CC BY
28
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Экспериментальные исследования
. ; © КОЛЛЕКТИВ АВТОРО.В, 1991 '' УДК 615.373.03: |816.155.392-г61в-00в.444/-078.333 .
И. А. Карпов, А. Ю. Барышников, К. Л. Чимишкян,
3. Г. Кадагидзе
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ОБЩЕ-Т-КЛЕТОЧНЫХ АНТИГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА
НИИ клинической онкологии ,
В работах; посвященных аллогенньш трансплантациям костного мозга как у животных [9], 'так и у человека [7], было показано, что основную роль в реакции трансплантат против хозяина играют Т-лймфоцйты и их предшественники. Поэтому удаление этих клеток из аллогенного трансплантата костного мозга может предотвратите' или значительно ослабить эту реакцию. Для удаления Т-лимфоцитов .и их предшественников можно-применить моноклональные антитела (МкАТ) против обще-Т-клеточных анти- : генов. Обще-Т-клеточными антигенами человека являются гликопротеиды, отнесенное на I рабочем
■ совещании по дифференцировочным антигенам [4] к • кластерам дифференцировки СД5, СД6
■ и еду. . ■ ■ ■ ;; -
Данная работа посвящена, изучению получен- ; ных нами МкАТ серии ИКО (Институт клини- -ческой онкблогии) к о б ще - Т: клеточ н ы м антигенам человека СД5 и СД7 и их стандартизации. '
• • . ' \ ’ - _ -
Материалы и методы. В работе использовались •МкАТ И КО-33, МкАТ И КО-80,'МкАТ ИКО-87. Экспрессию антигена изучали и непрямой реакции " поверхностной -иммунофлюоресценции (РИФ),, которую выполняли в двух модификациях: во взвеси и на клетках, прикрепленных
к стеклу с помощью поли-Ь-лизина. Свечение учитывали на фотомикроскопе'Ш («Ор1оп», Германия), объектив 100, окуляр 10, а также методом проточной цитофлюоромет-рии. В РИФ использовали сорбированные Р(аЬ') 2-фрагменты, кроличьей аитисыворотки к глобулинам мыши.
Класс иммуноглобулинов, продуцируемых гибридомой, определяли в реакции преципитации по Оухтерлоии [11 с помощью кроличьих.сывороток против изотопов мышиных иммуноглобулинов.
Молекулярную массу антигенов, выявляемых МкАТ, определяли радйоиммунопреципитацией из |251 меченных лизатов тимоцитов и Т-клетрчной линии В13в.
Конкурентную блокаду ,251 меченых изучаемых МкАТ осуществляли избытком немеченых МкАТ. 3-106 клеток инкубировали с 100 мкл МкАТ известной специфичности в течение 30 мйн прн комнатной температуре. После , 2-кратного отмывания, пробы инкубировали с 50 мкл |25Г меченными исследуемыми МкАТ в течение 30 мин. Затем
• клетки 2-кратно отмывали и определяли с помощью радиоактивного счетчика («Гамма-12») связывание меченых МкАТ. В качестве контролей определяли степень связывания меченых МкАТ с интактными клетками, а также опре- . деляли степень блокады меченых МкАТ теми же немечеными МкАТ. '
Для дальнейшей характеристики были проведены сравнения исследуемых МкАТ с известными аналогами как отечественного, так и зарубежного производства, направленными против СД5 и СД7 антигенов методом модуляции.
С этой целью был изучен характер исчезновения антигена после инкубации при 37 °С. клеток-мишеней с известными
МкАТ через 6 ч, что приводит, к исчезновению .антигена, определяемого этими МкАТ. Затем все пробы отмывали от среды инкубации (ДМЕМ с 15 % теля,чьей эмбриональной сывороткой и 2 мМ глютамина) и ставили РИФ с МкАТ ИКО-80 и МкАТ ИКО-87 по обычной методике. В качестве общего контроля ставили РИФ с интактными клетками, инкубированными 6 ч при 37 °С. А для доказательства того, что с поверхности клетки исчезает толиКо тот антиген, против которого направлены.МкАТ, были поставлены в качестве негативного контроля пробы с МкАТ, распознающие другие антигены на этих же клетках. В опыте с МкАТ ИКО-80 таким контролем служили антигены, определяемые МкАТ ИКО-87, .а с МкАТ ИКО-87 контролем был антиген, против которого направлены МкАТ ИКО-80.
В настоящей работе, были исггользрваны. уже известные антитела: МкАТ ЛТ1 (СД5), ЛТ7 (СД7), любезно предоставленные А. В. Филатовым. (Институт иммунологии, Москва) [3L МкАТ ВСА-16 (СД5) — Г. Ю. Мйтёревым [2]
{Всесоюзный научный гематологический центр АМН СССР, Москва), МкАТ А-50 (СД5), 1—210 (СД7) — * проф.
L. Boumsell (Hospital Saint-Louis, Франция, Париж). [4].
Результаты и обсуждение. В результате проведенной работы были получены 3 гибри-домные клеточные линии, названные ИКО-33, ИК.О-80, ИКО-87. Все гибридомные Клеточные линии стабильно .продуцировали МкАТ изоти-. па - -. ■■
Исследование реактивности этих МкАТ в РИФ при учете реакции на люминесцентном микроскопе показало, что МкАТ ИКО-33 реагируют с 86 % тимоцитов, 60 % Т-клеток, 2 % не-Т-клеток, 50 % мононуклеаров и 4% клеток костного мозга (таблица). При учете реакции методом проточной цитофотометрии выявлена экспрессия .антигена определяемого МкАТ. ИКО-33 на ТОО % тимоцитов и 100% Т-клеток, а также на 100 % клеток Т-клеточных линий В13в и МоН-4, МкАТ ИКО-33 не реагировали с не-Т-клетками, гранулоцитами, тромбоцитами, . В-клеточной. линией Гу, монобластоидной линией 11937, эритро-бластоидной линией К-562.
МкАТ ИКО-80 при учете реакции на микроскопе реагировали с 88 % тимоцитов, 75 %
! Тг-клеток,,42 % мононуклеаров и 3 % клеток костного мозга. При оценке экспрессии этого антигена методом проточной цитофотометрии была выявлена реакция этих МкАТ со 100 % Т-клеток, 100% тимоцитов и 100 % клеток Т-клеточных линий В13в и МоЬ-4. Вместе с тем МкАТ ИКО-80Ь не реагировали с гранулоцитами, эритроцитами, тромбоцитами, не-Т-лимфоцитами, В-клеточной линией 1у, монобластоидной линией Ш37, эритробластоидной линией К-562.
: МкАТ ИКО-87 при учете РИФ на микроскопе
•реагировали с 80 % тимоцитов, 60 % Т-клеток, 58 % мононуклеаров -и 3% клеток костного мозга. При учете РИФ методом проточной цито-фотометрии обнаружена реакция с 100 % тимо-. цитов, 100 %. Т-клеток и 100 % клеток Т-кле-, точных линий* МоН-4 и В13в. МкАТ, ИКО-87 не реагировали с не-Т-клетками, гранулоцитами,
Тип клеток Количество исследований Число обследованных больных Количество антигенположительных клеток, %
в РИФ на микроскопе в РИФ на проточном цнт’офлюориметре
ИКО-.ЗЗ ИКО-80 ИКО-87 ИКО-33 ИКО-80 ИКО-87
Мононукяеары 9 9 50,2±3,51 42 ±4,63 58±3,72 85,34+3,86 93,5± 1,54
Т-клетки ■ 5 '5 60±4,38 ?5±2,87 66±6,23 100 98,41 ±2,18 98,38+0,58
Не-Т-клетки 5 ' • 5. 2,14±0,24 ' 5,2±1,32 4,1 ±3,21 0 0 0
Г ранулоциты 8 0 0 0 0 0 0 0
Тромбоциты ' .6 0 0 0 ' • ()' ". 0 ' - 0 . 0
Эритроциты 8 0 ■ 0 0 0 , 0 ' 0 0
Тимоциты 5. -■ ■ ■ 5 86,06±5,03 88±3,34 80±3,23 - 100, 100 89,45±2,71
Нормальный костный мозг 4 4 4,48±2,75 3,59±1,04 3,81 ±0,7 -
К-562 . .. 5 0 .0 0 0 0 0 0
ВГЗв ■ ’ , '■ 4 - 4 100 100 100
11937- , 4 0 0 ‘ 0 • 0 • 0 0 0
ІУ '* .5 0 0 0 0 0 0 0
Мо1і-4 5 . 5 V 100 100 100 •
. эритроцитами, тромбоцитами, В-клеточной линией 1у, монобластоидной линией и 937, эритро-бластоидной линией К-562. Различие между оценкой экспрессии антигенов на микроскопе и методом' проточной цитофотометрии связано с чувствительностью методов.
При оценке МкАТ ИКО-33,. ИКО-80 и ИКО-87 на проточном цитофлюорометре сравнили их. с международными стандартными МкАТ против-обще-Т-клетОчных антигенов СДЗ, СД5, СД6 и СД7. Было обнаружено, 'что клетки, окрашенные МкАТ ИКО-33 и МкАТ ИКЬ-80, имели одинаковые гистограммы распределения по интенсивности флюоресценции, как и клетки, прореагировавшие с МкАТ А-50 против антигена СД5. С другой стороны, гистограммы клеток, окрашенных МкАТ ИКО-87, не отличались от гистограмм, клеток, окрашенных МкАТ I—210, направленных против антигена СД7.
Определение молекулярной массы антигенов, иммунопреципитируемых 'МкАТ ИКО-80 и МкАТ ИКО-87 из лизатов тимоцитов и Т-клеточной • линии В13в, показало, что МкАТ ИКО-80 связываются с гликопротеидом с мол. массой 67 кило-дальтон (кД), а МкАТ- ИКО-87 — с гликопротеидом с мол. массой' 40 кД.* Следует подчеркнуть, что мол. масса антигена СДЗ — 67 кД, а антигена ОД7 — 40 кД. • ■ ’ . -
V
а б в г ■ а ■ ' Рис.! '
" Рис. 1."Конкурентная >нгибиция связывания МкАТ ИКО-87, *.• меченных 1251. ' ' ; '
а— клетки + МкАТ ИКО-87; б — клетки + МкАТ. ЙКО-66 -|- МкАТ ИКО-87;.
• в — клетки + МкАТ ИКО-87 4- МкАТ ИКО-87; г.— клетки +- МкАТ -Т—210 Ц-. , 4* МкАТ,ИКО-87; д — клетки + МкАТ ЛТ7 + МкАТ ИКО-87.
Рис. 2. Конкурентная ингибиция связывания М'кАТ ИКО-80, меченных 1251. , ; ' .
я — клетки + МкАТ ИКО-80; б —'клетки 4- МкАТ ИКО-66 + МкАТ ИКО-80; в — клетад 4- МкАТ . ИКО-80 4* МкАТ ИКО-80; г — клетки + МкАТ • ЛТ1 4* ■>Н*-МкАТ ЙКО-80; д— клетки 4- МкАТ ИКО-33 4* МкАТ ИКО-80; е — клет-. ки 4'МкАТ ВСА-16 4- МкАТ ИКО-80;' ж“— клетки 4--МкАТ А-50 -{- МкАТ 'ИКО-80/
Для эпитопной характеристики антигенов определяемых МкАТ ИКО-33, ИКО-80 и ИКО-87 был использован метод конкурентной ингибиции. Предварительная Инкубация клеток с немечеными МкАТ ИКО-80 приводила, к 70 %/- угнетению связывания меченных 1251 МкАТ ИКО-80 (рис. 1). МкАТ ЛТ1, А-50 и ВСА-16, направленные против, антигена СД5, блокировали связывание меченых МкАТ ИКО-80 на 68/58 и 65 % соответственно. -МкАТ ИКО-33 также блокировали связывание МкАТ ИКО-80. В качестве негативного контроля использовали немеченые МкАТ ИКО-66, направленные против СД37. Из этих, экспериментов можно сделать вывод, что МкАТ ИКО-80, ИКО-33, ЛТ1, А-50 и ВСА-16 определяют один и тот же или близкорасположенные эпитоны. Немеченые МкАТ. ИКО-87 блокировали связывание меченных |251 ‘ МкАТ ИКО-87 ’ на 60%/ Предварительная инкубация клеток с немечеными МкАТ ЛТ7 и I—210 против антигена СД7 блокировала присоединение меченных МкАТ. ИКО-87 на 40 и 50 % соответственно (рис. 2). Эти результаты показали, что МкАТ ИКО-87 распознают те же самые или. близкорасположенные эпитопы, что И МкАТ ЛТ7 и 1+-210. '-
Антигены СД5 и СД7 модулируют с клеточной поверхности при инкубации, с МкАТ анти-СД5 и анти-СД7 [3]. Феномен модуляции был использован для. дальнейшей характеристики,МкАТ ИКО-33, ИКО-80 и ИКО-87. Результаты показали, что после преинкубации в течение 6 ч с МкАТ ИКО-80 или МкАТ ИКО-33 исчезала реакция с этими клетками МкАТ А-50, ЛТ1' и ВСА-16 (рис. 3). С другой стороны, преинкубации мононуклеаров с МкАТ ИКО-87 приводила к ис-чезновенйю с клеточной поверхности антигена, определяемого МкАТ ЛТ7 и I—210 (рис. 4).
Таким образом, МкАТ ИКО-80, ИКО-33 реагируют с 100 % тимоцитов и Т-клеток, не реагируют с другими типами клеток, иммунопреципити-руют антиген с мол. массой 67 кД, блокируют связывание с мононуклеарами МкАТ анти-СД5,, вызывают модуляцию - антигена СД5. МкАТ ИКО-87 реагируют с 100 % тимоцитов и Т-клеток, не связываются с другими клетками крови, иммунопреципитируют антиген с мол. массой 40 кД, блокируют связывание с клетками МкАТ анти-СД7, индуцируют модуляцию антигена СД7. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что МкАТ ИКО-33 и ИКО-80
- 'Рис.З , Рис.4
Рис. 3. Сравнительный характер модуляции антигена, определяемого МкАТ ИКО-80.
Здесь н на рис. 4: I — РИФ; с интактными клетками, It — РИФ. с МкАТ ИКО-80 после 6 ч преинкубации клеток с МкАТ; антигенполо'жительные клет-КИ (в %).
4 —МкАТ ИКО-80, б — МкАТ А-50, в— МкАТ ИКО-33, г — МкАТ ВСА-16, д —МкАТ,ЛТ!,:е —МкАТ ИКО!87. '
Рис. 4. Сравнительный характер модуляции антигена, определяемого МкАТ ИКО-87.
а'—МкАТ ИКО-87, б— МкАТ 1—210,- в — МкАТ -Л Т7, у — МкАТ ИКО-80. .
выявляют тот же самый или близкорасположенный эпитоп антигена’ СД5, который определяют МкАТ ЛТ1, ВСА-16 и А-50, а МкАТ ИКО-87 определяют тот же .самый или близкорасположенный эпитоп антигена СД7. Таким, образом, МкАТ ИКО-87, распознавая антиген СД7, который является наилучшим маркером для иммунодиагностики Т-клсточного острого лимф,областного лейкоза,, и учитывая, что .он сильно экс- ’ прессирован на всех клетках больных Т-клеточными острыми Лимфобластными лейкозами и на клетках большинства больных Т-клеточной лимфо-саркомой и Т-кЛеточным хроническим' лимфобластным лейкозом, могут быть широко исполь-; зованы в диагностике лейкозов [6, 8] .
МкАТ ИКО-33, ИКО-§0 могут быть использованы как ранний .индикатор наличия' реакции трансплантат пробив хозяина при трансплантациях костного мозга [5],"а также для определения иммунологического фенотипа лейкозных • клеток [2] .- МкАТ ИКО-33, 'ИКО-80 вместе с МкАТ ИКО-87 могут применяться и как компонент иммунокОнъюгатов для санации костного мозга, при аутотрансплантациях у больных Т-клеточными лейкозами и для удаления Т-клеток .из - аллогенных трансплантатов костного мозга.
ЛИТЕРАТУРА . '
\. Бем Э. Н. // Иммунологические методы.— М'., 1979.—
с. 31. 1
2. Булычева Т. Н., Новикова Н, Н.; Митерев Г. Ю. и др. // Гематол. и трансфузиол.—. 19,88,— № 12.— С. 45—47:
3. Филатов А. В., Бачурин П. С., Маркова Н. А: и др. // Экспер. онкол — 1989.— № 2.— С. 28—32г
4. Bernard. A., Boumsell L. // Immunologe.— 1984.—
Vol. П.— P. 195—212.
5. Bierer В. E., Burakoff S. J., Smith B. R. // Blood.—
• 1989.—Vol. 73,— P. 1359—1366. ;
6. Borowitz M. Dowell B.-L, Boyett J. М., Falletta J. M. et al. // Ibid.— Д985.— Vol. 65.— P. 785—788. ;
7. Herve A, Flesch М.; Cahn J. Y. et al. .// Transpfanta-' tion.— 1985.— Vol. 39,— P. 138—143.
8. Roper М., Crist W. М., Metzgar R. et al. // Blood.—
1983,— Vol. 61.— P. 830—834. , ,
9. Vallera D. A., Youle R. J., Neville D. M. et- al. // J. Exp. Med.— 1982,— Vol. 155,— P. 949—95.4. •,
■ 4
Поступила 8.06.90
MONOCLONAL ANTIB0PIE6 AGAINST COMMON T-CELL HUMAN ANTIGENS
I. A. Karpov, A. Yu, Baryshnikov, К L. Chtmishkyan, Z. G. Kadagidze „
Monoctonal antibodies IC0^80, ICO-33 and ICO-87 were. screened by flow cytometry, indirect immunofluorescence and competitive binding studies to determine their affinity for khpwn antigens on human blood cells. Antibody-antigen binding also was assayed by the “comoduTation” method: binding of test antibodies was determined after incubation of target ceils with well-characterized. antibodies for specific antigens. It was’found that the ICQ-80 arid ICO-33 antibodies bind to antigen CD5 and the ICO-87. antibody to antigen CD7, . These .3 monoclonal antibodies may be used to determine the fmmunological status of human subjects and for studying their immune response. -
© КОЛЛЕКТИВ ABTOROB, 1991
УДК 612.112.94.017.1.014.467 .
' 1 ' ' * . * • . . , ■ -
А. Ю. Барышников, 3. Г. . Кадагидзе, О. В. Короткова, Т. Н. Заботила, И. Г. Штефанчук, Е. Достот, М. Шмидт, С. Гутефангес, Л. Боумселл
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ИК0-53 ПРОТИВ МОНОМОРФНЫХ HLA-АНТИГЕНОВ I КЛАССА
кН И И клинической онкологии, госпиталь Сан-Луи, Париж
Моноклональнь1е антитела (МКА) к моно-морфным детерминантам антигенов гистосовме-' стимости I класса (HLA-I) шйроко применяются при йммунофенртипировании опухолевых клеток у .больных лимфопролиферативными заболеваниями [1]. Цель настоящей работы — получение и характеристика МКА против мономорфных HJLA-антигенов I класса.
Материалы и iyt е т о ды. Экспрессию антигенов определяли, в непрямой реакции .иммунофлюоресценций (РИФ) на живых клетках, которую учитывали или на люминесцентном микроскопе «Leitz», или методом проточной цитофЗпо-орометрии на аппаратах FACStar или FACScarj^ Метод выполнения РИФ описан нами ранее [2]. При характеристике МКА методом конкурентной ингибиции 5-106 лимфоцитов периферической крови здоровых доноров инкубировал и с 300 мкл немеченых МКА ИКО-53 или МКА W6.32 против мономорф-ной детерминанты HLA-1 в течение 30 мин при комнатной температуре. Клетки отмывали в PBS и инкубировали с 50 мкл МКА W6.32, меченных FITC, в течение 30 мин при комнатной температуре. После двухкратного' отмывания b.PBS учитывали .свечение на проточном цитофлюорометре.. Характеристику МКА методом двойной .метки проводили следующим-- образом. 5ХЮ6 лимфоцитов периферической крови здоровых доноров инкубировали, в течение 30 мин'при комнатной температуре с 50 мкл МКА ИКО-53. После отмывки клетки инкубировали в течение 30 мин при 4°С с 50 мкл кроличьей антисыворотки против IgG мыши,
■ меченными FITC. После отмывки в PBS клетки инкубиро-
в.али в течение 30 мин при комнатной температуре с 50 мкл МКА W6.32, конъюгированными с биотином. Клетки отмывали и инкубировали в, течение 30 мин при; 4 °С с комплексом авидин—фикоэритрин. После двукратной отмывки в PBS определяли, методом проточной цитофлюорометрии гистограмму распределения окрашенных клеток. По оси абсцисс располагали клетки, окрашенные FITC, а по оси ординатч*- клетки, окрашенные фикоэритрином. Молекулярную массу антигена, распознаваемого МКА ИКО-53, определяли' радиойммуно-преципитацией из лизатов меченных I лимфоцитов периферической крови и клеток'Т-клёточной линии В13Ь. В качестве МКА ИКО-53 использовали асцитическую жидкость в раз-
2 Вестник ВОНЦ № 1
9
