CC BY
36
нию волнами ТГЧ-диапазона N0, что свидетельствует о низкой эффективности изучаемого режима в предотвращении нарушений в функциональной активности эритроцитов (табл.2). Показатели функциональной активности эритроцитов опытной группы с высокой степенью достоверности отличаются от данных группы контроля, что подтверждает низкую эффективность превентивного 5-минутного облучения волнами ТГЧ-диапазона на частотах МСИП N0 150,176-150,664 ГГц в восстановлении нарушенной функциональной активности эритроцитов (агрегации и
деформируемости) при остром иммобилизационном стрессе.
Таблица 2
Показатели функциональной активности эритроцитов у крыс-самцов, подвергнутых воздействию ЭМИ ТГЧ диапазона МСИП N0 150,176150,664 ГГц при острой стресс-реакции
Показатели Кон- троль (n=15) Стрессор (n=15) Превентивное облучение в течение (мин)
5 (n=15) 15 (n=15) 30 (n=15)
Индекс деформируемости эритроцитов (усл. ед.) 1,05 (1,04; 1,08) 1,09 (1,07; 1,13) Р,=0,004494 ) 0 3 ^ ® ^ waTa. 1,06 (1,04;1,07) Р1=0,755736 P2=0,007017 1,06 (1,04;1,08) Р1=0,633364 P2=0,007941
Индекс агрегации эритроцитов (усл. ед.) 1,33 (1,3; 1,36) 1,45 (1,43;1,49) Р1=0,00026 1,43 (1,38; 1,47) Р1=0,000068 P2=0,633364 1,33 (1,29; 1,37) Р1=0,708923 P2=0,000019 1,32 (1,31;1,35) Р1=0,455302 P2=0,000010
Примечания: те же, что и в табл.1.
При изучении влияния превентивного облучения электромагнитными терагецовыми волнами МСИП N0 150,176150,664 ГГц в течение 15 минут животных, подвергнутых острому стрессу, показано, что исследуемый временной режим ведет к сохранению уровня вязкости крови, характерной для животных контрольной группы. Об этом говорит отсутствие статистически достоверной разницы показателей вязкости крови между группой контроля и опытной группой (табл.1), а также функциональной активности эритроцитов (табл.2). Этот временной режим облучения является эффективным для предотвращения постстрессорных нарушений в реологических свойствах крови. Изучение влияния предварительного 30-минутного воздействия электромагнитными волнами терагерцового диапазона МСИП N0 150,176-150,664 ГГц на вязкостные свойства крови и функциональную активность эритроцитов показало, что этот режим облучения также эффективно предотвращает развитие острых постстрессорных изменений в показателях реологии крови (табл.1 и 2).
Выводы. Острый стресс (однократная 3-часовая иммобилизация крыс) приводит к увеличению вязкости цельной крови и нарушению функциональной активности эритроцитов (увеличение их агрегационной способности и деформируемости); превентивное облучение электромагнитными волнами терагерцового диапазона частот МСИП N0 150,176-150,664 ГГц в зависимости от временных режимов воздействия способно предотвращать острые стресс-зависимые нарушения вязкости крови и функциональной активности эритроцитов - деформируемости и агрегации: 5-минутное воздействие оказывает слабо выраженный восстановительный эффект в предотвращении стрессорных нарушений реологии крови в сосудах среднего и большого калибра, но не оказывает восстанавливающего эффекта в сосудах микроциркуляции; 15- и и 30-минутные режимы превентивного воздействия электромагнитными терагерцовыми волнами на частотах МСИП N0 150,176-150,664 ГГц эффективны и полностью предотвращают стресс-зависимые нарушения вязкости крови и функциональной активности эритроцитов.
Литература
I.ЧернухА.М. и др. Микроциркуляция.- М.: Медицина-
1975.
2.Киричук В.Ф. и др. Микроциркуляция и электромагнитное излучение ТГЧ-диапазона.- Саратов.:Изд-во СГМУ.-2006.
3.ЛевтовВ.А Реология крови.- М.: Медицина, 1982.
4.Помошникова О.И. Влияние ТГЧ-излучения на частотах
молекулярного спектра излучения и поглощения оксида азота 150,176-150,664 ГГц на качественный и количественный состав эритроцитов крови белых крыс, находящихся в состоянии иммо-билизационного стресса: Автореферат дис.. .канд.мед.наук.-
Саратов, 2006.- 23 с.
5.Использование электромагнитных волн мм-диапазона в комплексном лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы: Уч. пос.- Саратов, Изд-во СГМУ. 2006.- 159 с.
6.Ройтман Е.В. // Тромбоз, гемостаз, реология.- 2003.-№3.- С. 13-27.
7. Е.В. Шляхто и др. // Кардиол.-2004.-Т.44, №4.- С. 20-23.
8.Lloyd-Jones D.M. et al. // Lancet.- 1999.- Vol. 353.- P. 89.
9.МеньщиковаН.К. и др. // Биохимия.- 2000.- №4.- С. 485.
lO.Ignarro L.G. // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.- 1990.-
Vol.30 - Р. 535-560.
ll.Ignarro L.G., WoodK.S. // Bichem. Biophys. Acta.- 1987.-Vol. 928.- Р. 160-170.
12.Furchgott R.F., Jothianandan D. // Blood Vessels.-1991.-Vol. 28.- P. 52-61.
13.Малышев И.Ю., Манухина Е.Б. // Биохимия.-1998.-№63 (7).- С. 992-1006.
14.Бецкий О.В. и др. // Биомед. технол. и радиоэлектроника.- 2003.- № 12.- С. 3-6.
15.Креницкий А.П. и др. // Биомед. технол. и радиоэлектроника.- 2003.- №2.- С. 17-24.
УДК 553.7.031.4
ОЦЕНКА ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОГО И САНОГЕНЕТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТОВ ОБЩЕЙ УПРАВЛЯЕМОЙ ГИПЕРТЕРМИИ НА ПРИМЕРЕ АНАЛИЗА СОСТОЯНИЯ ТКАНЕВОГО МИКРОРАЙОНА ПЕЧЕНИ КРЫС ЛИНИИ Ш^аг
К.А. АСТАФЬЕВА, К.К. ДМИТРИЕВА, А.В. ЕФРЕМОВ, А.В. ИГНАТОВА, С.В. МИЧУРИНА, Е.В. ОВСЯНКО, Я.У. ОВСЯНКО, Ю.В. ПАХОМОВА, М.Г. ПУСТОВЕТОВА, В.С. САЗОНОВ, А.В. САМСОНОВ*
Гипертермия - состояние, вызванное искусственным согреванием всего тела или его части до уровня, превышающего границы обычного теплового режима организма, а точнее рубеж 37 0С [7]. Под термином «гипертермия» понимают повышение температуры тела сверх допустимого предела 40—41 0С.
Медицинский вариант метода гипертермии - «управляемая гипертермия», в ходе которой допускается повышение температуры тела сверх 41 0С. При этом обязательным является применение особой техники безопасности и участие специалистов-анестезиологов. Воздействие на организм общей управляемой гипертермии (ОУГ) при температуре >40-41 0С ведет к разрушению белковых структур клеточных мембран и гибели клеток, бактерий [6] и вирусов. Пребывание организма в условиях гипер-термического воздействия приводит к метаболическим и функциональным изменениям на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях многоклеточного организма [2]. Рассматривая действие ОУГ на организм, надо иметь в виду два возможных пути развития изменений: рост температуры органов и тканей и влияние температурного фактора на их структуру и обмен веществ в них, на их функцию, на структуру клеток и макромолекул [1], включение различных механизмов адаптации с последующим влиянием на организм тех сдвигов, которые происходят из-за борьбы организма за постоянство температуры тела [5].
Цель исследования - оценка пато- и саногенетические эффектов воздействия ОУГ на основе анализа состояния тканевого микрорайона печени крыс.
Материалы и методы. Объектом исследования являлись крысы-самцы линии Ш1в1аг (возраст 2,5 мес.) в количестве 60 особей. В ходе эксперимента животные были разделены на 4 группы в зависимости от сроков с момента воздействия: 1 группа
- контроль (п=15); 2 группа - 5 ч с момента перегревания (п = 15); 3 группа - 1-е сутки с момента перегревания (п = 15); 4 группа - 3-и сутки с момента перегревания (п=15). Разогревание животных производилось в соответствии со «Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» [3] в резервуаре универсального водного термостата ВШТ-и, предназначенного для точного поддержания установленной температуры в диапазоне от +25 до +100 °С в водяной бане, при погружении в горячую воду до уровня шеи. Температурный режим нагрева воды-теплоносителя составил 45 °С. Эту температуру можно считать оптимальной при моделировании ОУГ, т.к. более высокие значения ведут к гибели животных. Уровень гипертермии, при котором прекращали разогрева-
* Новосибирский ГМУ
ние, определялся ректальной температурой 43,5 0С (стадия теплового удара). Термометрия осуществлялась с помощью дифференциальной термопары (медь - константан), подключенной к высокочувствительному микровольтметру-микроамперметру постоянного тока типа Ф 116/2, что позволяло с высокой точностью измерять перепады температур. Непрерывное и точное измерение ректальной температуры позволяло извлекать животных из термобани в критический момент - на высоте развития теплового удара, что обеспечило их 100% выживаемость.
Экспериментальный материал (кусочки печени) забирали под эфирным наркозом после декапитации животных и фиксировали в нейтральном формалине. Сразу после пропитки ткани печени парафином (при 58 0С) на санном микротоме делали парафиновые срезы толщиной 7 мкм и проводили их депарафи-низацию в серии спиртов. Далее срезы промывали в течение 3 мин в дистиллированной воде и помещали на 5 мин в стандартный фосфатный буфер (ФБ) с рН 7,4 для последующей обработки. Для каждого из этапов опыта использовали 5-7 животных, от каждого из которых получали соответственно 5-7 блоков.
Для ультраструктурного исследования кусочки печени крыс (по 5 от органа каждого животного) величиной <1 мм3 фиксировали методом двойной фиксации: вначале в 4% параформальде-гидном изотоническом 0,1 М фиксаторе на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,4) при комнатной температуре в течение 2 ч, затем после промывки в течение 15 мин в охлажденном буфере Миллонига образцы в течение 1 ч дополнительно фиксировались на холоде в 1% осмиевом фиксаторе на 0,2 М какодилатном буфере (рН 7,4) с добавлением в него 1,5% ферроцианида калия. После дегидратации образцов в серии спиртов возрастающей концентрации они заключались в эпон-812. Ультратонкие срезы толщиной 35-45 нм получали с эпоновых блоков на ультратоме ЬКБ-8800, контрастировали насыщенным водным р-ром уранил-ацетата при 40 0С в течение 40 мин, а затем - цитратом свинца при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 20 мин. После напыления углерода в вакууме контрастированные срезы изучались в электронном микроскопе ШМ-7А. Изучению ультра-тонких срезов предшествовало исследование в световом микроскопе полутонких срезов (1 микрон), окрашенных толуидиновым синим для прицельной ультратомии выбираемых на них зон печени. Определяли объемные, поверхностные и численные плотности органоидов, включений, везикулярных структур.
Результаты. Через 5 ч с момента окончания перегревания в печени крыс микроскопически были выявлены гемолимфоциркуляторные нарушения в виде чередования участков расширенных внутридольковых кровеносных синусоидных капилляров печени с участками их спазмирования. В области триад наблюдалось значительное расширение междольковых сосудов (артерий и вен) и лимфатических пространств Малла. Центральные вены печени на этом сроке после ОУГ дилатированы, поддольковые вены значительно расширены и вокруг них определяются расширенные лимфатические коллекторы, что свидетельствует о застойных явлениях и нарушении оттока крови из органа. В области триад междольковые вены переполнены кровью, в некоторых местах стенки вен разорваны, в результате чего происходит их объединение с лимфатическими пространствами Малла. Отмечаются участки лимфоидной инфильтрации вокруг сосудов в области триад и внутри печеночных долек. В ядрах гепатоцитов наблюдаются изменения (кариопикноз, кариолизис, кариорек-сис), в результате чего многие клетки лишены ядер. Цитоплазма большинства гепатоцитов вакуолизирована, особенно в перису-нусоидальной области, где наблюдаются зоны обводнения. Отмечено просветление цитоплазмы в примембранной области, в обменном и биллиарном полюсах гепатоцитов. В кровеносных синусоидных капиллярах определяются сладжированные эритроциты, пенистые макрофаги и лимфоциты. Наряду с апоптотиче-ски измененными гепатоцитами много диплокариоцитов.
На первые сутки эксперимента в печени крыс микроскопически было выявлено сохранение гемодинамических нарушений с преобладанием баллонообразно расширенных капилляров во всех печеночных дольках. Реже, по сравнению с предыдущим сроком, встречаются гепатоциты с деструктивно измененными ядрами и цитоплазмой, увеличивается количество диплокариоци-тов. В области триад лимфатические пространства Малла расширены и заполнены лимфоидными элементами.
Ультраструктурно было выявлено довольно частое сужение синусоидов в печени, нередкое сладжирование в них эритроцитов
и появление в просветах кровеносных терминалей хлопьевидного диффузного материала, что обусловлено, по-видимому, синтезом в печени белков теплового шока и отложением фибрина в пространствах Диссе в условиях гипоксии. Обращает на себя внимание нечеткость плазмолемм гепатоцитов, клеток стромы - эндо-телиоцитов и клеток Купфера, что, вероятно, связано с изменением свойств мембран, которое, в свою очередь, приводит к повышению их повреждаемости, вызывающей деструктивные изменения как клеток эндотелиальной выстилки синусоидов в виде расширения фенестр эндотелиоцитов в зонах решетчатых пластинок с утратой в них диафрагм, так и гепатоцитов, цитоплазматические органоиды которых нередко обнаруживаются в просветах синусоидов в этом сроке после ОУГ. Появление детрита разрушенных клеток в синусоидах вызывает активацию печеночных макрофагов - клеток Купфера, что позволяет выявить в них крупные гетерофагосомы, переваривающие клеточные остатки. Обращает на себя внимание изменение структуры хроматина и ядерного матрикса с усилением конденсации гетерохроматина по периферии ядер эндотелиоцитов, происходящих в апоптозно измененных клетках. Весьма характерными субклеточными изменениями гепатоцитов на этом этапе воздействия ОУГ являются нарушения ультраструктуры митохондрий, исчезновение из цитоплазмы клеток энергетического субстрата - гранул гликогена и значительная липидная инфильтрация цитоплазмы - признак нарушения выведения из клеток триглицеридов. В зонах печеночных долек было выражено набухание матрикса митохондрий с появлением в нем электронопрозрачных участков и нарушением структуры крист, что является выражением торможения митохондриального транспорта электронов. Определено, что торможение транспорта электронов в митохондриях гепатоцитов сопровождается компенсаторным гликолизом, при котором мобилизованный расщеплением гликоген используется для поддержания нормальной концентрации АТФ в клетках. В других зонах печеночных долек, где дефицит кислорода был менее выражен, отмечалась конденсация матрикса митохондрий, в результате чего почти не определяются в нем кристы, что характеризует конденсированную энергетическую, митохондриальную конфигурацию по Чансу, когда не осуществляется отвод электронов от митохондрий для метаболических целей клеток.
Часть гепатоцитов имела митохондрии как с набухшим матриксом, так и с конденсированным, что может быть следствием перехода митохондрий от стадии набухания к стадии уплотнения матрикса. Для такого рода клеток было типичным появление в них большого количества первичных лизосом, которые нередко тесно контактируют с липидными каплями, что характеризует начальную фазу липолиза при обратном развитии липидной инфильтрации клеток. Значительное накопление липидных капель в цитоплазме гепатоцитов на первые сутки после ОУГ сопровождается и их появлением в ядрах клеток, что часто связывают со спадом синтеза белков и ДНК.
Изучение ультраструктуры ядер на первые сутки после ОУГ выявило изменение круглой формы ядер на неправильную, трансформацию конденсированного гетерохроматина в глыбча-тые, раздробленные осмиофильные сгустки. Отмечается появление мелкодисперсных, слабоосмиофильных хлопьевидных зон в эухроматине, видимо представляющих собой стрессорные белки. На первые сутки после действия ОУГ наблюдается 2 типа изменения ядрышек в ядрах гепатоцитов. В части ядер была выявлена сегрегация и фрагментация ядрышек на фибриллярный и гранулярный компоненты, что свидетельствует о сохранении процессов синтеза ядрышковой РНК. Второй тип изменений ядрышек заключается в исчезновении из них гранулярного ультраструктурного компонента и конденсации утратившего осмиофильность фибриллярного компонента, превращающегося в ядрышковый фибриллярный слабоосмиофильный остаток с зонами просветлений и осмофильных вкраплений неясной природы. Отмеченная в данном эксперименте вариабельность ультраструктуры ядрышек в различных гепатоцитах в первые сутки после ОУГ может быть связана с тем, что органоиды клетки являются самыми лабильными органоидами, которые способны к эффективной репарации нарушенной ультраструктуры после прекращения действия повреждающего агента, а в ряде случаев и во время его действия. Исходя их вышеописанных субклеточных изменений гепатоци-тов, следует, что их ультраструктурные особенности отражают преобладание в печени катаболических процессов на первые сутки после ОУГ. Снижение контраста клеточных мембран чаще
всего объясняется их порозностью и рыхлостью в силу происходящих в них изменений, ведущих к цитолизу клеток.
На первые сутки после ОУГ при ультраструктурном анализе наблюдались микроциркуляторные нарушения, демонстрирующие явления стаза крови в синусоидах, за счет сладжирова-ния эритроцитов, перекрывающего капиллярный кровоток, либо замедления кровотока большим количеством тонкофибриллярного белкового материала в просветах синусоидов, видимо, осаждающегося на плазмалеммах клеток, из-за чего практически не определяются границы клеток, так как их мембраны нечетко контурируются. Наблюдаемая размытость плазмолемм клеток у мест стаза или замедления кровотока, очевидно, являлась следствием развивающейся в таких зонах печеночных долек гипоксии, в результате чего страдала функция митохондрий, которые сильно набухали. В них дезинтегративно нарушается структура крист, а в матриксе этих органоидов появляются аутолитические, осмио-фильные флокуляты, как следствие протеолиза белков митохондрий, обычно проявляющегося в них в условиях кислородной недостаточности или ишемии. Не исключено, что в условиях воздействия ОУГ имела место и дискоординация цитозольных белков теплового шока 60 и 70 кДа, способствующих импорту белков для матрикса митохондрий. Интересно, что в таких гипок-сических зонах печеночных долек, в ядрах гепатоцитов и эндоте-лиоцитов обнаруживаются компактизация ядрышек, накопление в ядрах плотных гранулярных тел и перихроматиновых гранул -признаки подавления синтеза рРНК и блокировки транспорта РНК из ядер, выявляемые при тепловом шоке, что сопровождается значительным увеличением в клетках одного общего для всех воздействий белка молекулярной массой 68 кДа, что, видимо, имело приспособительный характер.
На 3 сутки после ОУГ микроскопически были выявлены сохраняющиеся гемодинамические нарушения: центральные
вены расширены, эндотелиальная выстилка в кровеносных капиллярах и в центральных венах во многих местах нарушена. Сосуды в области триад в ряде областей резко расширены. На 3 сутки после ОУГ при ультраструктурном анализе в части сину-соидов печени выявлялось сравнительно небольшое количество тонкофиллярного белкового материала, среди которого реже, чем на первые сутки опыта определялись остатки разрушенных клеток в виде детрита, представляющего собой цитоплазматические органоиды, гранулы гликогена, клеточные мембраны. Это позволяет предполагать снижение протеолиза и цитолиза клеток, обусловленных уменьшением деструктивных метаболических преобразований в мембранах. На последнее указывала более выраженная четкость плазмалеммальных и внутриклеточных мембран клеток вне гипоксических зон печени. Исходя из концепции тепловой гибели клеток, началом этого процесса служит накопление вторичных повреждений, индуцированных первичным поражением анизотропного гидрофобного ядра клеточной мембраны, приводящего к нарушению четвертичной структуры ферментов, снижающему их каталитическую способность, а также из-за нарушения липидного компонента мембраны, ведущего к падению градиента концентрации ионов внутри и вне клетки, что индуцирует каскад нарастающих повреждений функций клеток. Утрата ионного клеточного гомеостаза в условиях ОУГ и ограничения клеток кислородом чаще приводят к их необратимым повреждениям, но механизм выживания части из них заключается в способности к переводу клеточного метаболизма в новое гипометаболическое устойчивое состояние путем равновесия АТФ-зависимых и АТФ-обеспечивающих путей. Большая прозрачность просветов капиллярного русла показывает и меньшую наработку в печени тепловых стрессорных белков.
На 3 сутки после ОУГ обращает налицо снижение степени липидной инфильтрации гепатоцитов, которая приобретает характер мелкокапельной и в основном по периферии клеток в зонах гипоксических печеночных долек и за их пределами. Выявляемая уже на 1-е сутки после ОУГ у части гепатоцитов липоли-тическая активность лизосомального аппарата вызывает «разгрузку» клеток от избытка триглицеридов к трем суткам, так как во многих гепатоцитах видны мелкие вакуоли резорбции липидных капель с их остатками. Наблюдаемая на 1-е сутки после ОУГ утрата гепатоцитами гликогена в результате гликолиза, создающего гипергликемию, сменяется интенсивным липолизом на третьи сутки после ОУГ, что, очевидно, приводит к выраженной стимуляции глюконеогенеза, о чем говорит появление у части гепатоцитов большого числа гранул гликогена, перенасыщающих
цитоплазму клеток в виде полей розеток или занимающих все свободные пространства между органоидами.
Исходя из того, что белок теплового шока 70 кДа может взаимодействовать с гидрофобными участками белков в ядре и цитоплазме, с растущими цепями белков при трансляции и препятствовать их агрегации, можно предположить, что он может оказывать влияние на регуляторные геномные процессы путем взаимодействия с ядерными факторами. На вероятность такой экспрессии генов может указывать характер изменений ультраструктуры ядер и ядрышек гепатоцитов, субклеточные параметры которых были близки к физиологической норме. В таких гепато-цитах обнаруживается значительное уменьшение конденсированного хроматина по периферии ядер-носителей временно заблокированной информации, в котором по мере конденсации происходит активация ранее не активированных генов [4]. Исследования по кратковременному тепловому воздействию на организм животных показали, что в клетках активируется определенное число ранее неактивных специфических генов. Образующиеся в результате этого мРНК транслируются в белки теплового шока, число типов которых варьирует в различных организмах и клетках разных органов, но среди них обязательно есть белки с молекулярной массой 84-70 кДа, необходимые, очевидно, для поддержания гомеостаза. Субклеточные изменения ядрышек таких клеток сводились к гипертрофии - увеличению размеров ядрышек, что всегда связано с усилением синтеза РНК и белка. Отмеченные субклеточные изменения части гепатоцитов на 3 сутки после ОУГ говорили о начале адаптивных изменений в печени, направленных на компенсацию функций поврежденных или необратимо измененных гепатоцитов. Выявленные различия субклеточных изменений в гепатоцитах на 3 сутки после ОУГ могут быть связаны со структурно-функциональной гетерогенностью гепатоцитов в печеночных дольках, определяемых различиями в кровоснабжении, т.е. степенью оксигенации и трофики перипортальных и перивенозных клеток, их различиями в ответ на повреждения и регенераторные стимулы.
Необходимо отметить, что на третьи сутки после ОУГ в печени были обнаружены эндотелиоциты с начальными признаками развития апоптозных изменений в одних клетках, заключающихся в конденсации хроматина ядер, и утрате гранулярного компонента ядрышек и прогрессии апоптозных изменений в других - со значительно более выраженной конденсацией хроматина ядер, уплотнением цитоплазмы клеток без изменений ультраструктуры органоидов и «отшнуровкой» от клеток апоптозных телец в просвет синусоидов, что является типичными признаками апоптоза, который может быть вызван различными факторами, включая ОУГ. Примечательным было обнаружение на 3 сутки после ОУГ в лимфатических терминалиях печени - пространствах Диссе - скоплений плазматических клеток с выраженным развитием гранулярного эндоплазматического ретикулюма, каналы которого были переполнены иммуноглобулинами, что свидетельствовало об интенсивной наработке антител. Интересно «заякоривание» плазмоцитов за пучки коллагеновых фибрилл, образующих стромальный каркас печени и тесную их адгезию к плазмалеммам отростков эндотелиоцитов, выполняющих синусоидальную выстилку. Часть из таких плазмоцитов обнаруживали конденсацию хроматина ядер, характерную для апоптоза. Причиной накопления плазмоцитов в пространствах Диссе на 3 сутки после ОУГ также могут быть продолжающиеся деструктивные изменения клеток в печени и связанные с этим возрастания уровня хемокинов в органе.
Выводы. Патоморфологическое и ультрамикроскопическое исследования тканевого микрорайона печени в остром периоде после ОУГ позволили выявить наличие как патогенетического, так и саногенетического эффектов действия высокой внешней температуры на организм животного. Так, если в первые часы после воздействия наблюдалась массовая деструкция мембран гепатоцитов, то уже на 3-и сутки эксперимента отмечалось появление единичных диплоидных клеток, количество которых достигало максимальных значений на 21-е сутки после ОУГ. Таким образом, развитие при ОУГ метаболической перестройки в организме происходит за счет активации протеолиза и выраженной деструкции мембран клеток, что подтверждается результатами исследования и может быть расценено как положительный момент при использовании высокой температуры в качестве лечебного метода, поскольку в остром периоде после ОУГ клеточные структуры переходят на новый уровень своей организации.
Литература
1. Александров В. Я. Клетки, макромолекулы и
температура.- Л.: Наука, 1975.- 330 с.
2. Баллюзек Ф. В. Управляемая гипертермия.- СПб:
Невский Диалект, 2001.- 123 с.
3. Ефремов А. В. и др. Способ экспериментального
моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных
животных. Патент РФ N 2165105. Опубл. в Бюл. N 10.- 2001.
4. Збарский И. Б. Организация клеточного ядра.- М.: Медицина, 1988.- 367 с.
5. Козлов Н.Б. Гипертермия: биохимические основы
патогенеза, профилактики, лечения.- Воронеж: Изд-во
ВоронежГУ, 1990.- 103 с.
6. Ступко А. И., Служинская А. Б. Здравоохранение Белоруссии.- 1990.- №9.- С. 59-61.
7. Swan H. Thermoregulation and bioenergetic.- Amsterdam : Elsevier, 1974.- 342 p.
EVALUATION OF PATHOGENETIC AND SANOGENETIC EFFECTS OF GENERAL CONTROLED HYPERTHERMIA, AN EXAMPLE THE ANALYSIS STATE OF TISSUE MICROAREA OF LIVER IN RATS WISTAR
K.A. ASTAFIEVA, K.K. DMITRIEVA, A.V. EFREMOV, A.V. IGNATOVA,
S.V. MICHURINA,EV. OVSYANKO,YA.U. OVSYANKO,
YU.V. PAKHOMOVA, M.G. PUSTOVETOVA, V.S. SAZONOV,
A.V. SAMSONOV
Summary
The pathomorphologcal and ultramicroscopic studies of tissue microarea of liver in acute period after general controlled hyperthermia allow to reveal the presence of pathogenetic and sanogenetic action effects of high exterior temperature on animal organisme.
Key words: microarea of liver, high exterior temperature
УДК 615.91.036.11-07:616.155.32-092
ВЛИЯНИЕ ПОДОСТРОГО ОТРАВЛЕНИЯ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ НА ФУНКЦИЮ СУБПОПУЛЯЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ
П.Ф. ЗАБРОДСКИЙ, В.Ф. КИРИЧУК, С.В. БАЛАШОВ, В.Г. ЛИМ, А.А. СВИСТУНОВ*
Тетрахлорметан (ТХМ, четыреххлористый углерод) широко используется в промышленности как растворитель, для чистки и обезжиривания одежды в быту и производственных условиях. В клинической токсикологии отравления ТХМ составляют до 60% всех больных с токсическим поражением печени [2]. Летальность, которая при пероральных отравлениях составляет 30%, а при ингаляционных - 15-20%, может быть связана с вторичным иммунодефицитным состоянием [1]. От особенностей поражения ТХМ популяций Т-лимфоцитов, В-клеток зависит характер формирования вторичного иммунодефицитного состояния и способы коррекции нарушений иммунного статуса [1,5].
Цель работы - оценка цитокинового профиля (содержание в крови ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4) и связанных с ним иммунных реакций, отражающих функцию ТЫ- и Th2-лимфоцитов, активности эстераз в Т-клетках при подостром отравлении ТХМ.
Материал и методы. Опыты проводили на неинбредных белых крысах обоего пола массой 180-240 г. ТХМ вводили per os в растворе оливкового масла (DL50 ТХМ составляла 6,5+0,6 г/кг). ТХМ применяли в дозе 1/4 DL50 в течение 4 сут и 1/13 DL50 в течение 13 сут для оценки соответственно функции Th1- и Th2-лимфоцитов. Концентрацию ИФН-у исследовали плазме крови крыс через 4 сут после первой инъекции ТХМ, а цитокины ИЛ-2 и ИЛ-4 - через 13 сут после первого введения ТХМ методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. Сроки определения цитокинов в крови соответствовали особенностям иммуногенеза при иммунизации эритроцитами барана (ЭБ). Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммунотоксикологии и иммунологии [1,3]. Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимому антигену (ЭБ), характеризующую способность Th1-лимфоцитов участвовать в продукции В-лимфоцитами (плазматическими клетками) IgM,
* Саратовский ГМУ, ГСП-71, ул. Большая Казачья,' 12
определяли по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке через 4 сут после иммунизации, функцию ТЫ-лимфоцитов
- по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Функцию ТЪ2-лимфоцитов исследовали по числу АОК, синтезирующие ^О к ЭБ, в селезенке на пике продукции данного иммуноглобулина (14 сут) методом непрямого локального гемолиза в геле [3]. Крыс иммунизировали внутривенно ЭБ в дозе 2-108 клеток одновременно с первым введением ТХМ. При оценке всех иммунных реакций животные получали суммарную эквилеталь-ную дозу ТХМ (1,0 ЭГ50). Активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в Т-лимфоцитах определяли через 4 сут после интоксикации, выделяя клетки из селезенки методом [4] и осуществляя реакции и расчеты по методу [6]. Активность а-нафтил-А8-ацетатэстеразы и а-нафтил-бутиратэстеразы, содержащихся в основном в Т-клетках спленоцитов [1], изучали гистохимическим методом [1] через 4 сут после воздействия ТХМ в дозе 1/4 DL50. Данные обрабатывали статистически по ^критерию достоверности Стьюдента. Определяли коэффициенты корреляции (г) между показателями иммунного статуса, активностью АХЭ Т-клеток
Результаты. При исследовании уровня цитокинов в плазме крови крыс (табл. 1) установлено уменьшение содержания ИФН-у на 5 сут и ИЛ-4 на 14 сут после отравления ТХМ соответственно в 2,50 и 1,58 раза (р<0,05). Снижение соотношения ИФН-у/ИЛ-4 под влиянием ТХМ в 4,2 раза по сравнению с контролем (6,6) говорит о большей супрессии активности лимфоцитов ТЫ-типа по сравнению с функцией ТЪ2-клеток [1].
Таблица 1
Влияние подострой интоксикации ТХМ на содержание цитокинов в плазме крови крыс, пг/мл (М+т, п = 7)
Цитокины Контроль ТXМ
ИФН-y 987±78 395±37*
ИЛ-4 150±22 95±10*
ИФН-y /ИЛ-4 6,6 4,2
ИЛ-2 1446+95 580+34*
Примечание: * -р<0,05 по сравнению с контролем.
Снижение в плазме крови под влиянием ТХМ ИЛ-2 свидетельствует о супрессии его продукции Т-лимфоцитами (как СЭ4+, относящимися к лимфоцитам ТЪ0- типа), так и некоторыми СЭ8+, редукции пролиферации Т- и В-клеток (синтеза 1-цепи молекулы иммуноглобулина), активности естественных клеток-киллеров (ЕКК) [3]. При воздействии ТХМ (табл. 2) отмечалось уменьшение гуморального иммунного ответа через 4 сут к Т-зависимому антигену (по числу АОК в селезенке), характеризующему синтез ^М В-клетками и функцию ТЫ-лимфоцитов, по сравнению с контрольным уровнем в 2,57 раза (р<0,05). При подостром отравлении ТХМ на 5 сут отмечалась существенная супрессия реакции ГЗТ (функция ТЫ-клеток) соответственно в 2,27 раза (р<0,05). Через 13 сут после иммунизации (пик иммунного ответа, оцениваемый по ^О) отмечалось уменьшение продукции ^О (по числу АОК в селезенке) в 1,42 раза (р<0,05), свидетельствующее о редукции функции ТЪ2-лимфоцитов.
Таблица 2
Влияние подострой интоксикации ТХМ на функцию Th1- и Th2-лимфоцитов у крыс (М+m, n = 9-11)
Серия опытов Функция Thl-лимфоцитов Функция Th2-лимфоцитов
АОК к ЭБ (IgM), 103 ГЗТ, % АОК к ЭБ (IgG), 103
Контроль 43,5+4,0 38,8+3,3 52,8+5,4
ТXМ 16,9+2,1* 17,1+2,2* 37,2+3,8*
Примечание: * -p<0,05 по сравнению с контролем.
Характеризующие иммунные реакции и связанную с ними функцию ТЪ1 -лимфоцитов параметры при действии ТХМ в среднем снижались в 2,42 раза. Установлена значительно меньшая редукция иммунного ответа, который обеспечивается функцией ТЪ2-лимфоцитов (и В-клеток), при отравлении ТХМ (соответствующее редукции числа АОК, синтезирующих ^О). Полученные данные подтверждают выявленную особенность поражения функции ТЫ-лимфоцитов под влиянием ТХМ в большей степени по сравнению с супрессией активности ^2-лимфоцитов. Редукция параметров иммунной системы сопровождалась снижением активности АХЭ в Т-лимфоцитах спленоцитов и содержанием а-нафтил-А8-ацетатэстеразо- и а-нафтил-
бутиратэстеразопозитивных клеток в селезенке крыс (табл. 3).
