CC BY
34
вие, чем полифункциональный тип модификации. Нарастание противоопухолевого эффекта во времени в процессе лечения, а также соотношение величин разовых и курсовых терапевтических и максимально переносимых доз свидетельствуют о возможной кумуляции противоопухолевого эффекта. Отсутствие видимых изменений внутренних органов мышей после применения комплекса не дает возможности предположить механизм гибели вследствие токсичности препарата.
Таким образом, цезий-цис-Ь-серинатопалладий проявляет свойства малотоксичного МБР с противоопухолевым действием. Целесообразно дальнейшее изучение нового комплекса с целью выявления модифицирующих свойств при лечении злокачественных опухолей.
Авторы выражают признательность директору фирмы "1оЬп5оп МаКЬеу ЬкГ', Кх^агаЬ, N.5Ж (Австралия) мистеру А.В. Випперману за предоставление металлического палладия для синтеза нового комплекса.
© А.Ю. Барышников, Т.Н. Заботина, 1994 УДК 616.155.02-007.12-07:616.155.96-097-078.73
А.Ю. Барышников, Т.Н. Заботина
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-86 К АНТИГЕНУ CD4 ХЕЛПЕРНЫХ/ИНДУКТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, НИИ клинической онкологии
Циркулирующий пул Т-лимфоцитов крови состоит из нескольких функционально различных субпопуляций. С помощью моноклональных антител (МКА) удалось идентифицировать некоторые из них [4]. Антигены CD4 и CD8 делят Т-лимфоциты на 2 большие группы — CD4 ’ хелперные/индукторные Т-клетки и CD8+ супрессорные/цитотоксические Т-клетки. Антиген CD4 — одноцепочный трансмембранный гликопротеид с мол. массой 59 000 Д; другое название антигена — Т4. МКА анти-С04 специфически реагируют с хелперной/индукторной субпопуляцией Т-клеток. Антиген также присутствует на поверхностной мембране моноцитов. Описана реакция МКА с трансформированными вирусом Эпштейна-Барра лимфобластоидными В-клеточными линиями, миелоидными клеточными линиями, гистиоцитами и микроглиальными клетками. В периферической крови МКА 3hth-CD4 выявляют около 60% Т-клеток [1, 3]. Функция молекулы: рецептор для молекул II класса гистосовместимости и HIV, вызывающего СПИД. Цитоплазматическая часть молекулы CD4 ассоциирована с р56-1ск тирозинкиназой. Предполагают, что молекула участвует в регуляции функции комплекса CD3/TcR. МКА ингибируют антигенную стимуляцию С1)4-положительных Т-клеток.
Цель настоящей работы — получение и характеристика МКА к антигену CD4.
Материалы и методы. В качестве источника МКА использовали асцитическую жидкость мышей-носителей гибридом в разведениях 1:100. В качестве вторых антител при постановке непрямой
2. Богуш ТА., Ситдикова С.М., Локшин А. // Бюл. экспер. би-ол. - 1989. - № 1. — С. 43-45.
3. Методы вычисления стандартной ошибки средних арифметических величин с помощью таблиц/Стрелков Р.Б. — Сухуми, 1966.
4. Трещалина Е.М., Коновалова А.Л., Пресное МА. и др. // Докл. АН СССР. - 1979. - Т. 248, № 5. -С. 1273-1276.
5. Трещалина Е.М., Коновалова А.Л., Пресное МА. и др. // Вестн. АН СССР. - 1986. - № 5. - С. 51-56.
6. Трещалина Е.М., Седакова ЛА., Фирсова ГА. / / Антибиотики и химиотерапия. — 1990. — Т. 35, № 2. — С. 26—27.
7. Членова Е.Л., Трещалина Е.М., Сыркин А.Б., Переверзева Э.Р. // Новости медицины. — 1985. — № 9—10. — С. 71—88.
8. Charlson A.J., McArdle N.T., Watton Е.С. // Inorganica Chimica Acta. - 1981. - N 56. - P. L35-L36.
Поступила 22.06.92 / Submitted 22.06.92
A. Yu. Baryshnikov, T.N. Zabotina
MONOCLONAL ANTIBODY ICO-86 TO ANTIGEN CD4 OF HELPER/INDUCER T-LYMPHOCYTES
Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors, Research Institute of Clinical Oncology
The blood T-lymphocyte circulating pool consists of several subpopulations different in function. Monoclonal antibodies (Mab’s) help to identify some of them [4]. Antigens CD4 and CD8 divide T-lymphocytes into 2 big groups, i.e. CD4+ helper/inducer T-cells and CD8+ suppressor/cytotoxic T-cells. The CD4 antigen is a single-chain transmembrane glycoproteid with molecular weight 59 kDa, otherwise called T4. The Mab anti-CD4 reacts specifically with a helper/inducer subpopulation of T-cells. The antigen is also present on monocyte surface membranes. There are descriptions of the Mab reactions with Epstein-Barr-virus-transformed lymphoblastoid B-cell lines, myeloid cell lines, histiocytes and microglial cells. Peripheral blood anti-CD4 Mab’s detect about 60% of T-cells [1, 3]. Molecule function: a class II histocompatibility and AIDS-inducing HIV molecule receptor. The CD4 molecule cytoplasmic component is associated with p56-lck tyrosinekinase. The molecule is supposed to contribute to regulation of CD3/TcR complex functioning. The Mab inhibits stimulation of CD4-positive T-cells.
The purpose of this investigation was to produce and characterize a Mab to CD4 antigen.
Materials and Methods. Ascitic fluid in 1:100 dilution of hybridoma-bearing mice was used as a source of the Mab. Adsorbed F(ab’)2 fragments derived from FITC-labeled commercial rabbit serum against white mouse immunoglobulins (N.F. Gamaleya Institute of Epidemiology and Microbiology) were used as a second antibody in indirect immunofluorescence (IF) assay. Streptovidin-phycoerythrin conjugates (Beckton Dickinson, Immunotech S.A.)
реакции иммунофлюоресценции (РИФ) использовали адсорбированные Р(аЬ’)2-фрагменты, полученные из коммерческой кроличьей сыворотки против иммуноглобулинов белой мыши, меченной FITC (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи). При использовании биотинилированных антител применяли конъюгаты стрептавидин—фикоэритрин ("Becton Dickinson" и Immunotech S.A."). Ранее описаны РИФ, учитываемая на проточных цитофлюориметрах FACScan или FACStar ("Becton Dickinson"), конкурентная ингибиция связывания МКА [2], двойное окрашивание клеток МКА [2].
Результаты и обсуждение. Гибридому I СО-86 получили при слиянии спленоцитов мышей линии BALB/c, 3-кратно иммунизированных с 2-недельным интервалом Т-лимфоцитами периферической крови здоровых доноров, с клетками мышиной мие-ломы P3 Ag8.653. Гибридома стабильно продуцировала МКА IgGl-изотипа. МКА характеризовали с точки зрения их реактивности с различными типами клеток периферической крови и клеточными линиями (табл. 1, 2). По данным РИФ, МКА ICO-86 реагировали с 43,1±2,2% лимфоцитов периферической крови всех 17 тестированных здоровых доноров и не реагировали с моноцитами, гранулоцитами, эритроцитами и тромбоцитами. Тестирование МКА ICO-86 на тимоцитах 4 детей выявило 38,4 ±12,8% антиген-положительных клеток. Нами было проведено параллельное тестирование других МКА к антигену CD4. Гистограммы распределения клеток, окрашенных МКА ICO-86 и ICO-120, были идентичны гистограммам распределения клеток, окрашенных другими МКА к антигену CD4. Процент антигенположитель-ных клеток статистически значимо не различался (см. табл 1).
Тестирование МКА ICO-86 на различных клеточных линиях показало, что они реагируют с Т-клеточ-ными линиями HPBall, B12b, Jurkat, Molt-4, но не взаимодействуют с другими линиями клеток (см. табл. 2).
Для дальнейшей характеристики МКА использовали метод конкурентной ингибиции. Предварительная обработка лимфоцитов периферической крови МКА ICO-86 приводила к полной блокаде связывания с этими клетками меченных FITC МКА ICO-87 (табл. 3). МКА JIT4, Leu3a, IOT4 и ОКТ4 не влияли на связывание с лимфоцитами МКА ICO-86, меченный FITC. МКА ICO-86 также не блокировали связывание с клетками МКА IOT4 и Leu3a. Таким образом, МКА ICO-86 реагируют с эпитопом, который отличен от эпитопов, выявляемых МКА JIT4, Leu3a, IOT4 и рядом с ним не локализованных.
Следующим этапом в исследовании МКА ICO-86 явилось использование метода двойного окрашивания. В этих опытах были использованы МКА ОКТ4 и Leu3a, направленные к антигену CD4. Как видно на рис. 1, а, МКА ОКТ4 и ICO-86 окрашивали одну и ту же популяцию клеток, локализованную в квадрате 2. Отсутствовали клетки, окрашенные только МКА ICO-86 или МКА ОКТ4. Аналогичным образом МКА Leu3a и ICO-86, а также МКА ЮТ4 и ICO-86 связывались с теми же самыми клетками (рис. 1, Ъ, с). Таким образом, МКА ICO-86 реагируют, по-видимому, со всеми С04-положительными клетками.
were used in tests with biotin-conjugated antibodies. Previously reported were the Mab reactivity by IF in FACScan or FACStar (Becton Dickinson) cytofluorimeters [5], concurrent inhibition of the Mab binding [2], the Mab double staining of cells [2].
Results and Discussion. ICO-86 hybridoma was produced by fusion of BALB/c mouse splenocytes immunized 3 times with normal donors’ peripheral blood T-lymphocytes at a 2 week interval and murine myeloma P3 Ag8.653 cells. The hybridoma was steadily generating an IgGl Mab. The Mab was characterized by reactivity with various peripheral blood cells and cell lines (tables 1 and 2). As tested by IF the Mab ICO-86 bound to 43.1±2.2% of peripheral blood lymphocytes of all 17 normal donors. The Mab ICO-86 did not bind to monocytes, granulocytes, erythrocytes and platelets. In tests on thymocytes of 4 children ICO-86 detected 38.4±12.8% of antigen-positive cells. In parallel we performed tests of other Mab’s to the CD4 antigen. Bar diagrams of distribution of cells stained with ICO-86 and ICO-120 were identical to those for cells stained with other Mab’s to CD4. The difference in the percentages of antigen-positive cells was not statistically significant (see table 1).
The ICO-86 tests on a variety of cell lines showed the antibody to react with T-cell lines HPBall, B12b, Jurkat, Molt-4 and not to react with other cell lines (see table 2).
Further characterization of the Mab was performed by concurrent inhibition. Preliminary treatment of peripheral blood lymphocytes with ICO-86 led to complete blocking of FITC-labeled ICO-86 binding to these cells (table 3). LT4, Leu3a, IOT4 and OKT4 had no effect on the FITC-labeled ICO-86 binding to lymphocytes. The Mab ICO-86 did not inhibit binding to IOT4 and Leu3a either. Thus, the Mab ICO-86 reacts with an epitope different from non-neighbor epitopes defined by LT4, Leu3a, IOT4.
Further we studied the Mab ICO-86 by double staining using Mab’s OKT4 and Leu3a to CD4. As is seen in fig. 1, a OKT4 and ICO-86 stained the same cell population localized in square 2. There were no cells stained with either ICO-86 or OKT4. Similarly Leu3a and ICO-86 as well as IOT4 and ICO-86 bound to the same cells (fig. 1, b, c). Thus, the conclusion may be made that the Mab ICO-86 binds to all CD4-positive cells.
The Mab ICO-86 was also characterized by antigen modulation, because CD4 disappeared after making contact with the Mab [1]. Preincubation of lymphocytes with 50 fil ICO-86 led to disappearance of CD4 recognized by OKT4 and Leu3a from the cellular surface. But this preincubation had no effect on expression of CD5 defined by Leul (fig. 2). The antigen disappeared from the cellular surface completely after 3 h incubation of the cells with the Mab and was absent for 18 h (time of observation). Incubation of intact cells at 4 or 37 °C for 18 h did not influence expression of antigens recognized by the bove-mentioned Mab’s. Therefore, the Mab ICO-86 reacts with the same molecule as OKT4 and Leu4, i.e. the antigen CD4.
Реактивность МКА ICO-87 с клетками крови человека и тимоцитами Mab ICO-86 reactivity with human blood cells and thymocytes
Клетки ICO-86 Leu 3a IOT4 OKT4 ЛТ4
Лимфоциты / Lymphocytes 43,1 ±2,2* 38,1 ±2,3* 39,4±2,0* 40,9±2,7* 43,6±5,7*
Моноциты / Monocytes 0 0 H.T. / n.t. H.T. / n.t. H.T. / n.t.
Гранулоциты / Granulocytes 0 0 H.T. / n.t. H.T. / n.t. H.T. / n.t.
Эритроциты / Erythrocytes 0 0 H.T. / n.t. H.T. / n.t. H.T. / n.t.
Тромбоциты / Platelets 0 0 H.T. / n.t. H.T. / n.t. H.T. / n.t.
Тимоциты / Thymocytes 38,4± 12,8* 50,2± 11,0* H.T. / n.t. H.T. / n.t. H.T. / n.t.
Cells ICO-86 Leu3a IOT4 OKT4 LT4
* Процент антигенположительных клеток; н.т. — не тестировали. , percentage of antigen-positive cells; n.t., not tested.
Таблица 2 Table 2
Реактивность MKA ICO-86 с клетками перевиваемых клеточных линий Mab ICO-86 reactivity with transplantable cell lines
Линия клеток Характеристика линии клеток MKA Процент антигенположительных клеток
HPBall Т-клеточная / T-cell 96,2
Molt-4 To же / The same 30,5
Jurkat ii it 56,5
B12b и и 44,8
JFP В-клеточная / B-cell 0
JY To же /The same 0
Raj і и it 0
Namalva її ii 0
Reh Пре-В-клеточная / Pre-B-cell 0
K562 Эритробластоидная / Erythroblastoid 0
HL-60 Миелоидная / Myeloid 0
U937 Монобластоидная / Monoblastoid 0
Cell line Mab characterization of cell lines Percentage of antigen-positive cells
Таблица 3 Table 3
Конкурентная ингибиция связывания MKA ICO-86 другими MKA к антигену CD4 Concurrent inhibition of Mab ICO-86 binding by other Mab’s to CD4
Процент антигенположительных клеток
L>dpvi<jm uupduuiM^i № 1 Ns 2 Ns 3 №4
ICO-86F 37,5 49,5 36,4 30,1
1 CO-86+1 CO-86 F 5,6 5,3 2,9 1,4
ЛТ4+ІСО-86Р^Т4+ІСО-86Р 38,4 55,9 32,7 30,3
Leu3a+ICO-86F 40,3 48,8 34,5 34,8
OKT4+ICO-86F 43,8 52,5 31,8 32,5
IOT4F 39,6 46,2 39,7 35,6
ICO-86+IOT4F 37,1 41,0 39,7 35,6
Leu3aF 40,2 43,3 34,4 33,8
ICO-86+Leu3aF 36,7 37,5 35,7 30,3
Experiment No. Percentage of antigen-positive cells
Treatment
MKA ICO-86 также характеризовали методом антигенной модуляции, так как антиген CD4 исчезает после контакта с М1С\ [1]. Преинкубация лимфоцитов с 50 мкл MKA ICO-86 приводила к исчезновению с клеточной поверхности антигена CD4, выявляемого MKA ОКТ4 и Leu3a. В то же время эта преинкубация не влияла на экспрессию антигена CD5, выявляемого MKA Leul (рис. 2). Антиген полностью исчезал с клеточной поверхности через 3 ч после начала инкубации клеток с МКА и отсутствовал в течение 18 ч (срок наблюдения). Инкубация интактных клеток при 4 или 37° С в течение 18 ч не влияла на экспрессию антигенов, выявляемых вышеперечисленными МКА. Эти результаты свидетельствуют о том, что
Thus, the Mab ICO-86 reacts with lymphocytes and thymocytes, with some T-cell lines and does not bind to other blood cells and cell lines. ICO-86 reacts with the same cell subpopulations and the same molecules on lymphocyte surfaces as other anti-CD Mab’s. The antigen CD4 disappears from cellular membranes after making contact with the Mab. Therefore, the Mab ICO-86 recognizes the antigen CD4. The Mab defines a new epitope of CD4 as it does not inhibit binding of other Mab’s to CD4.
0КТ4
Рис. 1. Двойное окрашивание лимфоцитов МКА ICO-86 и МКА к антигену CD4.
По горизонтали — МКА, конъюгированные с FITC; по вертикали — МКА, конъюгированные с фикоэритрином.
1, 2, 3, 4 — популяции клеток.
Fig. 1. Lymphocyte double staining with ICO-86 and other Mab’s to CD4.
Characters on the horizontal show FITC-labeled Mab's, characters on the vertical show phycoerythrin-conjugated Mab’s. 1, 2, 3, 4, cell subpopulations.
Рис. 2. Модуляция антигена после преинкубации с МКА IC0-86.
По оси абсцисс — время инкубации, ч; по оси ординат — процент антигенположительных клеток.
1 — Leu1; 2 — IOT4; 3 — Leu3a; 4 — ОКТ4; 5 — ICO-86.
Fig. 2. Antigen modulation after preincubation with ICO-86.
Numbers on the x axis show hours of incubation; numbers on the у axis show percentage of antigen-positive cells.
1, Leu1; 2, IOT4; 3, Leu3a; 4, OKT4; 5, ICO-86.
МКА ІСО-86 реагируют с той же самой молекулой, что и МКА ОКТ4 и Ьеи4, т.е. с антигеном СБ4.
Таким образом, МКА ІСО-86 реагируют с лимфоцитами и тимоцитами, с некоторыми Т-клеточными линиями клеток и не связываются с другими клетками крови и линиями клеток. МКА ІСО-86 реагируют с той же самой популяцией клеток и с той же самой молекулой на поверхности лимфоцитов, что и другие МКА анти-С04-МКА. Антиген СЛ34 исчезает с мембраны клеток после контакта с МКА. Следовательно, МКА ІСО-86 определяют антиген СБ4. МКА выявляют новый эпитоп антигена СБ4, так как они не блокируют присоединение к клеткам других МКА к антигену СБ4.
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Филатов А.В., Бочурин П.Ф., Маркова НА., Сурнако-ва Н.Е. / / Экспер. онкол. — 1989. — № 2. — С. 28.
2. Baryschnikov A.Yu., Kadagidze Z.G., Korotkova O.V. et al. / / Herald of the All-Union Cancer Research Center. — 1991. - N 2. - P. 10.
3. Kung P.C., Berger C.L., Goldstein G. et al. // Blood. — 1981. — Vol. 57. - P. 261.
4. Reinherz E.L., Kung P.C., Goldstein G. et al. // Proc. nat. Acad. Sci. USA. - 1980. - Vol. 77. - P. 1588.
5. Tupisyn N.N., Mechetner E.B., Baryschnikov A.Yu. et al // Int. J. Cancer. — 1989. — Vol. 44. — P. 589.
Поступила 17.04.92 / Submitted 17.04.92
