CC BY
27
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ EXPERIMENTAL ИССЛЕДОВАНИЯ INVESTIGATIONS
©Коллектив авторов, 1994
УДК 616.155.02-007.12-07:616.155.96-097-078.73
А. Ю. Барышников, Т. Н. Заботина, Е. Достот,
М. Шмид, Л. Боумселл
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-90 И ICO-114 К АНТИГЕНУ CD3 ЗРЕЛЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ
НИИ клинической онкологии, Москва, U93 INSERM, Париж
Антиген CD3 (СБЗ-комплекс, ТЗ), впервые описанный Е. Reinherz и соавт. [7], является маркером зрелых Т-лимфоцитов. Он состоит из пяти инвариабельных цепей: CD3-y, gp26; CD3-A, gp20; CD3-e, р20; CD3-£, р 16 гомодимер; CD3-ri, р28 [3, 5]. Антиген CD3 высокоспецифичен и экспрессирован только на зрелых (медуллярных) тимоцитах и зрелых Т-клетках, а также на некоторых Т-клеточных линиях. Молекула играет важную роль в функционировании Т-лимфоцитов. Она ассоциирует с а/(3- или у/Д-димерами Т-клеточного рецептора антигена и участвует в передаче сигнала. Моноклональные антитела (МКА) к антигену CD3 индуцируют или ингибируют активацию Т-клеток [4, 6].
Цель работы — получение и характеристика моноклональных антител (МКА) к антигену CD3.
Материалы и методы. В качестве источника МКА использовали асцитическую жидкость мышей-носителей гибридом в разведениях 1:100. В качестве вторых антител при постановке непрямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ) использовали Р(аЬ')2-фрагменты, полученные из коммерческой кроличьей сыворотки против иммуноглобулинов белой мыши, меченной FITC (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи), предварительно адсорбированной лейкоцитами человека для удаления неспецифического связывания. При использовании биотинилированных антител применяли коньюгаты Streptavidin-PE ("Becton Dichinson" и "Immutech S. А."). РИФ, учитываемая на проточных цитофлюориметрах FACScan или FACStar ("Becton Dickinson"), конкурентная ингибиция связывания МКА, двойное окрашивание клеток МКА, определение молекулярной массы антигена из лизата лимфоцитов крови описаны ранее [2].
Результаты и обсуждение. Гибридомы ICO-90 и ICO-114 получили при слиянии спленоцитов мышей линии BALB/c, пятикратно иммунизированных с 2-недельным интервалом Т-лимфоцитами периферической крови здоровых доноров, с клетками мышиной миеломы РЗ х Ag8.653. Обе гибридомы стабильно продуцировали МКА IgG2a-изотипа. МКА характеризовали по реактивности с различными типами клеток периферической крови и клеточными линиями (табл. 1 и 2). МКА ICO-90 реагировали в РИФ с 60,7±3,4% лимфоцитов периферической крови всех 25 тестированных здоровых доноров, a ICO-114 — с 50,4±6,6%. Оба МКА не реагировали с моноцитами, гранулоцитами, эритроцитами и тромбоцитами. Тестирование MICA ICO-90 и ICO-114 на тимоцитах 4 детей выявило 62,7±4,9 и 56,0±10,1% антигенположительных клеток соответственно. Нами было проведено параллельное тестирование других МКА к антигену CD3. Гистограммы распределения клеток, окрашенных МКА ICO-
А. Yu. Baryshnikov, Т. N. Zabotina, Е. Dostot,
М. Shmid, L. Boumsell
MONOCLONAL ANTIBODIES ICO-90 AND ICO-114 TO MATURE T-LYMPHOCYTE ANTIGEN CD3
Research Institute of Clinical Oncology, Moscow, U93 INSERM,
Paris
The anitgen CD3 (CD3 complex, T3) first described by E.Reinherz et al. [7] is a marker of mature T-lympho-cytes. It consists of five invariable chains, such as CD3-y, gp26; CD3-A, gp20; CD3-e, p20; CD3-£, pl6 homodimer; CD3-ri, p28 [3,5]. The antigen CD3 is highly specific and is expressed on mature (medullar) thymocytes and mature T-cells, as well as on some T-cell lines only. The molecule plays an important part in T-lymphocyte functioning. It associates with a/p- or y/A-dimers of the antigen T-cell receptor and participates in signal transmission. Monoclonal antibodies (MoAB) to antigen CD3 induce or inhibit activation of T-cells [4,6].
The purpose of this investigation was to obtain and characterize MoABs to the antigen CD3.
Materials and Methods. We used ascitic fluid of hybridoma-bearing mice in 1:100 dilution as a source of MoABs. As a second antibody in direct immunofluorescence (IF) study we used F(ab'^-fragments from commercial FITC-labeled rabbit serum against white mouse immunoglobulins (supplied by the N.F.Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology), previously adsorbed by human leukocytes to remove non-specific binding. Conjugates Streptavidin-PE (Becton Dickinson and Impute S.E.) were used with biotin-modified antibodies. The count of reactivity by IF using FACScan or FACStar (Becton Dickinson) flow cytometers, competitive inhibition of MoAB binding, MoAB double staining, molecular weight determination of antigens from blood lymphocyte lysate were described previously [2].
Results and Discussion. Hybridomas ICO-90 and ICO-114 were btained by fusing spleen cells of BALB/c mice immunized 5 times at a two week interval with normal donors’ peripheral blood T-lymphocytes and murine myeloma P3xAg8.653 cells. The both hybridomas produced steadily IgG2a-isotype MoABs. The MoABs were tested for reactivity with various peripheral blood cell types and cell lines (tables 1 and 2). MoAB ICO-90 showed reactivity by IF with 60.7±3.4% of peripheral blood lymphocytes of all 25 normal donors tested, while ICO-114 was reactive with 50.4±6.6%. Both the MoABs did not react with monocytes, granulocytes, erythrocytes and platelets. Test of MoABs ICO-90 and ICO-114 on thymocytes of 4 children revealed 62.7+4.9% and 56.0+10.1% of antigen- positive cells, respectively. We tested in parallel other MoABs to antigen CD3. Bar diagrams of ICO-90-and ICO-114 -stained cell distribution were similar to bar diagrams ffor cells stained by other MoAB to CD3. The difference in antigen-positive cell percentages was not statistically significant (see table 1).
Реактивность МКА ICO-90 и ICO-114 с клетками крови и тимоцитами МоАВ ICQ-90 and ICO-114 reactivity with blood cells and thymocytes
Тип клеток ICO-90 ICO-114 Leu4 IOT3 OKT3
Лимфоциты / Lymphocytes 60,7±3,4* 50,4±6,6 60,8±2,7 58,2±4,4 58,2±6,6
Моноциты / Monocytes 0 0 0 Н.т. / n.t. Н.т. / n.t.
Гранулоциты / Granulocytes 0 0 0 To же To же
Эритроциты / Erythrocytes 0 0 0 » »
Тромбоциты / Platelets 0 0 0 » »
Тимоциты / Thymocytes 62,7±4,9 56,0+10,1 67,9+7,1 » »
Cell type ICQ-90 ICO-114 Leu4 IOT3 OKT3
Примечание. Здесь и в табл. 2, 3 звездочкой обозначен процент антигенположительных клеток; «Н.т.» — не тестировали. Note. Here and in tables 2, 3 the asterisk shows percentage of antigen-positive cells, n.t. stands for «not tested».
90 и ІСО-114, были схожи с гистограммами распределения клеток, окрашенных другими МКА к антигену СБЗ. Процент антигенположительных клеток статистически значимо не различался (см. табл. 1).
Тестирование МКА ІСО-90 и ІСО-114 на различных клеточных линиях показало, что они реагируют с Т-кле-точными линиями НРВаїї, В12Ь, Іигкаї, ІЧК-клеточной линией № 1 и не связываются с Т-клеточной линией Мок-4, а также с другими линиями клеток (см. табл. 2).
Таблица 2 Table 2
Реактивность МКА ICO-90 и ICO-114 с клетками перевиваемых клеточных линий
МоАВ ICQ-90 and ICO-114 reactivity with cells of transplantable cell lines
Линия клеток Характеристика ICO-90 ICO-114 CD3x3
HPBall Т-клеточная T-cellular 96,9* 99,7 96,8
Molt-4 Та же / The same 0 0 0
Jurkat » 80,0 67,5 Н.т. / n. t.
B12b » 97,5 Н.т. / n. t. 87,8
JF1 NK-клеточная NK-celluIar 97,5 23,3 0
JFP В-клеточная B-cellular 0 0 0
JY Та же / The same 0 0 0
Raj і » 0 0 0
Namalva » 0 0 0
Reh Пре-В-клеточная Pre-B-cellular 0 0 0
K562 Эритробластоидная Erythroblastoid 0 0 0
HL-60 Миелоидная Myeloid 0 0 0
U937 Монобластоидная Monoblastoid 0 0 0
Cell line Characteristic ІСО-90 ГСО-114 CD3x3
When tested on various cell lines MoABs ICO-90 and ICO-114 showed reactivity with T-cell lines HPBall, B12b, Jurkat, an NK-cell line JF1 and no binding to cell line Molt-4 or other cell lines (see table 2).
The MoABs were further characterized by competitive inhibition. Preliminary treatment of peripheral blood lymphocytes with MoAB ICO-90 led to complete removal of binding of PE-stained biotin-modified MoAB ICO-90 to these cells (table 3). Lymphocyte preincubation with MoAB ICO-114 resulted in about 1/3 suppression of MoAB ICO-90 binding to the cells in 2 of 4 experiments. MoAB OKT3 prevented the binding to MoAB ICO-90 in 1 of 6 experiments only. MoABs ICO-90 and ICO-114 did not block binding of MoAB IOT3 and Leu4 to lymphocytes. The study by competitive inhibition on T-cell line HPBall discovered that MoAB CD3x3 induces a 50% reduction in the MoAB ICO-90 and a 70% reduction in the MoAB ICO-114 binding. This suggested that all the MoABs recognized different epitopes.
The next stage of the MoAB ICO-90 study involved double staining techniques. The experiments were set up on MoABs OKT3, Leu4 and IOT3 to antigen CD3. As is seen in figure 1 OKT3 and ICO-90 stained the same cellular population located in quadrant 2. There were no cells stained either by ICO-90 or by OKT3 (quadrants 1 and 4). Similarly MoABs Leu4 and ICO-90 bound to the same cells. MoAB IOT3 showed reactivity to the same cells as ICO-90. Thus, the tests by double staining suggest ICO-90 reactivity to all CD3-positive cells.
MoAB ICO-90 was also characterized by antigen modulation, because antigen CD3 disappears after contact with the MoAB [1]. Preincubation of lymphocytes with 50 mcl of MoAB ICO-90 led to disappearance from the cell surface of antigen CD3 recognized by OKT3, Leu4, IOT3. At the same time the preincubation had effect on expression of antigen CD5 recognized by MoAB Leul (fig.2). The antigen disappeared entirely from the cellular surface 3 hours after onset of incubation of cells with the MoAB and was absent for 18 hours (observation term). A 18-hour incubation of intact cells at 4°C or 37°C did not change expression of the antigen recognized by the above-mentioned MoABs. Thus, these findings suggest that MoAB ICO-90 reacts with the same molecule as MoABs OKT3, Leu4 and IOT3, i.e. with antigen CD3.
о
О)
I
О
О
Т
э
<и
о
О)
і
О
О
ОКТЗ I СО-90 ЮТЗ
Рис. 1. Двойное окрашивание лимфоцитов МКА ICO-90 и МКА к антигену CD3.
По оси абсцисс—МКА, конъюгированные с FITC; по оси ординат —МКА, конъюгированные с фикоэритрином.
1—4 — локализация популяций клеток.
Fig.1. Lymphocyte double staining by MoAB ICO-90 and anti-CD3 MoABs.
Numbers on the x axis show FITC-conjugated MoABs; numbers on the у axis show PE-conjugated MoABs. 1—4, cell population location.
Для дальнейшей характеристики МКА использовали метод конкурентной ингибиции. Предварительная обработка лимфоцитов периферической крови МКА ICO-90 приводила к полной блокаде связывания с этими клетками биотинилированных МКА ICO-90, окрашенных РЕ (табл. 3). Преинкубация лимфоцитов с МКА ICO-114 угнетала приблизительно на 1/3 связывание с клетками МКА ICO-90 в 2 из 4 опытов. МКА ОКТЗ лишь в 1 из 6 опытов препятствовали присоединению МКА ICO-90. МКА ICO-90 и ICO-114 не блокировали связывание с лимфоцитами МКА ЮТЗ и Leu4. При постановке реакции конкурентной ингибиции на Т-клеточной линии HPBall обнаружили, что МКА CD3 х 3 угнетают связывание с клетками МКА ICO-90 на 50%, а МКА ICO-114 — на 70%. Все это свидетельствует о том, что все МКА распознают разные эпитопы.
Следующим этапом в исследовании МКА ICO-90 явилось использование метода двойного окрашивания. В этих опытах были использованы МКА ОКТЗ, Leu4 и ЮТЗ, направленные к антигену CD3. Как видно на рис. 1, МКА ОКТЗ и ICO-90 окрашивали одну и ту же популяцию клеток, локализованную в квадрате 2. Отсутствовали клетки, окрашенные только МКА ICO-90, или МКА ОКТЗ (квадраты 1 и 4). Аналогичным образом, МКА Leu4 и ICO-90 связывались с теми же самыми клетками. МКА ЮТЗ также реагировали с теми же клетками, что и МКА ICO-90. Таким образом, из опытов двойного окрашивания можно сделать вывод, что МКА ICO-90 реагируют со всеми СБЗ-положительными клетками.
МКА ICO-90 также характеризовали методом антигенной модуляции, так как антиген CD3 исчезает после контакта с МКА [1]. Преинкубация лимфоцитов с 50 мкл МКА ICO-90 приводила к исчезновению с клеточной поверхности антигена CD3, выявляемого МКА ОКТЗ, Leu4, ЮТЗ. В то же самое время эта преинкубация не влияла на экспрессию антигена CD5, выявляемого МКА Leul (рис. 2). Антиген полностью исчезал с клеточной поверхности через 3 ч после начала инкубации клеток с МКА и отсутствовал в течение 18 ч (срок наблюдения). Инкубация интактных клеток при 4 или 37° С в течение 18 ч не влияла на экспрессию антигена, выявляемого вышеперечисленны-
Finally we determined molecular weight of the antigen recognized by these MoABs. MoABs ICO-90 and ICO-114 were found to immunoprecipitate a wide band with molecular weight 25,000 Da from lymphocyte lysate, which corresponds to molecular weight of antigen CD3 (fig.3).
So, MoABs ICO-90 and ICO-114 react with lymphocytes, thymocytes and some T-cell lines and do not bind to other blood cells and cell lines. MoAB ICO-90 reacts with the same cell population as other anti-CD3 MoABs. MoABs ICO-90 and ICO-114 interact with the same lym-
T a 6 ji b u i 3 Table 3
Ингибиция связывания МКА ICO-90 и другими анти-СШ МКА Inhibition of MoAB ICQ-90 binding with other anti-CD3 MoABs.
Вариант обработки клеток № опыта
1 2 3 4 5 6
ICO-90PE 20,1* 22,4 47,5 59,4 79,2 71,9
ICO-90 + ICO-90PE 0,7 1,6 1,1 1,8 3,5 1,8
ОКТЗ + ICO-90PE 18,1 21,1 11 61,1 71 79,9
ICO-114 + ICO-90PE H.t. n. t. H.t. n. t. 28,3 55,1 48,7 72,2
IOT3F 19,4 17,4 48,1 60,1 72 70,4
ICO-90 + IOT3F 23,2 18,9 51,9 57,4 69,2 75,3
ICO-114 + IOT3F H.t. n. t. H.t. n. t. 50,1 56,5 65,9 75,1
Leu-4F 18,2 18 46,8 60,1 75,7 73,8
ICO-90 + Leu-4F 21,7 H.t. n. t. 49,2 52,4 73,2 74,9
ICO-114+ Leu-4F H.t. n. t. H.t. n.t. 52,4 55,3 68,6 75,6
Cell treatment 1 2 3 4 5 6
No. of experiment
Рис. 2. Модуляция антигена после преинкубации с МКА 100-90.
По оси абсцисс — время инкубации, ч; по оси ординат — процент антигенположительных клеток.
Fig.2. Antigen modulation after preincubation with MoAB ICO-90.
Numbers on the x axis show hours till incubation; numbers on the у axis show percentage of antigen-positive cells.
ми МКА. Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что МКА ICO-90 реагируют с той же самой молекулой, что и МКА ОКТЗ, Leu4 и ЮТЗ, т.е. с антигеном CD3.
Последним этапом в характеристике МКА явилось определение молекулярной массы антигена, выявляемого этими МКА. Было обнаружено, что МКА ICO-90 и ICO-114 иммунопреципитируют из лизата лимфоцитов широкую полосу с молекулярной массой 25 ООО Д, что соответствует молекулярной массе антигена CD3 (рис. 3).
Таким образом, МКА ICO-90 и ICO-114 реагируют с лимфоцитами и тимоцитами, с некоторыми Т-клеточ-ными линиями клеток и не связываются с другими клетками крови и линиями клеток. МКА ICO-90 реагируют с той же самой популяцией клеток, что и другие анти-CD3 МКА. МКА ICO-90 и ICO-114 взаимодействуют с той же самой молекулой на поверхности лимфоцитов, что и другие анти-СБЗ МКА. Антиген CD3 исчезает с мембраны клеток после контакта с МКА. МКА иммунопреципитируют антиген с молекулярной массой 25 ООО Д, которая соответствует антигену CD3. Следовательно, МКА ICO-90 и ICO-114 определяют антиген CD3. Оба МКА выявляют новые эпитопы антигена CD3, так как они не блокируют присоединение к клеткам других МКА к антигену CD3.
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Филатов А. В., Бочурин П. Ф„ Маркова Н. А., Сурнакова Н. £ // Экспер. онкол. — 1989. — № 2. — С. 28.
2. Baryschnikov A. Yu., Kadagidze Z. G., Korotkova О. V. et al. // Herald
of the All-Union Cancer Research Center. — 1991. — N 2. — P. 10.
3. Borst J., Predville M. A., Therhost C. I/ Europ. J. Immunol. — 1983. —
Vol. 13.— P. 576.
4. Kaneoka H., Perez-Rojas G., Sasasvki T. et al. // J. Immunol. — 1983. —
Vol. 131, N 1. — P. 158.
5. Meuer S. C., Fitzgerald K. A., Hussey R. E. et al. // J. exp. Med. — 1983. —
Vol. 157. — P. 705.
6. Platsoucas C. D., Good R. A. II Proc. nat. Acad. Sci. USA. — 1981. —
Vol. 78. — P. 4500.
7. Reinherz E. L., Kung P. C., Goldstein G. et al. // Ibid. — 1980.— Vol. 77.— P. 1588.
8. Tupisyn N. N., Mechetner E. B., Baryschnikov A. Yu. et al. // Int. J. Cancer. — 1989. — Vol. 44. — P. 589.
1 2 1 2 3 4
Рис. 3. Радиоавтографы электрофореграмм иммунопреципитатов из1251-меченных лизатов лимфоцитов.
а — нередуцирующие условия, б — редуцирующие условия. 1 — асцитическая жидкость непродуцирующей миеломы NS1, 2 — МКА ICO-90, 3—МКА ICO-116, 4 — маркеры молекулярной массы. Стрелкой указана полоса, выявляемая МКА ICO-90.
Fig.3. Electrophoregram radioautographs of immunoprecipitates from 125l-labeled lymphocyte lysates.
a, non-reducing conditions; b, reducing conditions. 1, ascitic fluid of unproductive myeloma NS1; 2, MoAB ICO-90; 3, MoAB ICO-116; 4, molecular weight markers. The arrow shows the band revealed by MoAB ICO-90.
phocyte surface molecule as other anti-CD3 MoABs. Antigen CD3 disappears from cell membranes after contact with the MoABs. The MoABs immunoprecipitate an antigen with molecular weight 25,000 Da which corresponds to antigen CD3. Therefore, MoABs ICO-90 and ICO-114 determine antigen CD3. Both the MoABs reveal new CD3 epitopes because they fail to block binding of other anti-CD3 MoABs with the cells.
Поступила 14.04.92 / Submitted 14.04.92
