Моноклональные антитела ICO-GM1 к антигену CD11b и их иммунологическая характеристика Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ EXPERIMENTAL ИССЛЕДОВАНИЯ INVESTIGATIONS

© Коллектив авторов, 1995

УДК 616.155.02-007.12-07:616.155.96-097-078.73

В. А. Боценовский, Т. Н. Заботина, Е. Е. Кулевич,

Н. П. Седяхина, А. Ю. Барышников, О. В. Чистякова

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА 1СО-СМ1 К АНТИГЕНУ СБИВ И ИХ ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

НИИ клинической онкологии, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей

Поддержание целостности тканей и органов многоклеточного организма обусловлено взаимодействием клеток как между собой, так и с окружающим их внеклеточным матриксом. Такие взаимодействия определяются большим и разнообразным классом молекул адгезии [6]. Интегрины — поверхностные клеточные белки, «запускающие» адгезию клеток путем взаимодействия с отдельными белками матрикса [12, 13]. Интегрины лейкоцитов, как и другие молекулы адгезии, играют важную роль в миграции лейкоцитов из крови в ткани, агрегации тромбоцитов, иммунологических процессах [13]. Суперсемейство интегринов включает в себя молекулы гликопротеинов, состоящие из а- и [3-субъединиц, и делится на два семейства: Р, и р2-семейство. р2-семейство (СО 18) включает белки, состоящие из 2 субъединиц: общей для всех Р2-субъединицы (СО 18, мол. масса 95 кД) и нековалентно связанной с нею уникальной для каждого интегрина а-субъединицы [6, 15]. Существует 3 вида а-субъединиц в Р2-семействе интегринов: а-Ь (мол. масса 177—180 кД) — Ьеи-САМ, С011а, ЬБА-1; а-М (мол. масса 165—170 кД) — Мае-1, Мо 1, ОКМ-1, СЮ, СО 11Ь и а-Х (мол. масса 150 кД) — р 150/95, СЯ4, СО 11 с. и А-1 (СО 11 а) экспрессируется практически на всех нормальных лейкоцитах и опосредует взаимодействия лейкоцитов с эндотелием, МК-клеток и цитотоксических лимфоцитов с клетками-мишенями, агрегацию гранулоцитов и моноцитов [8, 9]. СОНЬ экспрессирован в основном на миелоидных клетках, а также КК-клетках и активированных лимфоцитах. Молекула С011Ь связывает растворимые лиганды (компонент комплемента ЮЗЬ, фактор X, фибриноген), «запускает» адгезию миелоидных клеток к эндотелию, гомотипическую агрегацию и хемотаксис лейкоцитов [7, 16]. р 150/95 (СО 11с) обнаружен на моноцитах и тканевых макрофагах, гранулоцитах, ЫК-клетках, цитотоксических Т-клетках, некоторых В-клеточных лимфомах (С05+) [10, 16]. Антиген также экспрессируется на клетках волосатоклеточной лейкемии, некоторых Т-клеточных лимфомах [6]. р150/95 участвует в образовании конъюгатов между цитотоксическими лимфоцитами и клетками-мишенями, а также в адгезии нейтрофилов и моноцитов [10, 12, 14]. В настоящее время в мире существует множество моноклональных антител (МКА) к молекулам кластеров С011а,Ь,с и СО 18. МКА к этим антигенам с успехом применяются как в научных исследованиях, так и в клинической практике для предотвращения реакции «трансплантат против хозяина» при трансплантации костного мозга, диагностики и характеристики иммуно-

V.A.Botsenovsky, T.N.Zabotina, E.E.Kulevich, N.P.Sedyakhina, A. Yu.Baryshnikov, O. V. Chistyakova

MONOCLONAL ANTIBODY ICO-GM1 TO ANTIGEN CD11B AND ITS IMMUNOLOGICAL CHARACTERIZATION

Research Institute of Clinical Oncology, Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors

The tissular and organic integrity of multicellular organisms is maintained due to both reciprocal interaction of cells and their relations with extracellular matrix. These interactions are determined by a large and diverse class of adhesion molecules [6]. Integrins are surface cellular proteins that trigger adhesion of cells by interacting with some proteins of the matrix [12,13]. Leukocyte integrins like other adhesion molecules play a significant part in leukocyte migration from the blood to tissues, platelet aggregation, immunological processes [13]. The integrin superfamily includes glycoprotein molecules consisting of alpha-and beta-subunits and is divided into two families, i.e. beta-1 and beta-2 families. The beta-2 family (CD 18) includes proteins consisting of 2 subunits, i.e. beta-2 subunit (CD 18, 95,000 D) common for all integrins and alpha subunit associated in a non-covalent manner with the former and unique for every integrin [6,15]. There are 3 types of alpha-subunits in the beta-2 integrin family, i.e. alpha-L (mol. weight 177,000-180,000 D): Leu-CAM, CDlla, LFA-1; alpha-M (mol. weight 165,000-170,000 D): Mac-1, Mol, OKM-1, CR3, CD1 lb; and alpha-X (mol. weight 150,000 D): pi50/95, CR4, CD 11c. LFA-1 (CDlla) is expressed practically on all normal leukocytes and mediates interactions of leukocytes with endothelium, NK-cells and cytotoxic lymphocytes with target cells, aggregation of granulocytes and monocytes [8,9]. CDllb is mainly expressed on myeloid cells as well as on NK-cells and activated lymphocytes. The CD1 lb molecule binds soluble ligands (iC3b complement component, X factor, fibrinogen), triggers adhesion of myeloid cells to endothelium, leukocyte homo-typic aggregation and chemotaxis [7,16]. pi50/95 (CD1 lc) is detected on monocytes and tissular macrophages, granulocytes, NK-cells, cytotoxic T-cells, some B-cell lymphomas (CD5+) [10,16]. The antigen is also expressed on hairy-cell leukemic cells, on some T-cell lymphomas [6]. pi50/95 participates in conjugation of cytotoxic lymphocytes and target cells, as well as in adhesion of neutrophils and monocytes [10,12,14]. There are currently a large number of monoclonal antobodies (MAb) to molecules of CD1 la,b,c and CD 18 clusters. MAb to these antigens are successfully employed both in scientific research and in clinical practice to prevent graft-versus-host reaction in bone marrow transplantation, for diagnosis and characterization of immunodeficiencies, leukemias and lymphomas. MAb ICO-GM1 to antigen of myeloid cells CD1 lb have been developed by M.A.Kryzhanov et al. [1,2] at the Laboratory for Clinical Radioimmunology of the

дефицитов, лейкемий и лимфом. В лаборатории клинической радиоиммунологии ОНЦ РАМН М. А. Крыжа-новым и соавт. [1, 2] получены MKAICO-GM1 кантигену миелоидных клеток CDllb. Цель данной работы — охарактеризовать МКА ICO-GM1 с помощью панели МКА отечественного и зарубежного производства методом проточной цитофлюорометрии.

Материалы и методы. МКА. МКА ICO-GMI получены путем иммунизации мышей линии BALB/c лейкоцитами крови больного острым миеломонобластным лейкозом по стандартной методике [4, 7]. В качестве источника МКА использовали культуральную жидкость гибридом, а также асцитическую жидкость мышей-носителей перевиваемой гибридомной линии.

Панель МКА, используемых в работе, представлена в табл. 1.

Реакция поверхностной иммунофлюоресценции. Окрашивание клеток антителами проводили двумя методами: непрямой и прямой реакцией. При постановке непрямой реакции иммунофлюоресценции в качестве вторых антител использовали Р(аЬ)г-фраг-менты иммуноглобулинов кролика, меченные FITC или фикоэритри-ном (РЕ), изотипспецифические сыворотки производства фирмы «Becton-Dickinson». Реакцию проводили по обычной методике, описанной ранее [3, 11]. При постановке прямой реакции иммунофлюоресценции использовали МКА, напрямую меченные FITC или РЕ.

Реакция двойного мечения к лето к. При постановке реакции иммунофлюоресценции методом двойной метки клетки обрабатывали антителами, которые затем проявляли FITC либо РЕ, и реакцию учитывали по двум сигналам флюоресценции.

Конкурентная ингибиция связывания МКА.В экспериментах по блокаде связывания клеток с МКА клетки преобраба-тывали насыщающей концентрацией МКА, а затем после инкубации и двух отмывок к клеткам добавляли меченные FITC или РЕ МКА.

Результаты и обсуждение. МКА ICO-GM1 тестировали на клетках периферической крови здорового донора: лимфоцитах, гранулоцитах и моноцитах. В качестве положительного контроля для CDllb использовали МКА Mol. Гистограммы распределения при окрашивании клеток периферической крови МКА ICO-GM1 и Mo 1 представлены на рис. 1. МКА ICO-GM1 реагировали с 26% лимфоцитов, 90% гранулоцитов, 50% моноцитов. Антитела Mol связывались с 23% лимфоцитов, 84% гранулоцитов, 56% моноцитов. Сходство профилей флюоресценции МКА ICO-GM1 и Mol позволяет предположить, что эти антитела распознают один и тот же антиген.

Исследования методом двойного окрашивания клеток показали, что среди лимфоцитов популяция, составлявшая около 25% от общего количества клеток, связывалась и с МКА ICO-GM1, и с МКА Leu-15 (анти-CD 1 lb), меченными РЕ (Leu-15PE). Среди популяции гранулоцитов практически все клетки реагировали с обоими антителами (рис. 2). Результаты эксперимента показывают, что МКА ICO-GM1 и Leu-15PE реагируют с одной и той же субпопуляцией клеток.

Эксперименты по конкуретной ингибиции показали, что обработка клеток периферической крови насыщающей концентрацией МКА ICO-GM1 практически не блокирует присоединения МКА Leu-15PE (рис. 3), т. е. МКА ICO-GM1 и Leu-15 взаимодействуют с разными эпитопами молекулы CD1 lb.

МКА ICO-GM1 тестировались на тканях солидных злокачественных опухолей человека различного происхождения и локализации, а также на клетках крови больных хроническим миелоидным лейкозом в стадии властного криза. МКА тестировались с помощью реакции им-муноферментным методом на криостатных срезах опухолей [2, 5]. В качестве положительного контроля были использованы МКА В-8, направленные к раковоэмбриональному антигену (контроль для опухолей желудочно-кишечного

Таблица 1 Table 1

МКА, используемые в работе MAb employed in the investigation

MKA Кластер диф-ференци-ровки Изотип Клеточная специфичность

Leu-15 CDllb IgG2a Гранулоциты, моноциты, NK-клетки Granulocytes, monocytes, N К-cells

ICO-GMI CDllb IgG2a Гранулоциты, моноциты, NK-клетки Granulocytes, monocytes, N К-cells

Mol CDllb IgM Гранулоциты, моноциты NK-клетки Granulocytes, monocytes, N К-cells

MAb Differentiation cluster Isotype Cellular specificity

CRC RAMS. The purpose of this investigation was to characterize the MAb ICO-GMI by flow cytofluorometry using MAb panels of home and foreign production.

Materials and Methods. MAb. The MAb ICO-GM 1 were derived by immunization of BALB/c mice with leukocytes from blood of a patient with acute myelomonoblastic leukemia by a standard tehnique [4,7]. Hy-bridoma culture fluid and ascitic fluid of hybridoma-bearing mice were used as a source of the MAb.

The MAb panel employed in the study is presented in table 1.

Surface immunofluorescence reaction. Antibody staining was performed in a direct and indirect manner. F(ab)2 fragments of rabbit immunoglobulins labeled with FITC or phytoerythrin (PE), isotype-specific sera supplied by Becton-Dickinson were used as a second antibody in indirect immunofluorescence reaction. The reaction was set up according to standard technique described elsewhere [3,11]. MAb labeled directly with FITC or PE were used in direct immunofluorescence reaction.

Double labeling reaction. To set up immunofluorescence reaction by the double label technique the cells were treated with antibody further developed by FITC or PE, the reactivity was detected by two fluorescence signals.

Competitive inhibition of MAb binding. In experiments of cell-MAb binding blockade the cells were pretreated with MAb at a saturating concnetration, incubated, washed two times, then F1TC-or PE-labeled MAb were added to the cells.

Results and Discussion. The MAb ICO-GMI were tested on lymphocytes, granulocytes and monocytes of a normal donor. MAb Mol were used as positive control. Distribution diagrams obtained on staining peripheral blood cells with ICO-GM 1 and Mo 1 are presented in fig. 1. ICO-GMI reacted with 26% of lymphocytes, 90% of granulocytes, 50% of monocyes. Antibody Mol bound to 23% of lymphocytes, 84% of granulocytes, 56% of monocytes. The similarity of ICO-GMI and Mol immunofluorescence profiles suggests that these antibodies recognize the same antigen.

The experiments with double staining showed that about 25% of total lymphocytes bound to ICO-GM 1 and Leu-15 (anti-CD 11 b) labeled with PE (Leu-15PE). Next to

а

Мо 1

ICO-GM1

Рис. 1. Гистограммы распределения клеток периферической крови здоровых доноров, окрашенных МКА 1СО-СМ1 и Мо1.

а — лимфоциты; Ь — гранулоциты; с — моноциты.

Fig.1. Distribution of ICO-GM1- and Mo1-stained cells of peripheral blood from normal donors.

a, lymphocytes; b, granulocytes; c, monocytes.

ICO-GM1 ICO-GM1

Рис. 2. Реакция двойного окрашивания клеток периферической крови здоровых доноров МКА ICO-GM1 и Leu-15РЕ.

Здесь и на рис. 3: а — лимфоциты; b — гранулоциты.

Fig. 2. Double staining with MAbs ICO-GM1 and Leu-15PE of peripheral blood cells from normal donors.

a, lymphpocytes; b, granulocytes.

тракта), и ICO-25 к жировым глобулам молочной железы (контроль для опухолей молочной железы и яичника). Результаты исследования представлены в табл. 2.

Таблица 2

Реактивность МКА ICO-GMI с тканями солидных опухолей человека MAb ICO-GMI reactivity with human solid tumor tissues

all granulocytes reacted with both antibodies (fig.2). Thus, The MAb ICO-GMI and Leu-15PE reacted with the same cellular subpopulation.

Table 2

Тип опухоли Число случаев ICO-GM1 ICO-25 B-8

Аденокарцинома прямой кишки Rectal adenocarcinoma 2 0/2 Н.т./n. t. 1/1

Аденокарцинома слепой кишки Typhlic adenocarcinoma 1 0/1 Н.т./п. t. 0/1

Аденокарцинома сигмовидной кишки Colonic adenocarcinoma 2 0/2 Н.т./п. t. 2/2

Аденоакантома яичника Ovarian adenoacanthoma і 0/1 0/1 0/1

Аденокарцинома яичника Ovarian adenocarcinoma 3 0/3 0/3 0/3

Недифференцированная карцинома яичников Undifferentiated ovarian carcinoma 1 0/1 0/1 0/1

Андробластома яичников Ovarian androblastoma і 0/1 0/1 0/1

Рак молочной железы Breast carcinoma 11 0/11 2/11 4/11

Рак желудка Gastric carcinoma 2 0/2 0/2 0/2

Лимфосаркома Lymphosarcoma 1 0/1 0/1 0/1

Tumor type No. of cases ICO-GM1 ICO-25 B-8

Примечание. В числителе — количество положительных случаев, в знаменателе — общее количество случаев. Н.т. — не тестировались. Note. Numerals in the numerator represent the number of positive cases, numerals in the denominator represent the total numober of cases, n.t. stands.

Leu-15PE b IC0-GM1 + Leu-15PE

Рис. 3. Реакция конкурентной ингибиции МКА Leu-15РЕ антителами ICO-GM1 на клетках периферической крови здоровых доноров. Fig. 3. Competitive inhibition of Leu-15PE by ICO-GM1 on peripheral blood cells from normal donors.

a, lymphpocytes; b, granulocytes.

МКА 1СО-ОМ1 не реагировали с тканями солидных опухолей человеческих органов. На клетках периферической крови больных хроническим миелоидным лейкозом в стадии бластного криза (БК ХМЛ) МКА 1СО-ОМ1 тестировались в реакции иммунофлюоресценции на проточном цитофлюориметре. МКА 1СО-СМ1 реагируют с бластными клетками крови больных БК ХМЛ в широком диапазоне значений — от 8,5 до 96,1%. В среднем МКА 1СО<гМ1 выявляли около 48% бластных клеток крови больных БК ХМЛ.

МКА 1СО-ОМ1 тестировались М. А. Крыжановым на клетках периферической крови здоровых доноров методом непрямой реакции иммунофлюоресценции с использованием флюоресцентного микроскопа «ОрЮп» [2]. МКА 1СО-ОМ1 реагировали с 71% моноцитов, 92% гранулоцитов, 17% лимфоцитов. При тестировании 1СО-СтМ1 методом проточной цитофлюориметрии на клетках крови МКА выявляли соответственно 50% моноцитов, 90% гранулоцитов и 26% лимфоцитов. Таким образом, были получены и охарактеризованы с помощью метода проточной цитофлюорометрии МКА к антигену к СБ11Ь — молекуле клеточной адгезии лейкоцитов. Антитела к антигенам кластера СЭ11а,Ь,с могут применяться в кли-

The competitive inhibition experiments showed that the pretreatment of peripheral blood cells with ICO-GM1 at a saturating concentration did not blocked the Leu-15PE binding (fig.3), i.e. the MAb ICO-GM1 and Leu-15 reacted with different epitopes of the CD1 lb molecule.

ICO-GM 1 was tested on tissues of human solid malignant tumors of various genesis and sites, as well as on blood cells of patients with chronic myeloid leukemia at the stage of blast crisis. The MAb was tested by immunoenzymomet-ric assay on tumor cryostats [2,5]. MAb B-8 to carcinoem-bryonic antigen (for gastrointestinal tumors) and ICO-25 to fat globules of the breast (for breast and ovarian tumors) were used as positive control. Results of the investigation are summarized in table 2.

ICO-GM 1 did not react with human solid tumor tissues. The antibody showed fluorescence on cells of peripheral blood from patients with blast crisis chroic myeloid leukemia (BC CML) as detected by flow cytometry. ICO-GM 1 reactivity with blasts of BC CML patients was ranging from 8.5% to 96.1%. On the average the MAb ICO-GM 1 recognized about 48% of blasts from BC CML patients.

нике для предотвращения реакции «трансплантат против хозяина» при трансплантации костного мозга, для диагностики лейкемий, лимфом и иммунодефицитных состояний человека.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Барышников А. Ю., Кадагидзе 3. Г., Махонова Л. А., Тутщьш Н. Н. II Иммунологический фенотип лейкозной клетки. — М., 1989. —" С. 105—108.

2. Крыжанов М. А., Барышников А. Ю., Блохина Н. Г. и др. // Бюл. экспер. биол. — 1985. —№ 6. —С. 721—723.

3. Крыжанов М. А., Барышников А. Ю., Тупицын Н. Н. и др. // Современные проблемы клинической гематологии и трансфузиоло-гии: Материалы сессии / Под ред. И. М. Зедгенидзе.—Тбилиси, 1985.— С. 179—180.

4. Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа / Под ред. Р. Г. Кеннета, Т. Дж. Мак-Керна, К. Б. Бехтола. — М., 1983.— С. 365—374.

5. Buyon J.P., Slade S. G., Perdue R. A., Winchester R. J. I/ Leucocyte Typing. White cell Differentiating Antigens/Ed. W. Knapp. — Oxford University Press, 1989. — P. 560.

6. Galfre G., Howe S. C., Milstein C. et al. // Nature. — 1977.— Voi. 266. — P. 550—552.

7. Galfre G., Milstein С. II Methods Enzymol.— 1981. — Vol. 73.— P. 3—46.

8. Larson R. S., Hibbs M. L., Corbi A. L. et al. // Leucocyte Typing: White cell Differentiating Antigens/Ed. W. Knapp. — Oxford University Press, 1989. — P. 568.

9. Locey B. J., Rogers С. М., Todd R. F. II Ibid. — P. 555.

10. Pallesen G., Hamilton-Dutoit S., Plesner Т. II Ibid. — P. 553.

11. Pope /., Hale G., Waldmann H. II Ibid. — P. 559.

12. Schwarting R., Moebius U., Meuer S., Stein H. II Ibid. — P. 564.

13. Taylor G. М., Robson A., D'Souza S. W. D. // Ibid. — P. 551.

14. Uciechowski P., Schmidt R. E. //Ibid. — P. 543.

15. Uciechowski P., Schmidt R. E. // Ibid. — P. 597.

16. Werfel Т., Koch G., Gotie О. II Ibid. — P. 563.

M. A.Kryzhanov tested ICO-GM1 on peripheral blood cells from normal donors for reactivity in indirect immunofluorescence assay using an Opton fluorescent microscope [2]. ICO-GM 1 reacted with 71% of monocytes, 92% of granulocytes, 17% of lymphocytes. As evaluated by flow cytometry on blood cells ICO-GM 1 showed a reactivity of 50% with monocytes, 90% with granulocytes and 26% with lymphocytes.

Thus, MAb to CD lib antigen, leukocyte adhesion molecule, was derived and characterized by flow cyto-fluorimetry. Antibodies to CD 11 a,b,c cluster antigens may be applied in the clinical practice to prevent graft-versus-host reaction in bone marrow transplantation, to diagnose leukemias, lymphomas and immunodeficient conditions in man.

Поступила 02.11.93 / Submitted 02.11.93

© Коллектив авторов, 1995 УДК 616-006:612.112.+015.37.62

Р. Ю. Раманаускайте, И. Ф. Абронина, А. В. Ившина,

А. В. Кузнецова, В. С. Ананьев

ДЕЙСТВИЕ (3-КАРОТИНА НА ПОКАЗАТЕЛИ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ ПРИ КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ ОСНОВНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, НИИ клинической онкологии

В последние годы проявляется значительный интерес к (3-каротину как иммуностимулятору, способному интегрально увеличивать нормальный или пониженный гуморальный и клеточный иммунитет человека и животных [2, 3].

Необходимость стимулирования иммунной системы возникает при развитии вторичных дефицитов, вызванных как ростом опухоли, так и проведением курсов противоопухолевой химиотерапии, у-облучения, сопровож-

R. Yu.Ramanauskaite, I.F.Abronina, A. V.Ivshina,

A. V.Kuznetsova, V.S.Ananyev

BETA-CAROTENE EFFECT ON CELLULAR IMMUNITY IN CANCER PATIENTS UNDERGOING COMBINED THERAPY FOR DOMINANT DISEASE

Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors, Research Institute of Clinical Oncology

Over the last years a considerable interest is focussed on beta-carotene as an immunity stimulator able to increase both normal or reduced humoral and cellular immunity in animals and humans [2,3].

The necessity to stimulate the immunity in cancer patients arises due to the development of secondary deficiencies as a result of both tumor growth and antitumor chemo-or gamma-radiotherapy leading to further dysfunction of the protection system.