фенестр эндотелиоцитов в зонах решетчатых пластинок с утратой в них диафрагм, так и гепатоцитов, цитоплазматические органоиды которых нередко обнаруживаются в просветах синусоидов в этом сроке после ОУГ. Появление детрита разрушенных клеток в синусоидах вызывает активацию печеночных макрофагов - клеток Купфера, что позволяет выявить в них крупные гетерофагосомы, переваривающие клеточные остатки. Обращает на себя внимание изменение структуры хроматина и ядерного матрикса с усилением конденсации гетерохроматина по периферии ядер эндотелиоцитов, происходящих в апоптозно измененных клетках.
Весьма характерными субклеточными изменениями гепатоцитов на этом этапе воздействия ОУГ являются нарушения ультраструктуры митохондрий, исчезновение из цитоплазмы клеток энергетического субстрата - гранул гликогена и значительная липидная инфильтрация цитоплазмы - признак нарушения выведения из клеток триглицеридов. В зонах печеночных долек было выражено набухание матрикса митохондрий с появлением в нем электронопрозрачных участков и нарушением структуры крист, что является выражением торможения митохондриального транспорта электронов. Определено, что торможение транспорта электронов в митохондриях гепатоцитов сопровождается компенсаторным гликолизом, при котором мобилизованный расщеплением гликоген используется для поддержания нормальной концентрации АТФ в клетках. В других зонах печеночных долек, где дефицит кислорода был менее выражен, отмечалась конденсация матрикса митохондрий, в результате чего почти не определяются в нем кристы, что характеризует конденсированную энергетическую, митохондриальную конфигурацию по Чансу, когда не осуществляется отвод электронов от митохондрий для метаболических целей клеток. Часть гепатоцитов имела митохондрии как с набухшим
матриксом, так и с конденсированным, что может быть следствием перехода митохондрий от стадии набухания к стадии уплотнения матрикса. Для такого рода клеток было типичным появление в них большого количества первичных лизосом, которые нередко тесно контактируют с липидными каплями, что обычно характеризует начальную фазу липолиза при обратном развитии липидной инфильтрации клеток. Интересно отметить, что значительное накопление липидных капель в цитоплазме гепатоцитов на первые сутки после ОУГ сопровождается и их появлением в ядрах клеток, что нередко связывают со снижением синтеза белков и ДНК.
Изучение ультраструктуры ядер на первые сутки после ОУГ выявило изменение круглой формы ядер на неправильную, трансформацию конденсированного гетерохроматина в глыбчатые, раздробленные осмиофильные сгустки. Отмечается появление мелкодисперсных, слабоосмиофильных хлопьевидных зон в эухроматине, видимо представляющих собой стрессорные белки. На первые сутки после действия ОУГ наблюдается 2 типа изменения ядрышек в ядрах гепатоцитов. В части ядер выявлена сегрегация и фрагментация ядрышек на фибриллярный и гранулярный компоненты, что свидетельствует о сохранении процессов синтеза ядрышковой РНК. Второй тип изменений ядрышек заключается в исчезновении из них гранулярного ультраструктурного компонента и конденсации утратившего осмиофильность фибриллярного компонента, превращающегося в ядрышковый фибриллярный слабоосмиофильный остаток с зонами просветлений и осмофильных вкраплений неясной природы. Отмеченная в данном эксперименте вариабельность ультраструктуры ядрышек в различных гепатоцитах в первые сутки после ОУГ может быть связана с тем, что органоиды клетки являются самыми лабильными органоидами, которые способны к эффективной репарации нарушенной ультраструктуры после прекращения действия повреждающего агента, а в ряде случаев и во время его действия.
Исходя их вышеописанных субклеточных изменений гепатоцитов следует, что их ультраструктурные особенности отражают преобладание в печени катаболических процессов на первые сутки после ОУГ. Снижение контраста клеточных мембран чаще всего объясняется их порозностью и рыхлостью, в силу происходящих в них изменений, ведущих к цитолизу клеток.
На первые сутки после ОУГ при ультраструктурном анализе наблюдались микроциркуляторные нарушения, демонстрирующие явления стаза крови в синусоидах, за счет сладжирования эритроцитов (рис. 5), перекрывающего капиллярный кровоток, либо замедления кровотока большим количеством тонкофибриллярного белкового материала в просветах синусоидов, видимо, осаждающегося на плазмалеммах клеток, из-за чего практически не определяются границы клеток, так как их мембраны нечетко контурируются. Наблюдаемая размытость плазмолемм клеток у мест стаза или замедления кровотока (рис. 5), очевидно, являлась следствием развивающейся в таких зонах печеночных долек гипоксии, в результате чего страдала функция митохондрий, которые сильно набухали. В них дезинтегративно нарушается структура крист, а в матриксе этих органоидов появляются аутолитические, осмиофильные флокуляты, как следствие протеолиза белков митохондрий, обычно проявляющегося в них в условиях кислородной недостаточности или ишемии. Не исключено, что в условиях воздействия ОУГ имела место и дискоординация цитозольных белков теплового шока 60 и 70 кДа, способствующих импорту белков для матрикса митохондрий. Интересно, что в таких гипоксических зонах печеночных долек, в ядрах гепатоцитов и эндотелиоцитов обнаруживаются компактизация ядрышек, накопление в ядрах плотных гранулярных тел и перихроматиновых гранул - признаки подавления синтеза рРНК и блокировки транспорта РНК из ядер, выявляемые при тепловом шоке, что сопровождается значительным
увеличением в клетках одного общего для всех воздействий белка молекулярной массой 68 кДа, что видимо, имело приспособительный характер.
На третьи сутки после ОУГ микроскопически выявлены сохраняющиеся гемодинамические нарушения: центральные вены расширены, эндотелиальная выстилка как в кровеносных капиллярах, так и в центральных венах во многих местах нарушена. Сосуды в области триад в некоторых областях резко расширены (рис. 6).
На третьи сутки после ОУГ при ультраструктурном анализе в части синусоидов печени выявлялось сравнительно небольшое количество тонкофиллярного белкового материала (рис. 7), среди которого реже, чем на первые сутки опыта определялись остатки разрушенных клеток в виде детрита, представляющего собой цитоплазматические органоиды, гранулы гликогена, клеточные мембраны. Это позволяет предполагать снижение протеолиза и цитолиза клеток, обусловленных уменьшением деструктивных метаболических преобразований в мембранах. На последнее указывала более выраженная четкость плазмалеммальных и внутриклеточных мембран клеток вне гипоксических зон печени.
Исходя из концепции тепловой гибели клеток, началом этого процесса служит накопление вторичных повреждений, индуцированных первичным поражением анизотропного гидрофобного ядра клеточной мембраны, приводящего к нарушению четвертичной структуры ферментов, снижающему их каталитическую способность, а также в результате нарушения липидного компонента мембраны, ведущего к падению градиента концентрации ионов внутри и вне клетки, что индуцирует каскад нарастающих повреждений функций клеток. Утрата ионного клеточного гомеостаза в условиях ОУГ и ограничения клеток кислородом чаще всего приводит к их необратимым повреждениям, но механизм выживания части из них заключается в способности к переводу клеточного метаболизма в новое гипометаболическое устойчивое состояние путем равновесия АТФ-зависимых и АТФ-обеспечивающих путей. Более выраженная прозрачность просветов капиллярного русла может быть свидетельством и меньшей наработки в печени тепловых стрессорных белков. На третьи сутки после ОУГ обращает на себя внимание снижение степени липидной инфильтрации гепатоцитов, которая приобретает характер мелкокапельной и, в основном, по периферии клеток как в зонах гипоксических печеночных долек, так и за их пределами. Очевидно, выявляемая в настоящем эксперименте уже на первые сутки после ОУГ в части гепатоцитов липолитическая активность лизосомального аппарата вызывает существенную <разгрузку> клеток от избытка триглицеридов к трем суткам, так как во многих гепатоцитах видны мелкие вакуоли резорбции липидных капель с их остатками (рис. 8). Наблюдаемая на первые сутки после ОУГ утрата гепатоцитами гликогена в результате гликолиза, создающего гипергликемию, сменяется интенсивным липолизом на третьи сутки после ОУГ, что, очевидно, приводит к выраженной стимуляции глюконеогенеза, о чем свидетельствует появление в части гепатоцитов большого количества гранул гликогена, буквально перенасыщающих цитоплазму клеток в виде полей розеток, или занимающих все свободные пространства между органоидами (рис. 8). Исходя из того, что белок теплового шока 70 кДа может взаимодействовать с гидрофобными участками белков в ядре и цитоплазме, с растущими цепями белков при трансляции и препятствовать их агрегации, можно предположить, что он может оказывать влияние на регуляторные геномные процессы путем взаимодействия с ядерными факторами. На вероятность такой экспрессии генов может указывать характер изменений ультраструктуры ядер и ядрышек гепатоцитов, субклеточные параметры которых были близки к физиологической норме. В таких гепатоцитах обнаруживается значительное уменьшение конденсированного хроматина по периферии ядер-носителей временно заблокированной информации, в
котором по мере конденсации происходит активация ранее не активированных генов [4]. Исследования по кратковременному тепловому воздействию на организм животных показали, что в клетках активируется определенное число ранее неактивных специфических генов, в результате чего образующиеся мРНК транслируются в белки теплового шока, число типов которых варьирует в различных организмах и клетках разных органов, но среди них обязательно есть белки с молекулярной массой 84-70 кДа, необходимые, очевидно, для поддержания гомеостаза. Субклеточные изменения ядрышек таких клеток сводились к гипертрофии - увеличению размеров ядрышек, что всегда связано с усилением синтеза РНК и белка. Отмеченные субклеточные изменения части гепатоцитов на третьи сутки после ОУГ свидетельствовали о начале адаптивных изменений в печени, направленных на компенсацию функций поврежденных или необратимо измененных гепатоцитов.
Выявленные различия субклеточных изменений в разных гепатоцитах на третьи сутки после ОУГ могут быть связаны со структурно-функциональной гетерогенностью гепатоцитов в печеночных дольках, определяемых различиями в кровоснабжении, т. е. степенью оксигенации и трофики перипортальных и перивенозных клеток, их различиями в ответ на повреждения и регенераторные стимулы.
Необходимо отметить, что на третьи сутки после ОУГ в печени обнаружены эндотелиоциты с начальными признаками развития апоптозных изменений в одних клетках, заключающихся в конденсации хроматина ядер и утрате гранулярного компонента ядрышек и прогрессии апоптозных изменений в других - со значительно более выраженной конденсацией хроматина ядер, уплотнением цитоплазмы клеток без изменений ультраструктуры органоидов и <отшнуровкой> от клеток апоптозных телец в просвет синусоидов, что является типичными признаками апоптоза, который может быть вызван различными факторами, включая ОУГ.
Весьма примечательным было обнаружение на третьи сутки после ОУГ в лимфатических терминалиях печени - пространствах Диссе - скоплений плазматических клеток с выраженным развитием ГЭР, каналы которого были переполнены иммуноглобулинами, что свидетельствовало об интенсивной наработке антител. Обращает на себя внимание "заякоривание" плазмацитов за пучки коллагеновых фибрилл, образующих стромальных каркас печени и тесную их адгезию к плазмалеммам отростков эндотелиоцитов, выполняющих синусоидальную выстилку. Интересным было то обстоятельство, что часть из таких плазмоцитов обнаруживали конденсацию хроматина ядер, характерную для апоптоза. Причиной накопления плазмоцитов в пространствах Диссе на третьи сутки после ОУГ также могут быть продолжающиеся деструктивные изменения клеток в печени и связанные с этим возрастания уровня хемокинов в органе.
Выводы. Патоморфологическое и ультрамикроскопическое исследование тканевого микрорайона печени в остром периоде после ОУГ позволило выявить разнообразие адаптивных реакций в ответ на действие высокой температуры. Во-первых, в качестве адаптационного проявления в ответ на резкое увеличение потребностей в энергетических субстратах на фоне истощения запасов гликогена в печени при ОУГ можно рассматривать, как это ни парадоксально, активацию глюконеогенеза. Во-вторых, адаптационным проявлением можно считать тот факт, что гепатоциты способны длительное время сохранять хотя бы минимум своих функций. В-третьих, проявлением адаптационных реакций в условиях ОУГ, когда нарушается детоксикационная функция печени, становится адсорбция токсичных продуктов из кровотока в лимфатическое русло.
В то же время можно говорить, что цена адаптации при ОУГ является достаточно высокой, поскольку белок используется не прямому (пластическому) назначению, а расходуется на обеспечение организма определенным энергетическим субстратом, который оказывается при этом слишком уж <дорогим>. Выражение "печка топится ассигнациями" максимально характеризует критическое положение дел в остром постгипертермическом периоде, когда организм живет исключительно за счет внутренних резервов и расходует на покрытие энергетических потребностей собственные белки.
Развитие при ОУГ метаболической перестройки в организме за счет активации протеолиза и выраженной деструкции мембран клеток, что подтверждается результатами исследования, может быть расценено как положительный момент при использовании высокой температуры в качестве лечебного метода, поскольку в остром периоде после ОУГ клеточные структуры переходят на новый уровень своей организации.
Список литературы
1. АлександровВ.Я. Клетки, макромолекулы и температура / В.Я. Aлександров // Л.: Наука, 1975. - 330 с.
2. Баллюзек Ф.В. Управляемая гипертермия / Ф.В. Баллюзек [и др.] // СПб.: "Невский Диалект", 2001. - 123 с.
3. Ефремов А.В. и др. Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных. Патент РФ N 2165105. Опубл. в Бюл. N 10. - 2001.
4. ЗбарскийИ. Б. Организация клеточного ядра / И.Б. Збарский // М.: Медицина, 1988.
- 367 с.
5. Козлов Н.Б. Гипертермия: биохимические основы патогенеза, профилактики, лечения / Н.Б. Козлов // Воронеж: Изд-во Воронежского университета, 1990. - 103 с.
6. Ступко А.И. Здравоохр. Белоруссии / A.H Ступко, A^. Служинская // 1990. - N 9. -С. 59-б1.
7. Swan H. Thermoregulation and bioenergetic / Н. Swan // Amsterdam: Elsevier, 1974. -342 p.
