CC BY
28
Таблица 3
Выведение 'Н-тестифенона и 3Н-метаболитов с мочой и калом при курсовом (5-дневном) пероральном введении в дозе 30 мг (13,2 МБк)/кг
Время, ч Выведение препарата, % от введенной дозы
с мочой с калом всего
24 6,8 5,8 12,6
48 15,3 11,4 26,7
72 15.1 '¡4,8 29,9
96 17,9 16,2 34,1
120 15,5 17,2 32,7
430 мкг, что составляло соответственно 1 и 60 % от однократно введенной дозы. При этом наблюдалось увеличение объема желудка и истончение его стенки. Кроме того, в течение 5 сут происходили увеличение массы печени и почек соответственно на 40 и 30 % и дистрофические изменения тимуса, селезенки и яичников на 80, 65 и 50 % соответственно. Токсическое действие препарата и его метаболитов на тимус, селезенку и яичники связано с тропностью препарата к гормонозависимым органам и согласуется с ранее описанными данными о его лимфоцитолитическом действии и ингибирующем влиянии на функцию яичников. Увеличение массы почек является, по-видимому, следствием ренотропного действия андрогенов у грызунов. Токсическое действие препарата на печень и увеличение ее массы следует связать с затруднением эвакуации препарата из желудка и недостаточностью пищеварения.
В табл. 3 представлены данные по выведению 3Н-тестифенона и 3Н-метаболитов с мочой и калом при курсовом 5-дневном введении 3Н-препарата. 3Н-соединения выводятся в равной степени с мочой и калом. Через 24 ч после первого введения было выведено 12,6 %, затем через 24 ч после каждого последующего введения величина суммарной радиоактивности экскрементов составляла около 30 % от общей введенной дозы 3Н-тестифенона. Таким образом, для тестифенона характерна медленная эвакуация из желудочно-кишечного тракта и медленная элиминация из органов и тканей животных. После однократного введения препарата удельные концентрации 3Н-соединений в лимфоузлах, тимусе, яичниках и матке в течение 12 сут изменяются незначительно. При курсовом 5-днев-ном применении 3Н-тестифенона происходит накопление 3Н-соединений в органах и тканях с достижением в ряде случаев насыщения к пятому введению препарата. Поступление 3Н-тестифенона в организм осуществляется, по-видимому, за счет эндолимфатическоГо пути, о чем свидетельствуют низкие Концентрации Н-соединений в крови, незначительный процент выведения препарата в неизмененном виде с экскрементами и высокие уровни 3Н-радиоактивности в лимфоузлах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексина М. /О., Тимофеева Л. А. // Всесоюзное совещание «Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей», 3-е: Материалы.— Черноголовка, 1987.— С. ¡63-166.
2. Зимакова Н. И., Будько А. П., Серебрякова Е. А. и др. // Всесоюзное совещание «Физиологически активные соединения, меченные радиоактивными и стабильными изотопами», 2-е: Материалы.— Звенигород, 1988.
3. Лагова Н. Д. // Вопр. онкол.— 1982.— № 5.— С. 38—42.
4. Лагова Н. Д.. Софьина 3. П., Шкодинская Е. Н. и др. //
Там же,—№ 11,— С. 1363—1369.
5. Розен В. Б. Основы эндокринологии.— М., 1984.
Поступила 25.12.89
PRECLIN1CAL STUDY OF 3H-TESTIFENON PHARMACOKINETICS WHEN IT IS ADMINISTRATED FOR ORAL
N. I. Zimakova, E. A. Serebryakova, A. P. Bydjku, A. E. Zolotarev, E. F. Simonov
The kinetics of radioactive 3H-testifenon compounds in blood is described by three—exponential equation. The maximum concentration of radioactivity in the blood is registered 24 hr after the drug administration. The maximum concentration of radioactive 3H-testifenon compounds in organs and tissues is observed after 24—48 hr, then a two-phase decrease of radioactivity takes place in all objects, except lymph nodes, ovaries, uterus and thymus. Radioactive compounds are retained for a long time in organs and tissues (observation — 12 days). Radioactive compounds of 3H-testifenon are excreted with urea and excrements. The basic amount of the compounds after a single-dose administration is eliminated from the organism in 72 hr, although the process of elimination is rather prolonged (observation— 10 days). A course of 5-days administration of the drug leads to the accumulation of radioactivity in organs up to the 4th administration. Further introduction of 3H-testifenon does not cause an increase in the concentration of radioactivity in organs — except lymph nodes.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1990 УДК 616.15+615.381(048)
К■ Л. Чимишкян, И. А. Карпов, В. Н. Кострыкина,
Г. Ш. Овумян, Д. М. Мхеидзе, А. Ю. Барышников
ЭЛИМИНАЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ИЗ КОСТНОЮ МОЗГА МЫШЕЙ EX VIVO
НИИ клинической онкологии
В последние годы в онкологическом практике отмечается повышение интереса к проблеме трансплантаций костного мозга (КМ). При ряде нозологических форм злокачественных новообразований увеличение доз противоопухолевых препаратов и/или облучение позволяют получать длительные ремиссии и излечение части больных даже на поздних стадиях заболевания [5, 6, 10, 14]. Однако максимально переносимая доза для многих химиопрепаратов лимитирована гематологической токсичностью, приводящей к гипо- и апла-стическому состоянию КМ. Трансплантация кроветворной ткани в этих случаях сокращает сроки цитопении и уменьшает риск проявления осложнений, угрожающих жизни больного.
При гемобластозах, в частности при острых лейкозах, трансплантация КМ применяется как способ радикальной терапии заболевания [8, 11].
Источником получения кроветворной ткани могут быть сингенный (от идентичного близнеца) КМ, аллогенный — полученный от HLA-совмести-мого донора, аутологичный — полученный от больного и хранящийся в замороженном состоянии, а также циркулирующие стволовые кроветворные клетки (СКК).
Настоящая работа посвящена изучению возможности использования для вышеуказанных целей аутологичного или сингенного КМ, который получают у больного до проведения высокодоз-ной химиолучевой терапии и затем трансплантируют пациентам для восстановления необратимо поврежденного гемопоэза. Проблема, однако, заключается в том, что аутологичным КМ может
содержать определенное количество клоногенных опухолевых клеток, которые могут стать источником рецидива заболевания. В работе представлены экспериментальные данные моделирования способов обработки нормального КМ мышей, кон-таминированного опухолевыми клетками с целью элиминации последних и реконструкции нормального гемопоэза у летально облученных реципиен-TCS. ДЛЯ очистки КМ от опухолевых клеток ех vivo в работе были использованы полученные нами ранее моноклональные антитела (МКА) ИКО-Ю, направленные против Thy-1 -антигена [1], а также препарат мероцианин-540 (МЦ-540), цитотоксическое действие которого ассоциировано с фотодинамическим эффектом [9, 13].
Материалы и методы. В работе использовали мышей-самцов (СВАХC57BL/6j)Fi массой 24—26 г из питомника «Столбовая». КМ мышей получали их трубчатых костей, используя среду 199. Облучение мышей-редипиентов КМ проводили на радиационной установке гамма-излучения 13 Cs в дозе 10 Гр. Трансплантацию КМ проводили в день облучения животных путем внутривенного введения клеток в дозах 5-108 клеток на 1 кг массы тела. Источником МКА служила асцитическая жидкость мышей BALB./c — носителей гибридомы ИКО-Ю с титром 1:10 000. В качестве комплемента использовали сыворотку 1.5-месячных кроликов, которую хранили в замороженном состоянии.
В опытах использовались линии опухолевых клеток ЛГ [2] и EL-4 (Т-клеточная лимфома), полученные из музея опухолевых штаммов ВОНЦ.
Опухолевые клетки и клетки КМ смешивали в равных объемах в соотношении 1:100 и обрабатывали одно- или двукратно в течение 0,5 ч с МКА ИКО-Ю и 1 ч в присутствии комплемента при 37 °С в оптимальных разведениях 1:100 и 1:4 соответственно, дающих максимальный цитотоксический эффект.
МЦ-540 фирмы “Sigma” использовали в концентрации 20 мкг на 1 мл смеси костномозговых и опухолевых клеток. Фотосенсибилизацию проводили в световом поле, созданном с помощью 18 ламп дневного света, мощностью 40 Вт каждая. Обрабатываемый материал помещали в полистиреновый флакон и инкубировали с различными интервалами в течение 10, 20, 30, 40, 50, 60 и 90 мин в центре светового поля на расстоянии 25 см от источников освещения. Контрольную суспензию инкубировали в темноте.
Функциональную активность обработанного КМ оценивали методом селезеночных колоний по Till — McCulloch [12] на 11-е сутки у мышей, облученных в дозе 7,5 Гр.
Материал, обработанный различными способами, троекратно отмывали средой 199, содержащей 5 % эмбриональной телячьей сыворотки, и вводили в ретроорбитальный венозный синус реципиентам в день облучения. Схема опытов предусматривала возможность защиты реципиентов от смертельного облучения обработанным КМ. Результаты опытов учитывали по продолжительности жизни мышей в опытных и контрольных группах.
Результаты исследований. На рис. 1 представлены результаты эффективности защиты летально облученных мышей смесью клеток нормального КМ и лимфомы EL-4 после одно- и двукратной обработки МКА ИКО-Ю и комплементом. Из представленных данных следует, что в результате двукратной обработки КМ отмечена эффективная защита животных в течение более 100 дней наблюдения. Только у 3 из 30 мышей к 20-му дню отмечено развитие опухолевого про-
/
Рис. 1. Выживаемость летально облученных мышей, защищенных смесью клеток нормального КМ и лимфомы Е1.-4, после обработки МКА И КО-10 и комплементом.
По оси ординат — количество мышей; по оси абсцисс — дни наблюдений. / — облучение 10,0 Гр; 2 — облучение и зашита смесью клеток; 3 — облучение и зашита клетками нормального КМ; 4 — облучение и защита смесью клеток после однократной обработки; 5 — облучение и защита смесью клеток после двукратной обработки.
цесса. Менее эффективной оказалась однократная обработка контаминированного КМ,' в результате которой только 6 из 30 мышей восстановили нормальное кроветворение, остальные животные погибли вследствие роста опухоли или на 5—7-е сутки в результате радиационного поражения кишечника.
Особый интерес представляют результаты исследований действия флюоресцирующего красителя МЦ-540 на способность к формированию колониеобразующих единиц (КОЕс) КМ мышей в зависимости от сроков светосенсибилизации (см. таблицу). Из представленных данных следует, что цитотоксичность для клеток КМ нормальных мышей находится в прямой зависимости от времени экспозиции с МЦ-540. Снижение количества КОЕс, отмечающееся около 30 мин инкубирования в световом поле, имело линейную зависимость с максимальным эффектом, наблюдаемым к 60—90 мин инкубации. Эти данные позволили в дальнейшем выбрать режимы обработки КМ в пределах 30—50 мин.
Данные, представленные на рис. 2, позволили установить ранее неизвестный факт возможности элиминации клеток Т-клеточной лимфомы из КМ экспериментальных животных. Полученные результаты позволяют сделать заключение о высокой степени очистки КМ от опухолевых клеток в режиме 40-минутной экспозиции с МЦ-540.
Аналогичные результаты получены нами и при изучении очистки КМ от клеток иммунобластной лимфосаркомы (ЛГ) (рис. 3). Как и в предыдущих наблюдениях, режим экспозиции, равный 40 мин, оказался наиболее эффективным для осво-
Действие МЦ-540 на формирование КОЕсКМ мышей в зависимости от сроков светосенсибилизации
Условия экспозиции Время экспозиции, мин (КОЕс в 10fi клеток)
0 10 20 30 40 50 60 90
В световом поле В темноте 147,7+1,53 п= 12 н. и. 146,1+2,67 п= 13 н. и. 138,1+2,10 п= 13 н. и. 128,1 + 1,59 л= 14 н. и. 104,2+3,49 п= 13 н. и. 31,8+1,53 л= 13 н. и. 17,8±1,30 п= 15 н. и. 4,9+0,73 л=13 1^1,3+3,0
Примечание, п — число мышей, н. и.— не исследовали.
—It J
- L1 _ 1 —t J 1 1 Г~~і. 4 "І71 € i .. 1
Ю 20 „ ЗО 40 100
Дни
Рис. 2. Выживаемость летально облученных мышей, защищенных смесью клеток нормального КМ и лимфомы ЕЬ-4, обработанных МЦ-540.
По оси ординат — выживаемость, %; по оси абсцисс — дни наблюдений.
I —облучение 9,5 Гр; 2 — облучение и защита смесью клеток; 3 — облучение и защита клетками нормального КМ; 4 — защита смесью клеток после свето-сенсибилизации с МЦ-540 в течение 30 мин; 5 — 40 мин, 6 — 50 мин.
бождения КМ от опухолевых клеток и эффективной защиты облученных животных.
Представленные материалы подтверждают результаты ряда зарубежных авторов [4, 7] и наши данные [3] о том, что двукратная обработка КМ с комплементом более эффективна, чем однократная. Следует подчеркнуть, что данные, полученные нами по применению МЦ-540, открывают новые возможности использования данного препарата в очистке КМ от клоногенных опухолевых клеток, так как специфический противоопухолевый эффект препарата был ранее показан только в отношении 2 клеточных линий: 1Л210 и нейробластомы. Не исключено, что этот отрицательно заряженный флюоресцентный краситель способен включаться в плазматическую мембрану большинства опухолевых клеток, включая как лейкозные, так и незрелые гематопоэтические клетки, а оптимальный режим фотосенсибилизации позволяет полностью уничтожить опухолевые клетки в материале при частичном подавлении КОЕс. Введение клеток КМ после обработки летально облученным реципиентам восстанавливает гемопоэз и не приводит к развитию опухолевого процесса у животных.
Вопрос о возможности применения МЦ-540 до настоящего времени не вышел за рамки его изучения в эксперименте на лейкозных клетках и клетках нейробластомы и, хотя этого немало, представляется важным определить специфичность его действия на других экспериментальных моделях.
Резюмируя изложенное выше, следует отметить, что, несмотря на то что к настоящему времени прослеживается эволюция технологии элиминации клоногенных опухолевых клеток из аутологичного КМ, проблема остается актуальной, особенно в клиническом аспекте ее решения.
j
rt—l-T~,
L - 4 1 ^ Ц Ц
л L L! , і і і .. і
Ю 20 30 90
Дни
Рис. 3. Выживаемость летально облученных мышей, защищенных смесью клеток нормального КМ и лимфосаркомы (ЛГ).
По оси ординат — количество мышей; по оси абсцисс — дни наблюдений. / — облучение 9,5 Гр; 2 — облучение и защита смесью клеток; 3 — облучение и защита клетками нормального КМ; 4 — облучение и защита смесью клеток после светосенсибнлизации с МЦ-540 в течение 30 мин, 5 — 40 мин, 6 — 50 мин.
ЛИТЕРАТУРА
1. Короткова О. В., Барышников А. Ю., Тупицин Н. Н. // Экспер. онкол.— 1989.— № 7.— С. 33—35.
2. Осипова Т. В., Свет-Молдавский Г. Я., Турусов В. С. // Вопр. онкол.— 1975.— № 9.— С. 89—93.
3. Чимишкян К- Л., Барышников А. Ю., Овумян Г. ¡11. и др. // Бюл. экспер. биол.— 1989.— № 7.— С. 83—85.
4. Bast R. С., Ritz Feeney М. et al. // Proc. Amer. Ass. Cancer Res.— 1973.—Vol. 237,— P. 264.
5. Hedley D., McElwin I. 1., Millar I. L. // Lancet.— 1975.— Vol. 2,— P. 966—970.
6. Hryniuk W„ Bush H. // J. clin. Oncol.— 1986,— Vol. 2.— P. 281—284.
7. Ritz 1., Sallan S. E., Bast R. C. et al. 11 Lancet.— 1982.— Vol. 2,— P. 60—63.
8. Santos G. W., Yeager A. М., loues R. 1. // Ann. Rev. Med.— 1989,— Vol. 40,— P. 99—112.
9. Sieber F„ Spivak J. L., Sutcliffe A. M. // Proc. nat. Acad. Sci. USA.— 1984,—Vol. 81,—P. 7584—7587.
10. Souhami R., Peters W. // Clin. Haemat.— 1986.— Vol. 15.— P. 219—223.
11. Thomas E. D., Buckner D. C„ Banajk M. et al. // Blood.— 1977,— Vol. 49,— P. 511—533.
12. Till /. McCulloch E. A. 11 Radiat. Res.— 1961.— Vol. 4,— P. 213—222.
13. Valinsky Reich E., Haghbin M. et al. // Blood.— 1978.— Vol. 54,— P. 294—297.
14. Westbury G., Humble ¡. G. et al. // Lancet.— 1959.— Vol. 1,—P. 868—870.
Поступила 26.03.90
PURGING TUMOR CELLS FROM MURINE BONE MARROW EX VIVO
K. L. Chimishkyan, I. A. Karpov, V. N. Kostrykina, G. Sh. Ovu-myan, D. M. Mkheidze, A. Yu. Barishnikov
The purpose of this study was to determine if the monoclonal antibody ICO-10 or photosensitization mediated by the fluorescent dye murocyanine-540 (MC-540) kill preferentially murine lymphoma and lymphosarcoma cells in simulated autologous remission marrow grafts. Our results indicate that tumor cells may purged from autologous bone marrow grafts either: a) by incubating the grafts with ICO-IO followed by two treatment with rabbit complement or, b) by exposing them to white light for 40 minutes during incubation with MC-540.
