CC BY
48
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕАНТИТЕЛА ICO-406...
УДК 616-097:616-006-018:576.3.017.2:616.5-006.81]:576.3.08 Н.В. Голубцова, O.C. Бурова, К.А. Барышников, М.В. Оборотова, В.И. Карасева, Л.Т. Мамедова, К.И. Жорданиа, М.А. Барышникова, А.С. Гриневич, П.К. Иванов, А.Ю. Барышников МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-406 ПРОТИВ АНТИГЕНА CD117 ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», Москва Контактная информация Голубцова Наталья Валерьевна, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел: +7(499)324-10-65 e-mail: ngolubcova@mail.ru Статья поступила 29.04.2015, принята к печати 12.05.2015. Резюме Получены МКА против антигена CD117 - маркера стволовых опухолевых клеток человека. Штамм ICO-406 получали путем слияния клеток мышиной миеломы NS-1 с клетками селезенки мышей линии BALB/C, предварительно трехкратно иммунизированных с интервалом в две недели клетками клеточной линии мелано-мы кожи человека mel Kor. Слияние проведено при помощи раствора ПЭГ/ДМСО. Для скрининга полученных МКА IC0-406 использовались клеточные линии меланомы человека, различающиеся экспрессией антигена CD117 из коллекции ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина». Экспрессию антигена изучали в РИФ и оценивали на проточном цитофлуориметре BD FACSCantoTMII. МКА IC0-406 сравнивали с коммерческими МКА против антигена СD 117 (Германия). Результаты показали их идентичность по частоте антиген-положительных случаев и проценту антигенположительных клеток. МКА IC0-406 блокируют связывание с клетками mel Kor МКА ан-ra-CD117. Связывание МКА IC0-406 с антиген-положительными клетками вызывает модуляцию антигена CD117. Ключевые слова: моноклональные антитела, антиген, стволовые опухолевые клетки, меланома кожи человека, проточная цитометрия.
N.V. Golubtsova, O.S. Burova, K.A. Baryshnikov, M.V. Oborotova, V.I. Karaseva, L.T. Mamedovа, K.I. Zhordania, M.A. Baryshnikovа, A.S. Grinevich, P.K. Ivanov, A.Yu. Baryshnikov MONOCLONAL ANTIBODIES ICO-406 AGAINST THE ANTIGEN CD117 FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow Abstract mAb against the antigen CD117 - stem marker of human tumor cells. Strain 406 PPI prepared by cell fusion of mouse myeloma NS-1 cells with spleen mice BALB/ C, pre-immunized three times at an interval of two weeks, the cells of the cell line of human melanoma melKor. Merging conducted using a solution of PEG/DMSO. For screening received mAb 406 used human melanoma cell lines which differed in the expression of CD117 antigen FSBSI "N.N. Blokhin RCRC" collection. N.N Blokhin. Antigen expression was studied in immunofluorescence and evaluated on a flow cytometer BD FACS CantoTMII. ICA IC0-406 was compared with commercial ICA against antigen CD 117 (Germany). The results indicated the identity of the frequency of antigen-positive cases and the percentage of antigen cells. ICA IC0-406 block binding to cells melKor ICA anti-CD117. Linking ICA IC0-406 antigen-positive cells causes modulation of antigen CD 117. Key words: monoclonal antibodies, antigen, stem tumour cells, human skin melanoma, flow сytometry. Введение стволовых клеток (СОК) [14]. Первоначально СОК были обнаружены при остром миелоидном и хро- Среди опухолевых клеток имеется неболь- ническом миелоидном лейкозах [12; 16; 17; 23; 24]. шая популяция клеток, способных к формированию Эти клетки характеризовались экспрессией CD34 дифференцированных опухолевых клеток, а также антигена [9]. В последующем ОСК были иденти-способных к собственному воспроизведению, т.е. фицированы при многих злокачественных заболе-имеющих характеристики стволовой клетки [7; 20; ваниях. 22]. В гематологических опухолях также выявлена Фактор роста стволовых клеток (SCF или популяция клеток со свойствами стволовых [4; 10; KL) CD117(c-Kit) - гемопоэтический ростовой фак-12]. Эти клетки получили название опухолевых тор. Он является цитокиновым рецептором, экс-
№ 2/том 14/2015 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1GG ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕАНТИТЕЛА ICO-406...
прессированном на клеточной поверхности гемопо- иммунизированных с интервалом в две недели этических стволовых клеток, а также некоторых клетками клеточной линии меланомы кожи челове-других клеток [4; i5]. Измененные формы рецепто- ка mel Kor (происхождение - подкожный метаста-ра ассоциированы с некоторыми типами рака [i5]. тический узел пациентки диссеминированной ме-CDii7 является рецепторной тирозинкиназой III ланомой кожи). Слияние проведено при помощи типа, рецептором для стволового фактора роста c- раствора полиэтиленгликоля ПЭГ/ДМСО Kit. СD117 взаимодействует со многими другими («Sigma»). Одну из гибридом, супернатант которой белками: APS, BCR, ШбЗ, CDSi, CD9, CRK, выявлял около 7G-SG % АГ+ клеток, дважды клони-CRKi, DOK1, FES, GRB1G, Grb2, KITLG, LNK, ровали методом лимитирующих разведений. Для MPDZ, PIK3R1, PTPN11, PTPN6, STATi, SOCS1, скрининга полученных МКА ICO-4G6 при помощи SOCS6, TEC. реакции иммунофлуоресценции использовались Рецептор CDii7 является обязательным клеточные линии меланомы человека, различаю-компонентом клеточной поверхности гемопоэтиче- щиеся экспрессией антигена CDii7, из коллекции ских стволовых клеток и прогениторных клеток. ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» [11]. Доказано его участие в поддержании циркулирующих гемопоэтических стволовых клеток, а также в Реакция иммунофлуоресценции механизмах, позволяющих этим клеткам возвра- Экспрессию антигена определяли в реакции щаться из системного кровотока в их ниши в кост- иммунофлуоресценции. 5xiG5 клеток (mel Kor и ном мозге. др.) инкубировали с 2G мкл МКА в течение 3G мин Более 9G % нейральных стволовых и проге- при комнатной температуре, после чего iG мин от-ниторных СОК несут на своей поверхности CD117. мывали в 1 мл PBS при 15GG об/мин. Взаимодействие SCF с c-Kit активирует многочис- К осадку клеток добавляли 1G мкл F(ab)2 ленные сигнальные каскады, включая RAS/ERK, (goat anti mouse IgG: FITC, фирмы Serotec, кат.№ P13-K, JAK/STAT, Src-киназы, результатом чего G1G6) и инкубировали в течение 3G мин при +4 "С. является направленная миграция, выживание и После этого клетки дважды отмывали в i мл PBS в пролиферация стволовых клеток. Антиген обнару- тех же условиях, осадок клеток ресуспендировали в жен на клеточных линиях меланомы кожи [11]. 3GG мкл 1 %-ного р-ра формалина. Иммунологический фенотип СОК характеризуется экспрессией различных антигенов: CD24, Реакция прямой иммунофлуоресценции CD34, CD44, CD9G, CD117, CD133, CD271 [4-11; 5xiG5 клеток (mel Kor и др.) инкубировали с 13]. Антигены CD24, CD34, CD9G, определяются 1G мкл антител, меченных PE в течение 3G мин при МКА ICO-15G, ICO-115, ICO-1G соответственно [1; +4 "С, после чего клетки дважды отмывали по 1G З; 5; 1З]. мин в 1 мл PBS при 15GG об/мин, осадок клеток Целью настоящей работы явилось получе- ресуспендировали в 3GG мкл 1 %-ного р-ра форма-ние МКА против антигена CD117 - маркера СОК лина. Полученные результаты оценивали на про-человека. точном цитофлуориметре BD FACSCantoTMII USA. Реактивы для буферов использовали компа-Материалы и методы нии «ПанЭКО» (Россия). Анализ данных, полученных с помощью проточного цитофлуориметра BD МКА ICO-4G6 получали путем слияния кле- FACSCantoII (USA). ток мышиной миеломы NS-1 с клетками селезенки мышей линии BALB/C, предварительно трехкратно Очистка и мечение МКА Реагенты: ДМСО (DMSO) - диметилсульфоксид безводный (Applichem #A3672.GG5G) ДТТ (DTT) - дитиотриэтол (Serva #39759) ФЭ (РЕ) - R-фикоэритрин (Fluka #52412) PBS - G,i М фосфат-солевой буфер, рН 7,2 - 7,4 PBS-ЭДТА - PBS с 1 мМ этилендиамином тетраацитатом NEM - N-этил малеимид (ABSR #2G93GG) SMCC - Сукцинимидил 4 [N-малеимидометил] циклогексан-1-карбоксилат (Fluka #631S1) SPDP - N-сукцинимидил З-(2-пиридилдитио) пропионат (Sigma #P3415) Tris-HCl - 1G мМ Трис-HCL буфер, рН 7,S ТВS - 1G мМ Трис-буфер, 15G мМ NaCl, G,G2% NaN3 pH 7,S Для очистки IgG 5-iG мл асцитной жидкости осветляли центрифугированием 6G мин при 4GGG об/мин. Асцитную жидкость термостатировали при об/мин) и ресуспендировали в ТВ S в объеме, рав-+4 °С при постоянном перемешивании на магнит- ном G,5 объема исходного асцита. Процедуру выса-ной мешалке и капельно добавляли равный объем ливания повторяли еще раз. Полученный осадок насыщенного при +4 °С раствора сульфата аммо- отделяли центрифугированием (3G мин при 4GGG ния в течение 15-2G минут. Образовавшийся осадок об/мин) и ресуспендировали в ТВS. Полученный отделяли центрифугированием (3G мин. при 4GGG препарат переводили в Tris-HCl на колонке PD-1G и
№ 2/том 14/2G15 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
наносили на колонку Mono Q 10/100, уравновешенную тем же буфером. Это и последующие разделения проводили на хроматографе AKTA purifier 10. Скорость потока составляла 1 мл/мин, выход белковых продуктов оценивали денситометрией при 280 нм. После отмывки колонки от не связавшейся белковой фракции, на колонку подавали градиент 0-40 % 1М раствора NaCl на Tris-HCl.
Выходящие фракции собирали по 1 мл, и в последующем анализировали SDS-ПААГ электрофорезом по Лэммли на наличие IgG. Фракции, имеющие молекулярную чистоту 95-98 % объединяли. Препарат IgG дополнительно дочищали гельфильтрацией на колонке Superdex 200 10/300.
На колонку наносили 0,6-0,8 мл образца IgG, и проводили разделение со скоростью потока 0,5 мл/мин, выход белковых продуктов оценивали ден-ситометрией при 280 нм. Фракции, соответствующие выходу гомогенного по молекулярной массе IgG, объединяли, переводили в PBS-ЭДТА, концентрировали до 8-12 мг/мл и стерилизовали через шприц-насадку 0,22 мкм.
Конъюгирование IgG с РЕ проводили по методам [18; 21] с модификациями. В мечение брали 300-350 мкг IgG и 1 мг РЕ, что соответствуют молярному соотношению 1 : 2. РЕ ресуспендировали в 0,5 мл PBS-ЭДТА и обессоливали на PD-10 против того же буфера. Полученный материал концентрировали на Centricon 30 (Millipor) до 0,5-0,7 мл, добавляли 16 мкл SPDP в DMS0 в концентрации 1,33 мг/мл и инкубировали в темноте при комнатной температуре при постоянном перемешивании 2,5 часа.
За 0,5 часа до окончания инкубации PE, к IgG в концентрации 2,5 мг/мл и добавляли 5 мкл раствора SMCC в DMS0 в концентрации 1,75 мг/мл. Смесь оставляли при комнатной температуре с периодическим встряхиванием на 1 час. По окончании инкубации РЕ, к нему добавляли 30 мкл 0,5 М раствора DTT в PBS-ЭДТА и инкубировали еще 0,5 часа при тех же условиях.
После инкубации модифицированные РЕ и IgG освобождали от продуктов реакции и не прореагировавших реагентов на колонках PD-10 против PBS-ЭДТА. Полученные с колонок РЕ и IgG концентрировали на Centricon 30 до совместного объема 0,8-1,2 мл, после чего РЕ и IgG объединяли в пробирке и инкубировали в темноте при +4 °С при постоянном перемешивании 16-18 ч.
Реакцию останавливали добавлением 40 мкл 0,1 мМ раствора NEM в DMS0 с последующей инкубацией при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 45 мин.
Полученный образец концентрировали на Centricon 30 до объема 0,5-0,6 мл и фильтровали на Spin-X (Millipor).
Разделение продуктов конъюгации проводили на колонке Superdex 200 10/300, при скорости потока 0,5 мл/мин c денситометрией при v280 и 565 нм. Фракции собирали по 1 мл.
Собранные фракции анализировали на соотношение IgG - РЕ [19]:
Молярная концентрация [IgG] =[(A280 нм -0,18 х A565 нм)/203,000]хфактор разведения;
Молярная концентрация [R-PE] = (Amax /1,960,000) х фактор разведения,
где Amax должна быть в диапазоне 0,3-0,8 при измерении на 565 нм;
Степень включения РЕ = [R-PE]/ [Ig G], где степень включения должна быть в пределах 0,7-2,0.
После разделения препараты антител стабилизировали бычьим сывороточным альбумином в конечной концентрации 10 мг/мл, консервировали 0,1 %-ным NaN3 и стерилизовали через шприц-насадку 0,22 мкм.
Результаты и обсуждение
Тестирование полученных МКА IC0-406 на клеточной линии меланомы кожи человека mel Kor выявило 100 % антиген-положительных клеток. В качестве положительного контроля для CD 117 использовали МКА CD 117 (A3C6E2)-APC («MACS Miltenyi Biotec», Германия), которые также реагировали с 100 % этих клеток. Гистограммы распределения клеток mel Kor, окрашенных МКА IC0-406 и МКА анти-CD 117, представлены на рис. 1. Сходство профилей флуоресценции МКА IC0-406 и МКА CD117 позволило предположить, что эти антитела распознают один и тот же антиген.
Для следующего этапа в изучении специфичности МКА IC0-406 использовали метод конкурентной ингибиции. Клетки линии mel Kor первоначально инкубировали с избытком немеченых МКА IC0-406, после чего инкубировали с МКА IC0-406PE или анти-CD 117АРС. Проведенные эксперименты показали, что инкубация клеток mel Kor с насыщающей концентрацией МКА IC0-406 приводит к полной блокаде связывания с этими клетками меченных PE МКА IC0-406 и меченных АРС МКА анти-Ш117 (рис. 2).
Таким образом, можно сделать вывод, что МКА IC0-406 распознают тот же самый или близко расположенный эпитоп, что и МКА CD117.
Для дальнейшей характеристики МКА IC0-406 был использован метод антигенной модуляции. Преинкубация клеток mel Kor с МКА IC0-406 приводила к исчезновению с клеточной поверхности антигена CD117, выявляемого МКА CD 117 APC. Антиген полностью исчезал с клеточной поверхности через 2 ч после начала инкубации при +37 °С (рис. 3) с МКА и отсутствовал в течение 20 ч (срок наблюдения). Эти результаты свидетельствуют о том, что МКА IC0-406 реагируют с той же самой молекулой, что и МКА CD117APC
Таким, образом, по результатам характеристики МКА IC0-406 можно сделать вывод, что гистограммы иммунофлюоресценции антиген-положительных клеток, окрашенных МКА IC0-406 и анги-ОТ117 идентичны, оба МКА распознают тот же самый или близко расположенный эпитоп, оба МКА реагируют с одной и той же молекулой, которая исчезает с поверхности клетки после контакта с МКА.
102 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕАНТИТЕЛА ICO-406...
В Г
Рис. 1. Гистограммы распределения клеток mel Kor, окрашенных МКА ICO-406 и анти-СБ117:
А - отрицательный контроль;
Б - гистограмма распределения клеток окрашенных МКА анш-СБ117, меченных АРС; В - отрицательный контроль;
Г - гистограмма распределения клеток окрашенных МКА ICO-406, меченных фикоэритрином ( РЕ).
А
Specimen_0Q1-Tube_0Q1
""L 1 .......L
Юа 10
АРС-А
Specimen_001-Tube_001
Г
Specimen 001-Tube 004
Д
Specimen_001-Tube_008
В
Е
10 10
Specimen 001-Tube 014
I
Count г,, 1 РЭ BL^...
-1 .........Iii........L 1 , 0 ........ ......... .......... ' ID ID ID PE-A
Рис. 2. Конкурентная ингибиция связывания МКА ICO-406 с CD117 (A3C6E2)-APC («MACS Miltenyi Biotec», Германия) против антигена CD117:
А - отрицательный контроль;
Б - гистограмма распределения клеток окрашенных МКА анти-CD117, меченных АРС;
В - клетки линии mel Kor, инкубированные с насыщающей концентрацией МКА ICO-406 и проявленные МКА CD117 (A3C6E2)-APC; Г - отрицательный контроль;
Д - гистограмма распределения клеток, окрашенных МКА ICO-406PE;
Е - клетки линии mel Kor, инкубированные с насыщающей концентрацией МКА ICO-406 и проявленные МКА ICO-406 РЕ.
Б
В
Г
Д
Е
Рис. 3. Модуляция антигена СD117 МКА СD117 (A3C6E2)-APC («MACS Miltenyi Biotec», Германия):
А - отрицательный контроль;
Б - клетки линии mel Kor, инкубированные с насыщающей концентрацией МКА IC0-406 в течение 2 часов при 37 °С и проявленные МКА СБ117;
В - клетки линии mel Kor, инкубированные с насыщающей концентрацией МКА IC0-406 в течение 20 часов при 37 °С и проявленные МКА СБ117; Г - отрицательный контроль;
Д - клетки линии mel Kor, инкубированные с насыщающей концентрацией МКА IC0-406 в течение 2 часов при 37 °С и проявленные МКА IC0-406 РЕ;
Е - клетки линии mel Kor, инкубированные с насыщающей концентрацией МКА IC0-406 в течение 20 часов при 37 °С и проявленные МКА. IC0-406 РЕ.
Литература
1. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. - М.: Медицина, 1997. - 212 с.
2. Барышников А.Ю., Голубцова Н.В, Бурова О. С. и др. Экспрессия антигена CD44 у больных метастатической меланомой кожи // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - №4. - С. 17-20.
3. Барышников А.Ю. Моноклональные антитела серии ИКО к дифференцировочным антигенам лимфоцитов человека // Гематология и трансфузиология. - 1990. - №8. - С.4.
4. Барышников А.Ю. Иммунологический фенотип ранних гемопоэтических клеток-предшественников человека // Экспериментальная онкология. - 1993. - Т. 15, № 6. - С. 3-7.
5. Барышников А.Ю., Короткова О.В., Тупицын Н.Н. и др. Моноклональные антитела ИКО-10 к антигену Thy-1 // Бюлл. эксперим. биол. мед. - 1989. - № 1. - С. 74-7.
6. Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной адгезии // Успехи современной биологии. - 1994. - Т. 114, № 6. - С. 741.
7. Брюховецкий И.С., Брюховецкий А.С., Моценко П.В., Хотимченко Ю.С. Роль системных механизмов миграции и хоуминга стволовых клеток в развитии злокачественных опухолей центральной нервной системы и разработка новых методов противоопухолевой терапии // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 4. - С. 3-12.
8. Брюховецкий И.С., Брюховецкий А.С., Мищенко П.В. и др. Миграция гемопоэтических стволовых клеток человека к клеткам глиобластомы линии U87 in vitro // Российский биотехнологический журнал. - 2014. - Т. 13, № 4. - С. 31-6.
9. Заботина Т.Н., Седяхина Н.П., Хорошко Н.Д. и др. Коэкспрессия антигена CD34 ранних гемопоэтических предшествеников и антигена Fas/АРО-!, опосредующего апоптоз // Экспериментальная онкология. - 1994. - Т. 16, № 4-6. - С. 343-7.
10. Кадагидзе З.Г., Тупицын Н.Н., Заботина Т.Н. и др. Иммунофенотипические и функциональные особенности стволовоклеточных лейкозов// Российский онкологический журнал. - 1996. - № 1. -С. 43-8.
11. Оборотова М.В., Бурова О.С., Барышникова М.А. и др. Экспрессия маркеров стволовых опухолевых клеток на клеточных линиях меланомы человека // Российский биотерапевтичекий журнал. - 2015. -Т. 14, № 1. - С. 11-4.
12. Туркина А.Г., Моисеенкова И.Н., Фролова Е.А. и др. "Примитивный" вариант бластного криза хронического миелолейкоза // Тер. архив. - 1995. - Т. 67, № 7. - С. 22-5.
104
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-406..
13. Фролова Е.А., Френкель М.А., Лебедева Н.Б.и др. Моноклональные антитела ICO-115 к антигену CD34 человека // Вестник ОНЦ РАМН. - 1994. - Прил. - С. 10-2.
14. Al-Haij M., Wicha S.M., Benito-Hernandez A. et al. Prospective identification of tumotogenic breast cancer cells. // Proc. Natl.Acad. Sci. USA. - 2003. - 100. - P. 3983-8.
15. Eding C.E., Hallberg B. C-Kit hematopoietic cell essential receptor tyrosine kinase // Int J Biochem Cell Biol. - 2007. - 39. - P. 1995-8.
16. Baryshnikov A.Y,. Zabotina T.N., Sedyachina N.P. et al. Coexpression pf antigens CD34 specific for early hematopoietic precursors and CD95 (Fas/APO-1) meduating apoptosis // Experimental oncology. - 1994. -16. - C. 343.
17. Bonnet D., Dick J.E. Human acute myeloid leukemia is a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell // Nat Med. - 1997. - 3 - P. 730-7.
18. Kronick M.N., Grossman P.D. Immunoassay techniques with fluorescent phycobiliprotein conjugates // Clinical chemistry. - 1983. - 29. - P. 1582-6.
19. Instructions for AnaTag R-Phycoerythrin Protein Labeling Kit. http://www.anaspec.com/pdfs/72113.pdf
20. La Porta C. Cancer stem cells: lessons from melanoma // Stem Cell Rev. - 2009. - 5(1). - P. 61-5.
21. Oi V.T., GlazerA.N., Stryer L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules // Journal of Cell Biology. - 1982. - 93. - P. 981-6.
22. Schatton T., Schutte U., Frank N.Y. et al. Modulation of T-cell activation by malignant melanoma initiating cells // Cancer Res. - 2010. - P. 697-798.
23. Turkina A.G., Baryshnikov A.Y., Sedyakhina N.P. et al. Studies of P-glycoprotein in chronic myelogenou-sleukaemia patients: Expression, activity and correlations with CD34 antigen // British Journal of Heamatol-ogy. - 1996. - 92. - P. 88-96.
24. Turkina A.G., Zabotina T.N., Kusnetzov S.V. et al. Studies of some mechanisms of drug resistence in chronic myeloid leukemia (CML) // Advances in Experimental Medicine and Biology. - 1999. - 457. - P. 477-88.
