CC BY
27
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ EXPERIMENTAL ИССЛЕДОВАНИЯ INVESTIGATIONS
© Коллектив авторов, 1993
УДК 616.155.02-007.12:616.155.96-097-078.73
А.Ю. Барышников, Е.А. Фролова, Н.В. Ленева,
Т.Н. Палкина, З.Г. Кадагидзе, С. Гуттефангес,
Е. Достот, М. Шмид, Н. Корвая, И. Манзур,
А. Бонсуссан, Л. Боумселл
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-105 К РЕЦЕПТОРУ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 (АНТИГЕН CD25)
НИИ клинической онкологии, Москва, U93 INSERM, Paris
В 1981 г. T. Uchiyama и соавт. [4] сообщили о новых моноклональных антителах (МКА) анти-Тас, которые реагируют с активированными человеческими Т-лимфоцитами, но не связываются с покоящимися лимфоцитами периферической крови. В дальнейшем было показано, что эти МКА связываются с рецептором интерлейкина-2 (ИЛ-2) [3, 5]. ИЛ-2 играет важную роль в активации и пролиферации клеток. Он взаимодействует с клетками посредством специфического рецептора, являющегося гликопротеидом с мол. массой 55 000 Д [1, 2]. К этому рецептору получено большое количество МКА, отнесенных на 2-м Международном рабочем совещании по дифференцировоч-ным антигенам лейкоцитов человека в кластер диффе-ренцировки CD25. На активированных Т-клетках экспрессирован рецептор ИЛ-2 с мол. массой 75 000 Д (антиген CD25R).
Цель нашей работы — получение и характеристика МКА к рецептору ИЛ-2.
Материалы и методы. Гибридомную линию клеток получили при слиянии спленоцитов мышей линии BALB/c, трехкратно иммунизированных активированными фитогемагглютинином (ФГА) лимфоцитами периферической крови здоровых доноров, с клетками миеломы линии NS1. Скрининг продуцирующих гибридом проводили в непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции (РИФ) на лимфоцитах, активированных ФГА. После двукратного клонирования получили гибридому, стабильно продуцирующую МКА IgGl- изотипа, названные IGO-105.
Непрямая РИФ. 400 000 клеток в объеме 50 мкл инкубировали с 50 мкл МКА в течение 30 мин при комнатной температуре, отмывали 1 раз фосфатно-солевым буфером (ФСБ) центрифугированием в течение 2 мин при 1700 об/мин. После этого клетки инкубировали при 4 С в течение 30 мин с 50 мкл козьей сыворотки против иммуноглобулинов мыши, меченной FITC и разведенной 1:30 ("Whittaker") или F(ab’)2-фрагментами, меченными FITC. Затем клетки дважды отмывали и ресуспендировали в ФСБ, содержащем 1% формалина и 0,1% натрия азида. РИФ учитывали на проточных цитофлуориметрах "FACStar или FACScan ("Becton Dickinson").
Антитела. В качестве источника МКА использовали асцитическую жидкость мышей — носителей гибридом в разведениях 1:100. В качестве вторых антител при постановке РИФ использовали
A.Yu. Baryshnikov, E.A. Frolova, N.V. Leneva,
T.N. Palkina, Z.G. Kadagidze, S. Guttenfanges, E.Dostot, M. Schmid, N. Korvaya, I. Mansur,
A. Bonsussan, L. Boumsell
MONOCLONAL ANTIBODY TO INTERLEUKIN-2 RECEPTOR (ANTIGEN CD25)
Research Institute of Clinical Oncology, Moscow,
U93 INSERM, Paris
In 1981 T. Uchiyama et al. [4] reported of a new monoclonal antibody (Mab) anti-TAC that reacted with activated human T-lymphocytes but did not bind to resting peripheral blood lymphocytes. This Mab was further showed to bind to interleukin-2 (IL-2) receptor [3, 5]. IL-2 makes a great contribution to cell activation and proliferation. It interacts with cells through a specific receptor glycoproteid of molecular weight 55,000 Da [1, 2]. There are a great number of Mab to this receptor that were attributed to the CD25 cluster of differentiation at the 2nd International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens. Activated T-cells are found to express an IL-2 receptor with molecular weight 75,000 Da (CD25R antigen).
The purpose of this study was to produce and characterize Mab to IL-2 receptor.
Materials and Methods. To generate a hybrid cell line spleen cells from BALB/c mice immunized three times with phytohemagglutinin (PHA)-activated lymphocyte from normal peripheral blood were fused with NS1 myeloma cells. Screening of productive hy-bridomas was carried out by indirect immynofluorescence (IF) on PHA-activated lymphocytes. As a result of double cloning we generated a hybridoma producing Mab of the IgGl isotype that was termed ICO-105.
Indirect IF. 400,000 cells in a volume of 50 fx\ were incubated with 50 fit of the Mab for 30 min at room temperature and washed 1 time with phosphate-buffered saline (PBS) by centrifugation for 2 min at 1700 rpm. Then the cells were incubated at 4”C for 30 min with SO ft I FITC-labeled goat serum against mouse immunoglobulins or F(ab’)2 fragments from FITC-labeled rabbit antiserum against mouse immunoglobulins. After that the cells were washed two times and resuspended in PBS with 1% formalin and 0.1% sodium azide to be tested for reactivity by IF using FACStar of FACScan (Becton Dickinson) cytofluorimeters.
Antibodies. To produce Mab we used ascitic fluid from hybrido-ma-bearing mice in 1:100 dilution. As a second antibody for IF we used F(ab’)2 fragments from FITC-labeled commercial rabbit antiserum against white mouse immunoglobulins. Streptavidin-phycoerythrin (SPE) conjugates (Becton Dickinson, Immunotech S.A.) were used in experiments with biotin-conjugated antibodies. The Mab BC96.9 of the IgGl isotype to the CD25 antigen was produced in U93 INSERM (Dr L. Boumsell) as well as the Mab BA120g of the IgGl isotype to
F(ab’)2-фрагменты, полученные из коммерческой кроличьей антисыворотки против иммуноглобулинов белой мыши, меченной FITC (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи), предварительно адсорбированной лейкоцитами человека для удаления неспецифического связывания. При использовании биотинилирован-ных антител применяли конъюгаты стрептавидин-фикоэритрин (SPE) ("Becton Dickinson" и "Immunotech S.A."). МКА ВС96.9 IgGl/-изотипа к антигену CD25 получены в U93 INSERM (Dr.L.Boumsell). МКА BA120g IgGl-изотипа к антигену CD71 (рецептор трансферри-на) получены в этой же лаборатории. МКА ICO-92 к антигену CD71 получены в ОНЦ РАМН (проф. А.Ю. Барышников).
Активация лимфоцитов периферической крови (РБТ). 310 мононуклеаров периферической крови здоровых доноров инкубировали в 30 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС) в присутствии или 1 мкг/мл ФГА, или 120 ед/мл ИЛ-2 ("Roussel-UCLAF"), или их сочетания в течение 10 дней. В различные сроки отбирали часть клеток для исследования в РИФ. На 5-й день во флаконы дополнительно добавляли 120 ед/мл ИЛ-2. Активированные клетки отмывали 3 раза ФСБ и использовали в РИФ.
Блокада связывания ИЛ-2 с клетками с помощью МКА. 1.10 клеток линии YT, экспрессирующих рецептор ИЛ-2, инкубировали с 50 мкл МКА 30 мин при комнатной температуре. Клетки отмывали 2 раза буфером RDF1 и инкубировали с 10 мкл ИЛ-2, конъюгированного с фикоэритрином (Fluorokine IL-2 KIT, RD Systems, Minneapolis, MN), в течение 1 ч на льду. Клетки отмывали 2 раза буфером RDF1, ресуспендировали в 300 мкл ФСБ, содержащего 1% формалина и 0,1% натрия азида, и определяли связывание ИЛ-2 с клетками на проточном цитофлуориметре.
Клетки. В работе использовали следующие перевиваемые линии клеток: Т-клеточные линии — HPBall, YT2C, Molt-4; В-клеточ-ные — JEP, JY, Daudi; эритробластоидную К-652. Клетки выращивали в среде RPMI-1640, содержащей 10% ТЭС. МКА также тестировали на ИЛ-2-зависимых Т-клеточных клонах NK1 (JE1), С16, LSO, JAF43 и DS6. Клоны клеток выращивали в среде RPMI-1640, содержащей 10% ТЭС и 150 ед/мл ИЛ-2. Каждую неделю к клонам клеток добавляли облученные мононуклеары периферической крови здоровых доноров, 1 мкг/мл ФГА и 75 ед/мл ИЛ-2. Клетки перевиваемых линий и клонов отмывали 3 раза ФСБ и использовали в РИФ.
Конкурентная ингибиция связывания МКА. 1 млн клеток инкубировали с 300 мкл немеченых МКА в течение 30 мин при комнатной температуре. Клетки затем отмывали 1 раз и инкубировали с 50 мкл МКА, меченными FITC или биотинином, в течение 30 мин при комнатной температуре. При использовании биотинилирован-ных МКА клетки отмывали 1 раз и инкубировали с 50 мкл конъюгата стрептавидин-фикоэритрин (SPE) в течение 30 мин при 4°С. После двукратного отмывания клетки в ФСБ с 1 % формалина и 0,1 % натрия азида. Затем на цитофлуориметре определяли процент клеток, окрашенных FITC или SPE.
Блокада МКА пролиферации ИЛ-2-зависимых клонов клеток. 500 000 клеток ИЛ-2-зависимых Т-клеточных клонов С16 и LSO культивировали в 96-луночных плато в триплетах с МКА в конечной концентрации 1:300 в присутствии ИЛ-2. Через 60 ч в каждую лунку добавляли 1 мкКи Н-тимидина. Клетки инкубировали 6 ч и переносили на мембраны. Включение Н-тимидина в клетки сравнивали с интактными клетками, растущими в присутствии ИЛ-2, и с клетками, растущими в присутствии референтных МКА к рецептору трансферрина.
Блокада МКА пролиферации активированных ФГА лимфоцитов. 500 000 мононуклеаров периферической крови здоровых доноров культивировали в 96-луночных плато в триплетах в присутствии 1 мкг/мл ФГА и очищенных МКА в концентрации от 300 до
0,3 мкг/мл в течение 72 ч. Через 48 ч в каждую лунку добавляли 1 мкКи Н-тимидина. Клетки инкубировали 24 ч и переносили на мембраны. Клетки с Н-тимидином сравнивали с интактными клетками, инкубированными без ФГА, а также с клетками, инкубированными с ФГА и контрольными МКА того же изотипа.
Радиоиммунопреципитация. Молекулярную массу антигена определяли методом радиоиммунопреципитации. 200 млн клеток Т-
the CD71 antigen (transferrin receptor). The Mab ICO-92 to the CD71 antigen was generated at the CRC of the RAMS (Professor A.Yu. Baryshnikov).
Peripheral Blood Lymphocyte Activation. 3'10 mononuclear cells from normal peripheral blood were incubated with 30 ml of RPMI-1640 containing 10% fetal calf serum (FCS) with addition of PHA at 1 /ig/ml or IL-2 at 120 U/ml (Roussel-UCLAF) or both for 10 days. Cell portions were taken at certain intervals to be tested by IF. On day 5 IL-2 at 120 U/ml was added. The activated cells were washed three times in PBS to be studied by IF.
Mab Biokade of IL-2 Binding. 1-10 cells of the YT line expressing the IL-2 receptor were incubated with 50 ftl of the Mab for 30 min at room temperature. The cells were washed two times with RDF1 buffer to be incubated with 10 fil of phycoerythrin-conjugated IL-2 (Fluorokine IL-2 PE KIT, RD Systems, Minneapolis, MN) on ice for 1 h. Then the cells were washed two times in RDF1, resuspecded in 300 fil of PBS with 1 % formalin and 0.1 % sodium azide to be studied for binding to IL-2 by flow cytometry.
Cells. The following transplantable cell lines were used in the investigation: T-cell lines HPBall, YT2C, YT, Molt-4; B-cell lines JEP, JY, Daudi; erythroblastoid line K-652. The cells were grown in RPMI-1640 with 10% FCS. The Mab were also tested with IL-2-dependent T-cell clones NK1 (JE1), C16, LSO, JAF43 and DS6. The cell clones were cultured in RPMI-1640 with 10% FCS and 150 U/ml IL-2. Every week the cultures were added with irradiated normal peripheral blood mononuclear cells, 1 fi%/m\ PHA and 75 U/ml IL-2. Cells of the transplantable lines and clones were washed 2 times to be studied by IF microscopy.
Mab Binding Concurrent Inhibition. 1 mln cells were incubated with 300 fit of unlabeled Mab for 30 min at room temperature, washed 1 time and incubated with FITC- or biotinin-labeled Mab, 50 fil, for 30 min at room temperature. If biotin-labeled Mab were used, the cells were washed 1 time, incubated with 50 fil of streptavidin-phycoery-thrin (SPE) conjugate for 30 min at 4°C. Following two washings the cells were resuspended in PBS with 1% formalin and 0.1% sodiun azide. Then percentage of FITC- or SPE-stained cells was determined using a cytofluorimeter.
Mab Blockade of IL-2-Dependent Cell Clone Proliferation.
500.000 cells from IL-2-dependent T-cell clones Cl6 and LSO were cultured in 96-well plates in triplets with the Mab at a final dilution of 1:300 in the presence of IL-2. 60 h later H-thymidine, 1 fid, was added to each weU. The cells were incubated 6 h and transferred onto membranes. The H-thymidine-labeled cells were compared with intact cells growing in the medium with IL-2 and with cells growing in the presence of reference Mab to the transferrin receptor.
Mab Blockade of PHA-activated Lymphocyte Proliferation.
500.000 normal peripheral blood mononuclear cells were cultured in 96-well plates in triplets in the presence of PHA, 1 fig/ml, and the purified Mab at a concentration from 300 to 0.3 fig/ml for 72 h. 48 h later H-thymidine, 1 fiC'i, was added to each well. The cells were cultured for 24 h and transferred onto membranes. The ^H-thymidine-labeled cells were compared with intact cells incubated without PHA, intact cells incubated with PHA and control Mab of the same type.
Radioimmunoprecipitation. The antigen molecular weight was determined by radioimmunoprecipitation. 2-10 cells of the T-cell clone JAF43 or NK1 were labeled with I by the lactoperoxidase technique. The lysate purified with protein A-sepharose was incubated for 4 h with 5 fil of undiluted ascitic fluid of the Mab ICO-105, ICO-92 or ascites of non-productive myeloma NS1. The lysate was incubated for 4 h with protein A-sepharose. After washing 3 times with TNN buffer the antigen was eluted with sample buffer to be further analyzed under reducing and non-reducing conditions by electrophoresis in 7.5% polyacrylamide gel with drying and radioautograghy to follow.
Results and Discussion. As a result of screening a hybridoma was selected and cloned that produced Mab reacting with PHA-activated lymphocytes and not binding to resting cells. The Mab was termed ICO-105.
клеточного клона JAF43 или NK1 метили 1-лактопероксидазным методом. Очищенный с помощью протеин А-сефарозы лизат инкубировали в течение 4 ч с 5 мкл цельной асцитической жидкости МКА ICO-105, ICO-92 или асцитом непродуцирующей миеломы NS1. Затем лизат инкубировали в течение 4 ч с протеин А-сефаро-зой. После трехкратного отмывания буфером TNN антиген элюировали "sample''-буфером и анализировали в редуцирующих и нередуцирующих условиях методом электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле с последующим высушиванием и радиоавтографией геля.
Результаты и обсуждение. В результате скрининга была отобрана и клонирована гибридома, продуцирующая МКА, которые реагировали с лимфоцитами, активированными ФГА, и не связывались с покоящимися клетками. МКА были названы 1СО-Ю5. Преципитацией в агаре, по Сухтерлони, с использованием моно-специфических антисывороток против изотипов мышиных иммуноглобулинов определили, что МКА имеют изотип IgGl. МКА ICO-105 не реагируют с лимфоцитами, моноцитами, гранулоцитами, тромбоцитами и эритроцитами. Исследование МКА на большой панели перевиваемых клеточных линий показало отсутствие реакции с большинством клеток (табл. 1). Исключение составляют клетки линии YT, экспрессирующие рецептор ИЛ-2. Следует подчеркнуть, что МКА не реагируют с клетками субклона этой линии YT2C, не экспрессирующими рецептор ИЛ-2 с мол. массой 55 ООО Д (CD25), но имеющими рецептор ИЛ-2 с мол. массой 75 ООО Д (CD25R). Тестирование МКА ICO-105 на ИЛ-2-зависимых Т-клеточных клонах выявило их реактивность со всеми тестированными клонами независимо от их фенотипа (табл. 2).
Исследование экспрессии антигена, выявляемого МКА 1СО-Ю5, на активированных клетках показало, что антиген появляется на клетках через 24 ч после начала активации, достигает максимума на 3 — 5-й день, а затем снижается (рис. 1). При активации лимфоцитов ИЛ-2 обнаружена максимальная экспрессия антигена на 5-й день после начала активации. При комбинации ФГА и ИЛ-2 экспрессия антигена на 3-й и 5-й дни не отличалась от экспрессии на клетках, активированных только одним ФГА, однако на 7-й и 10-й дни была значительно выше. При активации клеток аллоантигенами в смешанной культуре лимфоцитов максимальная экспрессия антигена, определяемого МКА 1СО-Ю5, наблюдалась на 5 — 7-й день. Сравнение интенсивности флуоресценции на различных клетках показало, что активированные ФГА и ИЛ-2 клетки более интенсивно экспрессируют рецептор ИЛ-2, чем ИЛ-2-зависимые клоны клеток и клетки линии YT. Использование в параллельных опытах МКА ВС96.9 к рецептору ИЛ-2 дало идентичную реактивность со всеми типами клеток, хотя МКА различались по проценту определяемых антигенположительных клеток.
МКА ICO-105 характеризовали методом конкурентной ингибиции. Было показано, что немеченые МКА ICO-105 и анти-С025 полностью блокировали присое-
Рис. 1. Экспрессия антигена, выявляемого МКА 1СО-Ю5 и ВС96.9, на лимфоцитах, активированных ФГА или ИЛ-2.
1 — ИЛ-2 ВС96.9; 2 — ИЛ-2 ICO-105; 3 — ФГА + ИЛ-2 ВС96.9; 4 — ФГА + ИЛ-2 ICO-105; 5 — ФГА ВС96.9; 6 — ФГА ICO-105. По оси абсцисс — время активации, дни; по оси ординат — процент антигенположительных клеток.
Fig. 1. Expression of antigen recognized by Mab IC0-105 and BC96.9 on PHA- or IL-2-activated lymphocytes.
1 — IL-2 BC96.9; 2 — IL-2 ICO-105; 3 — PHA + IL-2 BC96.9; 4 — PHA + IL-2 ICO-105; 5 — PHA BC96.9; 6 — PHA ICO-105.
Values on the x axis show days of activation; values on the у axis demonstrate percentage of antigen-positive cells.
Рис. 2. Блокада связывания МКА анти-С025 с активированными ФГА лимфоцитами с помощью МКА IC0-105.
а — клетки окрашены МКА анти-С025 FITC; Ь — клетки преин-кубированы с МКА анти-С025РЕ и окрашены МКА анти-С025 FITC; с — клетки преинкубированы с МКА ICO-105 и окрашены МКА анти-С025 FITC; d — клетки преинкубированы с МКА ВС96.9 и окрашены МКА анти-С025 FITC.
Fie. 2. Mab ICO-105 blockade of Mab anti-CD25 binding to PHA-activated lymphocytes.
a — cells are stained with Mab anti-CD25 FITC; b — cells are preincubated with Mab anti-CD25 PE and stained with Mab anti-CD25 FITC; с — cells are preincubated with Mab ICO-105 and stained with Mab antl-CD25 FITC; d — cells are preincubated with Mab BC96.9 and stained with Mab antl-CD25 FITC.
Таб л и ца 1 Tablel
Реактивность МКА ICO-105 с тимоцитами, клетками периферической крови человека и перевиваемыми клеточными линиями Mab ICO-105 reactivity with thymocytes, human peripheral blood cells and transplantable cell lines
Клетки Характеристика линии клеток МКА ICO-105 BC96.9
Тимоциты/Thymocytes 0 0
Лимфоциты/Lymphocytes 0 0
Моноциты/Monocytes 0 0
Грэнулоциты/Granulocytes 0 0
HPBall Т-клеточная/Т-сеІІ o* 0
YT и 60 38,7
YT2C ft 0 0
Molt-4 и 0 0
JFP 11 0 0
OZ-EBV n 0 0
JY I* 0 0
Daudi и 0 0
DZ-EBV It 0 0
K562 Эритробластоидная/Erythroblastoid 0 0
HL-60 Миелоидная/Myeloid 0 0
U937 Монобластоидная/Monoblastold 0 0
Cells Mab cell line characteristics I CO-105 BC96.9
Здесь и в табл. 2 процент антигенположительных клеток.
Here and in table 2 asterisks show percentage of antigen-positive cells.
динение к клеткам, активированным ФГА, этих же МКА, меченных FITC или SPE, в 3 из 3 опытов. Однако МКА ВС96.9 не блокировали связывание с активированными ФГА клетками МКА анти-С025 и лишь в 1 из 3 опытов блокировали присоединение МКА ICO-105. МКА 1СО-Ю5 блокировали соединение с клетками линии YT биотинилированных МКА ВС96.9. Это указывает на то, что МКА 1СО-Ю5 и анти-СЭ25 распознают те же самые или близкорасположенные эпитопы, которые отличаются от локализованного рядом эпитопа, выявляемого МКА ВС96.9 (рис. 2).
Определение молекулярной массы антигена методом радиоиммунопреципитаци показало, что МКА ICO-105 иммунопреципитируют из лизата клеток JAF43, меченных 1 51, одну полосу с мол. массой 55 ООО Д, которая характерна для рецептора ИЛ-2 (рис. 3).
МКА 1СО-Ю5 и ВС96.9 блокируют связывание ИЛ-2, конъюгированного с фикоэритрином, с клетками YT (рис. 4). При этом оказалось, что МКА 1СО-Ю5 более сильно ингибируют присоединение ИЛ-2, чем это делают МКА ВС96.9.
Изучение способности МКА ICO-105 влиять на пролиферацию CD25+-клеток показало, что МКА ингибировали проферацию клеток С16 и в меньшей степени пролиферацию клеток LSO (рис. 5). Следует отметить, что включение 3Н-тимидина клетками LSO было более интенсивным, что свидетельствует о более сильной пролиферирующей активности этого клона клеток. МКА ВС96.9 также игибировали пролиферацию этих клонов, но в меньшей степени, чем МКА 1СО-Ю5. МКА ICO-105 угнетали пролиферацию лимфоцитов на ФГА. Степень ингибиции активации лимфоцитов на ФГА имела дозозависимый характер и была статистически значимой при концентрации МКА от 300 до 0,3 мкг/ мл.
Таким образом, проведенное исследование показа-
Таблица 2 Table 2
Реактивность МКА ICO-105 с ИЛ-2-зависимыми клонами Т-клеток
Mab ICO-IOS reactivity with IL-2-dependent T-cell clones
Клетки Характеристика клона клеток МКА ICO-105 BC96.9
NK1(JF1) CD8+CD4" 20,2 H.T./NT
C16 CD4+CD8~ 44,6 36,0
JAF43 CD4+CD8~ 3,2 9,9
LSO CD8CD4" 11,8 20,7
Lefevre CD4CD8" 17,4 44,8
Cells Mab cell clone characteristic I CO-105 BC96.9
Примечание. H.T. — не тестировали. N о t е. NT stands for ’not tested’.
Рис. 3. Определение молекулярной массы антигена, выявляемого МКА ІСО-Ю5, радиоиммунопреципитацией из лизата клеток JAF43, меченных I.
1 — ІСО-Ю5; 2 — IСО-92; 3 — NS1. Цифры справа — молекулярная масса, Д. Fig;. 3. Determination of molecular weight of antigen recognized by Mab ICO-105 J»y
radioimmunoprecipitation from I-
labeled JAF43 lysate cells.
1 — ICO-105; 2 — I CO-92; 3 — NS1. Values to the right show molecular weight in Da.
Ai
Рис. 4. Блокада с помощью МКА IC0-105 присоединения ИЛ-2, конъюгированного с фикоэритрином.
а — клетки окрашены фикоэритрином, конъюгированным с ИЛ-2 (ИЛ-2РЕ1; Ь — клетки преинкубированы с непродуцирующей мие-ломой NS1 и окрашены ИЛ-2РЕ; с — клетки преинкубированы с МКА ВС96.9 и окрашены ИЛ-2РЕ; d — клетки преинкубированы с МКА ICO-105 и окрашены ИЛ-2РЕ.
Fig. 4. Mab ICO-105 blockade of binding of phycoerythrin-conjugated IL-2.
a — cells are stained with IL-2-conjugated phycoerythrln (IL-2PE); b— cells are preincubated with non-proauctive myeloma NS1 and stained with IL-2PE; с — cells are preincubated with Mab BC96.9 and stained with IL-2PE; d — cells are preincubated with Mab IC0105and stained with IL-2PE.
полная блокада
отсутствие блокады
частичная блокада Н.Т. - не тестировали
Рис. 5. Блокада пролиферации лимфоцитов, активированных ФГА, и ИЛ-2-зависимых T-клеточных клонов с помощью МКА ІСО-Ю5 и МКА ВС96.9 к рецептору ИЛ-2.
Fig. 5. Blockade of PHA-activated lymphocytes and IL-2-de-pendent T-cell clones with Mab ICO-105 and Mab BC96.9 to IL—2 receptor.
By using agar precipitation according to the Ouhter-lony technique with monospecific antisera against mouse immunoglobulin isotypes the Mab were found to belong to the IgGl isotype. The Mab ICO-105 was non-reactive with lymphocytes, monocytes, granulocytes, platelets and red blood cells. Study of the Mab on a large panel of cell lines showed no reactivity with most cells (table 1) except YT cells that expressed the IL-2 receptor. Of note that the Mab did not react with cells of the YT2C subclone of this line failing to express the IL-2 receptor of 55,000 Da(CD25) but possessing the IL-2 receptor of 75,000 Da(CD25R). Testing on IL-2-dependent T-cell clones showed the Mab ICO-105 to be reactive with all the clones tested irrespective of their phenotypes (table 2).
Expression of the antigen recognized by the Mab ICO-105 was studied on activated cells. The antigen appeared on the cells 24 h after initiation of PHA-ac-tivation to reach maximum expression on day 3 — 5 followed by decline (fig. 1). The maximum antigen expression on IL-2-activated lymphocytes was detected on day 5 after activation. The antigen expression by PHA- and IL-2 activated cells on days 3 and 5 was the same as by cells activated with PHA alone, but it was significantly more intense on days 7 and 10. In mixed lymphocyte culture activated with alloantigens the antigen determined by the Mab ICO-105 demonstrated maximum expression on day 5 — 7. Comparison of fluorescence intensity on various cells showed greater expression of the IL-2 receptor by PHA- and IL-2 activated cells as compared with IL-2 dependent cell clones and YT cells. Parallel study of the Mab BC96.9 to the IL-2 receptor demonstrated similar reactivity with all the cell types, but the percentage of recognized antigen-positive cells was different.
The Mab ICO-105 was characterized by concurrent inhibition. Unlabeled Mab ICO-105 and anti-CD25 were showed to block completely binding of the same Mab labeled with FITC and SPE to PHA-activated cells in 3 of 3 experiments, while the Mab BC96.9 did not inhibit binding of the Mab anti-CD25 to PHA-activated cells and blocked the binding of the Mab ICO-105 in 1 of 3 experiments only. The Mab ICO-105 blocked binding of biotin-conjugated Mab BC96.9. This inducates that the Mab ICO-105 and anti-CD25 recognize the same or close epitopes different from the neighbour epitope recognized by the Mab BC96.9 (fig. 2).
Antigen molecular weight was determined by radioimmunoprecipitation. The Mab ICO-105 was found to immunoprecipitate from 125I-labeled JAF43 lysate an antigen of 55,000 Da molecular weight characteristic of an IL-2 receptor (fig. 3).
The Mab ICO-105 and BC96.9 blocked binding of phycoerythrin-conjugated IL-2 to YT cells (fig. 4). The Mab ICO-105 showed stronger inhibition of the IL-2 binding than the Mab BC96.9.
ло, что МКА ICO-105 определяют антиген CD25, являющийся рецептором ИЛ-2, имеющим мол. массу 55 ООО Д. МКА по своим характеристикам не отличаются от МКА ВС96.9 и aHTH-CD25. МКА блокируют связывание с клетками ИЛ-2 и ингибируют пролиферацию CD25+-mieTOK. МКА ICO-105 более эффективно блокируют присоединение ИЛ-2 и пролиферацию клеток, чем МКА ВС96.9. Это можно объяснить тем, что МКА ICO-105 распознают на молекуле рецептора ИЛ-2 непосредственно место связывания ИЛ-2. МКА ICO-105 и анти-С025 полностью блокируют друг друга. МКА ICO-105 блокируют пролиферацию CD25+-mio-нов Т-клеток, а также ответ лимфоцитов периферической крови на ФГА.
МКА ICO-105 могут быть использованы для определения клеток, экспрессирующих рецептор ИЛ-2, для изучения рецептора ИЛ-2, исследования процессов активации и пролиферации, блокады ИЛ-2-зависимой пролиферации, иммунофенотипирования лейкозных клеток и т.д.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Leonard W.J., Depper J.M., Robb R.J. et al. // Proc. nat. Acad. Sei. USA. — 1983. — Vol. 80 — P. 6057.
2. Rudin L.A., Kurman C.C., Biddison W.E. et al. // Hybridoma. — 1985. — Vol. 4. — P. 91.
3. Taniguchi N., Miyawaki T., Yachie A. // Lymphokine Res. — 1982. — Vol. 1. — P. 107.
4. Uchiyama T., Nelson D.L., Fleisher T.A., Waldmann N.A. // J. Immunol. — 1981. — Vol. 126. — P. 1398.
5. Uchiyama T., Broder S., Waldmann N.A. // Ibid. — P. 1393.
Поступила 17.04.92 / Submitted 17.04.92
Study of the Mab ICO-105 effect on CD25+ cell proliferation discovered that the Mab inhibited proliferation of Cl6 cells and to a lower degree of LSO cells (fig. 5). It should be noted that the LSO cells showed a greater 3H-thymidine inclusion which is evidence of higher proliferative activity of this cell clone. The Mab BC96.9 also inhibited proliferation of these clones, but to a lower extent than the Mab ICO-105. The Mab ICO-105 suppressed lymphocyte proliferation in response to PHA. The inhibition of lymphocyte activation in response to PHA was dose-dependent, and the dose dependence was statistically significant at Mab concentrations from 300 to 0.3 ^g/ml.
Thus, our study has showed that the Mab ICO-105 determines the antigen CD25 which is an IL-receptor with molecular weight 55,000 Da. The Mab is similar to the Mab BC96.9 and anti-CD25 by its characteristics. The Mab blocks binding to IL-2 and inhibits proliferation of CD25+ cells. The Mab ICO-105 provides a stronger blockade of IL-2 binding and cell proliferation than the Mab BC96.9. This may be associated with the Mab ICO-105 ability to recognize IL-2 binding sites directly on IL-2 receptor molecules. The Mab ICO-105 and anti-CD25 block each other completely. The Mab ICO-105 inhibits proliferation of T-cell CD25+ clones as well as response of peripheral blood lymphocytes to PHA effect.
The Mab ICO-105 may be used to define cells expressing IL-2 receptors, to study IL-2 receptors, to investigate activation and proliferation, blockade of IL-2-dependent proliferation, leukemic cell immunopheno-typing, etc.
