CC BY
51
ЛИТЕРА ТУРА / REFERENCES
1. Васильев Ю. М.. Маленков А. Г. Клеточная поверхность и реакция клетки. — Л., 1968.
2. Явишева Т. М., Щербаков С. Д., Хлыпина Е. Г. Морфофункциональные особенности клеток базального слоя эпителия роговицы. Деп. в ВИНИТИ, № 1924 — В — 94.
3. Явишева Т. М., Щербаков С. Д., Хлынина Е. Г. Некоторые механизмы регуляции пролиферации базальных клеток эпителия роговицы мыши. Деп. в ВИНИТИ, № 1922 — В — 94.
4. Coman D. R. // Cancer Res. — 1944. — Vol. 4, N 10. — P. 625—629.
5. Paulus U., Potten C. S., Loeffler M. A. //Cell Prolif. — 1992. — Vol. 725.— P. 559—578.
© Коллектив авторов, 1996 УДК 616.155.392-097
3. Г. Кадагидзе, H. Н. Тупицын, Т. Н. Заботима,
О. В. Короткова, А. В. Соколов, Г. Ш. Овумян,
И. С. Петерсон, М. А. Френкель, А. Ю. Барышников
ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЕ АНТИГЕНЫ РАННИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
НИИ клинической онкологии, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей
Регуляция самоподцержания и пролиферации стволовых клеток (СК) является одной из ключевых проблем в исследованиях дифференцировки гемопоэтических клеток человека. Предполагают, что молекулы поверхностной мембраны участвуют в регуляции стволовых гемопоэтических клеток. В последние годы получен ряд моноклональных антител (МКА) к антигенам, которые экспрессированы на мембране ранних предшественников СК, таких как HLA-DR, CD38, Thy-1, CD71, CD50, CD33, CD13, CD7, CD10, CD19 и т. д. [8, 10, 12, 14, 15]. Эти МКА играют важную роль в изучении СК в норме и при лейкозах [2, 9]. Описаны острые лейкозы (ОЛ) и бластный криз хронического миелолейкоза (БК ХМЛ), при которых бластные клетки не имеют маркеров линейной принадлежности (lin-) и экспрессируют стволовоклеточные антигены CD34, так называемый «примитивный» вариант [1, 3]. Функциональная роль большинства антигенов СК недостаточно ясна.
Поскольку при лейкозах пропорция СК значительно возрастает, нами предпринято изучение функциональной роли ряда дифференцировочных антигенов СК при ОЛ и БК ХМЛ. Маркеры отбирались на основе обширных исследований стволовоклеточных гемобласто-зов. Использовали метод перекрестного связывания (ligation) соответствующих антигенов с помощью МКА для оценки их влияния на регуляцию экспрессии не-заблокированных МКА молекул, ассоциированных с ранними этапами гемопоэтической дифференцировки.
Материалы и методы. Анализировали иммунологический фенотип бластных клеток у 222 больных. Острый лимфолейкоз (ОЛЛ) был у 185 больных, острый миелолейкоз (ОМЛ) (FAB: МО—Мб) — у 33, БК ХМЛ — у 4 (лимфоидный — у 2, миелоидный — у 2).
Использовали МКА к В-клеточным антигенам (CD 19, CD22, CD37, мембранным/цитоплазматическим Ig, Т-клеточным (CDIa, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8), миеломоноцитарным (CDllb, CD13,
6. Potten C. S., Chwalinski S., Swindell R., Palmer M. II Cell Tiss. Kinet. — 1982.— Vol. 15.— P. 351.
7. Potten C. S. The role of stem cells in the regeneration of intestinal crypts after cytotoxic exposure. Chemically induced cell proliferation / Eds B. E. Butterworth, T. J. Slaga, W. Farland, M. McClain. Implications for Risk Assesment.—New York., 1991.
8. Saivicki W, Blaton O, Pindor M. II Am. J. Anat. — 1977. — Vol. 148.— P. 417.
9. Skehan P. II Growth. — 1986. — Vol. 50. — P. 486.
Поступила 14.02.95 / Submitted 14.02.95
Z. G. Kadagidze, N. N. Tupitsyn, T. N. Zabotina,
0. V. Korotkova, A. V. Sokolov, G. Sh. Ovumyan,
1. S. Peterson, M. A. Frenkel, A. Yu. Baryshnikov
DIFFERENTIATION ANTIGENS OF EARLY PRECURSORS OF HUMAN HEMOPOIETIC CELLS
Research Institute of Clinical Oncology, Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors
Regulation of stem cell self-maintenance and proliferation is a key problem in study of human hemopoietic cell differentiation. Surface membrane molecules are believed to contribute to the regulation of the stem hemopoietic cells. A number of monoclonal antibodies (MAb) to antigens expressed on surface membranes of early SC progenitors have been derived over the last years, such as HLA-DR, CD38, Thy-1, CD71, CD50, CD33, CD13, CD7, CD10, CD19, etc. [8, 10, 12, 14, 15]. These MAb play a significant part in study of SC in the normal individuals and in leukemic patients [2, 9]. There are publications describing cases of acute leukemia (AL) and blast crisis chronic myelogeneous leukemia (BC CML) with blasts having no lineage markers (lin~) and expressing stem cell antigens CD34, i. e. of so called “primitive” variant [1,3]. The functional role of most SC antigens is not clear yet.
Since SC proportion is increased in leukemia we carried out a study of functional role of some SC differentiation antigens in AL and BC CML. Selection of markers was performed basing on vast studies of stem cell hemoblastosis. Method of cross-ligation of relevant antigens with MAb was applied to evaluate their regulatory effect on expression of molecules associated with early hemopoietic differentiation stages non-blocked with MAb.
Materials and Methods. Blast cell immunological phenotype was analyzed in 222 patients including 185 with acute lymphocytic leukemia (ALL), 33 with acute myelogeneous leukemia (AML) (FAB:M0-M6), 4 with BC CML (2 of lymphoid and 2 of myeloid types).
Abtibodies used in the study were MAb to B-cell antigens (CD 19, CD22, CD37, membrane/cytoplasmic Ig, T-cell (CDIa, CD3, CD4, CDS, CD7, CD8), myelomonocytic (CDllb, CD13, CD15) and erythroid (glycophorin A, erythroblast antigen HAE9) antigens [13]. Megakaryocytic antigens (CD41, CD61) were studied only in the absence of any lymphoid or myeloid markers in leukemia variants
CDI5) и )ритроидным (гликофорин А, антиген эритробластов — НАЕ9) антигенам [13]. Мегакариоцитарные антигены (CD41. CD6I) изучали только в случаях отсутствия каких бы то ни было лимфоидных и миелоидных маркеров при сложных для цитохимического разграничения вариантах лейкозов. Были также изучены линейно не рестриктированные антигены (HLA-DR, CD38, CD50, CD 10, CD71). Во всех 222 случаях оценивали экспрессию на бластных клетках CD34. В контролях клетки окрашивали ФИТЦ-меченными Р(аЬ)Ч-фрагментами вторых антител без применения первых МКА. Анализ экспрессии антигенов проводили на проточном цитометре FACScan. В положительных случаях антиген присутствовал на более 20% клеток [4].
Функциональную роль связывания мембранных антигенов лей-козных клеток с помощью МКА изучали у 15 больных (7 — CD34+ и 8 — CD34-). Из них OJ1J1 был у 6, ОМЛ (МО) — у 1, ОМЛ (Ml) — у 2, ОМЛ (М2) — у 2, ОМЛ (М4) — у 1, лимфоидный БК ХМЛ — у 2, миелоидный (Ml) БК ХМЛ — у 1. Иммуноподварианты при лимфоидном типе бластов: про-В— 1, пре-пре-В — 6, Т — 1. Властные клетки культивировали в среде RPMI-1640 («Flow Laboratories»), содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 0,1 мг/мл гентамицина (контроль). При оценке влияния МКА к среде культивирования добавляли анти-СОЭ4 МКА ИКО-115 (аффинно-очищенные, 1 мкг/мл), aHTM-CD71 МКА ИКО-92 [9], aHTH-CD38 МКА ИКО-20 (супернатанты культур гибридомных клеток), анти-HLA-DR МКА ИКО-1, aHTH-CD7 МКА ИКО-87 (асцитическая жидкость). Концентрация МКА в среде культивирования соответствовала рабочему титру МКА, используемому при иммунофенотипировании лейкозных клеток. Стерилизацию МКА осуществляли фильтрованием через миллипоровые фильтры 0,22 мкм. Клетки инкубировали при 37° С 18 ч при концентрации 0,5-10 6/мл. Исследование экспрессии мембранных маркеров после культивирования клеток с МКА проводили прямым иммунофлюоресцентным методом (МКА фирмы «Bec-ton Dickinson»), лишь в единичных случаях при полном отсутствии на мембране комплекса антиген — антитело использовали непрямую иммунофлюоресценцию.
Статистический анализ проводили на компьютере с использованием программы Statgrafics.
Результаты. Экспрессия антигена CD34 установлена в 70 из 222 случаев ОЛ (31,5%): 59 (31,9%) из 185 с ОЛЛ, 8 (24,2%,) из 33 с ОМЛ, 3 (75%) из 4 с БК ХМЛ.
Сравнение стволовоклеточных лейкозов (СЛ) с нестволовоклеточными лейкозами (НСЛ) представлено в табл. 1. При СЛ отмечены достоверно более высокие уровни экспрессии CD38, CD10, CD13, CD33 и CD22. CD34+- и CD34--rpynnbi не различались по уровням Т-клеточных антигенов, HLA-DR, пан-В-клеточного антигена CD19, CD37, ICAM-3 (CD50), CD15, CD71. Уровни CDllb+ -клеток, а также НАЕ-9+-клеток были несколько выше при СЛ (р < 0,1).
Установлена статистически значимая корреляция между уровнями CD34+- и С038+-клеток (г = 0,22; р = = 0,0018; п = 206); CD34 — CD 10 (г = 0,27; р = 0,0000; п — 221); CD34 —CD13 (г = 0,38; р = 0,0000; п = 157); CD34 — CD22 (г = 0,21; р = 0,003; п = 198).
В табл. 2 приведены данные сравнения частот анти-генположительных случаев при CD34 +- и CD34 '-лейкозах. Только панмиелоидные антигены CD13 и CD33 достоверно чаще встречались при СЛ (р < 0,05), в то время как уровни различий для нелинейных и лимфоидных антигенов не были статистически значимы.
Функциональные исследования проведены у 15 больных (см. выше). Поставлен 361 эксперимент по оценке взаимовлияния перекрестного связывания мембранных антигенов, характерных для ранних гемопоэтических предшественников. Эти опыты включали 104 исследования после контрольных инкубаций в среде без МКА, 44 — оценку влияния на иммунофенотип кле-
Таблица 1 Table 1
Сравнение иммунофенотипа CD34+- и С034~-лейкозов (М±т)
Comparison of CD34+ and CD34- leuKemias by immunophenotype (Mean±S.D.)
Антиген CD34* ОЛ CD34- ОЛ P
HLA-DR 41,5 ±3,0 (70)* 37,2 + 2,1 (152) 0,24
CD38 41,1+3,0 (68) 33,4 + 2,1 (140) 0,0308
CD8 8,6 + 1,3 (65) 8,3 ±0,7 (143) 0,8
CD4 9,2 ±1,6 (64) 9,2 ±1,0 (142) 0,97
CD7 20,1 ±2,8 (68) 18,4 ±1,8 (149) 0,6
CD5. 14,4 ±3,8 (30) 14,3 ±2,7 (44) 0,99
CD1a 3,1 ±1,2 (15) 8,8 ±3,0 (20) 0,13
CD3 9,6 ±1,4 (47) 12,3 ±1,5 (96) 0,27
CD50 44,6 ±4,0 (46) 39,6 ±2,8 (90) 0,3
CD10 41,7 ±3,3 (70) 31,1 ±2,2 (152) 0,007
CD13 12,7 ±2,2 (46) 6,2 ±0,9 (114) 0,001
CD33 10,8 ±1,9 (52) 5,4 ±0,9 (126) 0,0029
CD19 38,8 ±4,0 (67) 37,5 ±2,6 (146) 0,79
CD22 20,1 ±2.6 (67) 12,8 ±1,5 (133) 0,009
CD37 22,0 ±4,2 (26) 17,1 ±2,6 (57) 0,308
CD15 15,5 ±2,7 (47) 11,1 ±1,3 (121) 0,1
CD11b 11,5 ± 1,9 (67) 7,9 ±1,1 (142) 0,076
HAE9 12,7 ±2,1 (69) 8,8 ±1,0 (145) 0,063
CD71 30,5 ±7,8 (13) 22,8 ±6,6 (17) 0,46
Antigen CD34* AL CD34- AL P
Примечание. В скобках указано число обследованных. Note. Numerals in parentheses show the number of cases.
difficult to differentiate cytochemically. Non-line restricted antigens (HLA-DR, CD38, CD50, CD10, CD71) were also studied. CD34 expression on blasts was studied in all the 222 cases. Control cells were stained with FITC-labeled F(ab)’2 fragments of second antibodies without using first MAb. Analysis of antigen expression was performed using a FACScan flow cytometer. In positive cases antigens were present on more than 20% of cells [4].
Functional role of leukemic cell membrane antigens was studied using MAb in 15 patients (7 CD34+ and 8 CD34-) with ALL (6), AML-M0 (1), AML-M1 (2), AML-M2 (2), AML-M4 (10, lymphoid BC CML (2), myeloid (Ml) BC CML (1). Immunological sub-variants in cases with lymphoid type blasts were pro-B (1), pre-pre-B (6), T (1). Blasts were cultured in RPMI-1640 (Flow Laboratories) containing 15% embryonal calf serum, 2mM glutamin, and 0.1 mg/ml gentamycin (control). In study of MAb effect anti-CD34 Mb ICO-115 (affinity-purified, 1 mcg/ml), anti-CD71 MAb ICO-92 [9], anti-CD38 MAb ICO-20 (hybridoma cell culture supernatant), anti-HLA-DR MAb ICO-1, anti-CD7 Mb ICO-87 (ascites liquid) were added to culture medium. MAb concentration in culture medium corresponded to operating MAb titer used in leukemic cell immunophenotyping. MAb sterilization was performed by filtering through 0.22 mcm mil-lipore filters. Cells were incubated at 37 °C for 18 h at a concentration
0.5 • 106/ml. Study of membrane marker expression after cell culture with MAb was carried out by direct immunofluorescence (MAb supplied by Becton Dickinson), in several cases of the complete absence of antigen-antibody complexes on membranes we applied indirect immunofluorescence.
Statistical analysis used the Statgrafics computer program.
Results. CD34 expression was detected in 70 of the 222 AL cases (31.5%) including 59/185 (31.9%.) ALL, 8/33 (24.2%) ML, 3/4 (75%) BC CML cases.
Table 1 compares stem cell leukemias (SL) and nonstem cell leukemias (NSL). The SL showed a significantly higher expression of CD33, CD10, CD13, CD33 and CD22. There were no difference in contents of T-cell
+27
III
1962 1967
Рис. 1. Родословная семьи Д.
I, II, III — поколения семьи. Квадраты — мужчины, кружки — женщины. Заштрихованные квадраты — больные с параганглиомой, заштрихованные кружки — больные с билатеральной параганглиомой.
Fig. 1. Genealogical tree of the family D.
I, II, III, family generations. Squares indicate males, circles indicate females. Filled squares show paragangliomas, filled circles show bilateral paragangliomas.
Больной 35 лет (см. рис., II ,10), поступил в клинику ОНЦ в 1993 г. с жалобами на опухолевидное образование в области шеи справа, небольшое головокружение и снижение слуха. Образование обнаружил 2 года назад, за это время оно увеличилось до 1,5 см в диаметре.
Из анамнеза: в 25-летнем возрасте (после электротравмы левой руки и левой части лица) обнаружил опухолевидное образование диаметром до 0,5 см на левой половине шеи, которое не беспокоило. Образование удалено хирургическим путем в 26-летнем возрасте в областном онкодиспансере Читы, где был установлен диагноз: доброкачественная опухоль каротидного тельца слева.
Данные клинического и лабораторных исследований — без отклонений от нормы. Хромосомный анализ стимулированных фито-гемагглютинином лимфоцитов периферической крови показал нормальный кариотип 46(ХУ) с отсутствием делеции как на 13-й, так и на 11-й хромосоме. Во время хирургического удаления обнаружено, что опухоль размером до 1,2+ 1,9 см располагается кпереди от бифуркации общей сонной артерии. Далее на 2,5 см ниже и позади яремной вены располагается еще одно образование размером до
1,7+ 2,4 см. Все образования удалены без осложнений. Гистологическое исследование выявило альвеолярный вариант доброкачественной опухоли параганглиев.
По-видимому, у больного имеется опухоль, включающая вестибулярный аппарат, вызывающая понижение слуха и головокружение, но биопсию не проводили. В удовлетворительном состоянии выписан с диагнозом: первично-множественная билатеральная пара-ганглиома каротидного тельца и левосторонняя вагальная параган-глиома. Отдаленные результаты не прослежены.
Больная 48 лет (см. рис. II, 4), сестра больного, описанного выше, поступила в клинику ОНЦ в 1994 г. с жалобами на опухолевидное образование на шее слева, наблюдаемое ею в течение последних 2 лет и к моменту поступления в клинику достигшее размеров
1 ± 1,5 см. Субъективными ощущениями, связанными с опухолью, были периодически возникающая головная боль и небольшая деформация шеи. Из анамнеза: в 35-летнем возрасте обнаружила образование на правой половине шеи. В течение 11 лет оно медленно увеличивалось и достигло 2 см в диаметре, стало деформировать
History abstract: after an electrical trauma of the left arm and left portion of the face the patient (aged 25 years then) discovered a tumor-like neoplasm not more than 0.5 cm in diameter on the left side of the neck that did not disturb him. The neoplasm was removed surgically at the age of 26 years at the Chita regional cancer center, the diagnosis being a left carotid body benign tumor.
Clinical and laboratory parameters were within the normal range. Chromosome analysis of phytohemagglutinin-stimulated peripheral lymphocytes showed normal karyotype 46(XY) without deletions either in chromosome 13 or 11. The surgery discovered the tumor of 1.2 to 1.9 cm in front of the cephalic artery. There was another neoplasm
I.712.4 cm in size at 2.5 cm below and behind the jugular vein. All the neoplasms were removed without postoperative morbidity. The neoplasms were classified histologically as paraganglial benign tumor of alveolar type.
The patient might have another tumor that interfered with the vestibular apparatus, induced diminishing of hearing and dizziness, no biopsy was performed. The patient was discharged in satisfactory condition, the diagnosis at discharge being primary multiple bilateral carotid body paraganglioma and left vagal paraganglioma. The patients was not followed up.
A patient, female, aged 48, year of birth 1946 (see the figure,
II, 4), a sister of the patient described above was admitted to the CRC clinic in 1994 with a left cervical tumor-like neoplasm discovered two years before and having grown upto 1-1.5 cm in size. Subjective sensations associated with the tumor were periodical headache and mild deformation of the neck. History abstract: the patient discovered the neoplasm on the right side of the neck at the age of 35. During the following 11 years the neoplasm was growing slowly to reach 2 cm in diameter. In 1993 the tumor was excised at the Irkutsk cancer center and classified as left carotid body benign paraganglioma. Concurrent diseases: cholelithiasis first diagnosed in 1992.
Routine laboratory tests were within the normal ranges. Cytogenetic analysis of metaphase chromosomes of peripheral lymphocytes showed (as in her brother) normal karyotype 46 (XX).
Only 3 (11,1,5,6) of 10 children (see the figure) of the family are at present free from tumors.
контуры шеи. В 1993 г. в онкодиспансере Иркутска произведено хирургическое иссечение опухоли, обнаружена доброкачественная параганглиома каротидного тельца слева. Из сопутствующих заболеваний в 1992 г. обнаружена желчнокаменная болезнь.
Рутинные лабораторные анализы были без особенностей. Цитогенетический анализ метафазных хромосом лимфоцитов периферической крови показал (так же, как у брата) нормальный кариотип 46(ХХ).
В семье из 10 детей (см. рис.) только трое (11,1,5,6) к настоящему времени не имели опухоли.
Сестра (11,8), из тройни, в 28-летнем возрасте прооперирована по поводу доброкачественной нефункционирующей опухоли каротидного тельца слева в областном онкодиспансере Читы. Спустя 2 года обнаружила образование на шее справа, обращалась в тот же диспансер, но от операции отказалась из-за операционного осложнения — парализации левой половины лица в результате первой операции.
Брат (11,9), из тройни, умер в 34-летнем возрасте от осложнения — кровотечения во время операции по поводу доброкачественной непродуцирующей опухоли каротидного тельца слева в областном онкодиспансере Читы.
Брат (11,2), 1934 года рождения, в 47-летнем возрасте обнаружил образование на шее справа, спустя 3 года обратился в тот же диспансер Читы, где был установлен диагноз правосторонней параганглиомы области шеи справа, от операции отказался. В настоящее время наблюдается в том же диспансере.
Брат (11,3), 1936 года рождения, в 48 лет обнаружил опухоль на левой половине шеи, которая медленно увеличивалась в размерах, а спустя 8 лет обнаружил образование на шее справа. В том же диспансере Читы установлен диагноз: билатеральная параганглиома области шеи. От операции отказался, находится под диспансерным наблюдением.
Брат (11,7), 1956 года рождения, в 41 год умер на 3-й день после операции по поводу доброкачественной непродуцирующей опухоли каротидного тельца слева в Иркутске.
Отец (1,3), 1919 года рождения, в 42-летнем возрасте обнаружил опухолевидное образование на шее слева, которое к 61 году достигло больших размеров, деформируя шею и периодически затрудняя дыхание. В онкодиспансере Читы был установлен диагноз: непродуцирующая параганглиома шеи слева, проведена лучевая терапия. За
2 года до смерти (в 1982 г.) была обнаружена опухоль на правой половине шеи, операция не проводилась, умер от прогрессирования основного заболевания. Провести клинический осмотр родственников третьего поколения (см. рис., III) из-за отдаленности Читы не представилось возможным.
Из приведенной родословной следует, что заболевание носит семейный характер, поражает два поколения и передается по вертикали от отца к детям. Из всех пораженных сибсов только две представительницы женского пола. Средний возраст развития заболевания 34 года с различной продолжительностью симптомов болезни. 62,5% членов семьи (5 из 8) имеют билатеральное поражение с локализацией в области головы и шеи. Сведений о наличии злокачественных опухолей у членов семьи не было.
Анализ родословной представителей большой семьи позволяет предположить возможность существования наследственного синдрома «множественных семейных параганглиом». Сведения, имеющиеся в литературе, позволяют подтвердить это предположение.
Обсуждение. Параганглиома является относительно редкой опухолью с неизвестной распространенностью. Чаще всего эта опухоль доброкачественная, медленно растущая и редко малигнизирующаяся. Будучи маленькой и медленно растущей опухолью, параганглиомы внутричерепной локализации (области внутреннего и среднего уха) могут давать тяжелые осложнения. Эта опухоль локализуется в основном в области головы и шеи, но, хотя и редко, встречаются сочетания пара-
The triplet sister (11,8) underwent surgery for left carotid body benign nonfunctioning tumor at the Chita cancer center at the age of 28. Two years later she discovered a neoplasm on the right side of the neck, applied to the same center but refused surgery because of previous operational complication as paralysis of the left side of the face.
A triplet brother (1,9) died at the age of 34 from bleeding during surgery for a left carotid body nonproducing benign tumor at the Chita cancer center.
The brother (11,2), born in 1934, discovered a tumor on the right side of the neck at 47 years of age. Three years later the diagnosis of right cervical paraganglioma was made at the same Chita center. The patient refused surgery and is under surveillance at the Chita center.
The brother (11,3), born in 1936, discovered a slowly growing left cervical tumor when aged 48. Eight years later the patients found another tumor at the right side of the neck. The diagnosis of bilateral cervical paraganglioma was made at the Chita cancer center. The patient refused surgery and is presently under surveillance.
The brother (11,7), born in 1956, died at the age of 41 on day
3 following surgery for left carotid body benign nonproducing tumor in Irkutsk.
The father (1,3), bom in 1919, discovered a tumor at the left side of the neck when aged 42, by the age of 61 the tumor had grown significantly, caused deformation of the neck and interfered with breathing. The diagnosis of left cervical nonproducing paraganglioma was made at the Chita cancer center, radiotherapy was undertaken. At 2 years before death (1982) the patient developed a tumor at the right side of the neck, no surgery was performed, the patient died from progression of the principal disease.
No clinical examination was performed of the third generation relatives (see the figure, III) because of the long distance to Chita.
The family tree shows the disease to be familial, to occur in two generations and to be transmitted in a vertical mode from the father to children. There were two females only among the sibs with the disease. Mean age of disease development was 34 years, duration of symptoms being different. 62.5% of the family members had bilateral lesions of the head and neck. There are no records of malignant tumors in the family.
Analysis of the big family tree suggests the presence of a hereditary syndrome of multiple familial paraganglioma. Published data are in favor of this suggestion.
Discussion. Paraganglioma is a rather rare tumor with unknown incidence. Most often it is benign, grows slowly and become malignant in rare cases. Small and slowly growing intracranial (internal and middle ear regions) paragangliomas may give severe complications. The tumor mainly occurs in the head and neck region though there are but rare cases of carotid body paraganglioma in combination with abdominal or thoracic paragangliomas [16]. Tumors of the carotid body are as a rule nonproducing, though there are reports of carotid body paragangliomas accompanied by hormonal disturbance [3,7]. However, some more evidence is needed to decide whether these are functioning paragangliomas or a combination with another catecholamine-producing tumor.
As reported in the literature [9, 17, 20] the rate of familial carotid body paraganglioma ranges from 9.5 to 50%. The main distinction between familial and non-familial paragangliomas is the tendency to multiple tu-morigenesis in which is found in 33 to 53% of familial and 6 to 25% of nonfamilial paraganglioma cases [9, 17, 20]. Familial and bilateral tumor disease is less ma-
Обсуждение. Изучение иммунофенотипа и функциональной роли мембранных молекул клеток С034+-лейкозов привлекает большое внимание в контексте поиска путей регуляции дифференцировки и пролиферации родоначальных лейкозных клеток.
Лейкозные клетки СЛ и нормальные СК достаточно хорошо охарактеризованы иммунофенотипически. Однако функциональная роль экспрессии С038, С071, СЭ7, С034, НЬА-ОЛ и ряда других молекул на СК в отличие от зрелых лимфоцитов все еще остается малоизученной. Одним из распространенных методов оценки функциональной роли молекул мембранных антигенов/рецепторов является их связывание с соответствующим лигандом (в тех случаях, когда он известен) или с МКА [6]. Нами использован метод перекрестного связывания мембранных антигенов ранних гемопоэтичес-ких клеток-предшественников (С034, С038, НЬА-ОЯ, С071, СЭ7) с помощью МКА. Срок культивирования был достаточен для полной интернализации или шед-динга комплексов антиген — МКА, а также для ресинтеза соответствующих молекул.
Функциональные эффекты МКА были многообразны и зависели как от морфоцитохимического варианта лейкоза, так и от иммунофенотипа бластных клеток. Вместе с тем статистически значимые различия на уровне сравнения групп отмечены только для антигена СОЮ. Уровни экспрессии этого маркера достоверно снижались после обработки пре-пре-В-лимфобластов МКА к антигену С038. Это, возможно, одно из ранних проявлений влияния анти-С038 В-лимфоцитопоэз. Известно, что МКА к С038 подавляют рост В-клеток на уровне незрелых СО 1 ^-предшественников [6]
за счет ингибиции синтеза ДНК и индукции апоптоза. Это действие МКА не связано с энзиматической активностью С038. Интересно отметить, что на зрелые В-клетки зародышевых центров и на Т-лимфоциты МКА к С038 действуют совершенно иначе: активация и блокада апоптоза соответственно [5, 16]. Следовательно, даже на клетки одной гемопоэтической линии, находящиеся на разных стадиях созревания, воздействие МКА к определенному дифференцировочному антигену может быть прямо противоположным. Это многообразие эффектов находит свое отражение и при изучении вариантов ОЛ, различающихся по иммунофенотипу.
Существуют как различия, так и ряд общих свойств нормальных гемопоэтических СК периферической крови, костного мозга и пуповинной крови [14].
Экспрессия СОЭ4 характерна не только для гемопоэтических, но и для стромальных предшественников, частота которых довольно низкая в пределах С034+ -пула с иммунофенотипом С034+ С038-НЬА-0Я- [15]. На следующем этапе дифференцировки появляется молекула НЬА-ОЯ, а далее — ¿038 [15]. Клетки начинают экспрессировать незрелые лимфоидные антигены, резко возрастают уровни С045, причем до 30% из них имеет одновременно маркеры миелоидного ряда [11]. В ходе дальнейшей дифференцировки (миелоидной или лимфоидной) нарастают черты одной клеточной линии,
Basing on the knowledge of SC differentiation sequence in normal ontogenety (CD34+Ia~ CD38" lin~ O ^ CD34+Ia+CD38 - lin~ <=> CD34+la+/-CD38+/-lin+) we distinguished the following SC immunological subvariants:
Stem-1: CD34+ la- CD38- lin~ (1 case)
Stem-2: CD34+ Ia+ CD38- lin~ (2 cases)
Stem-3: CD34+ Ia+/- CD38+ lin~ (2 cases)
Stem-4: CD34+ Ia+/~ CD38+ with different lineage markers (28 cases)
Stem-5: CD34+ Ia+/~CD38+/~ unilineage (37 cases)
Frequency of true SC (Stem 1-3), i.e. leukemias free from any line-specific markers (even CD7) was extremely low (2.3%, 5/222). All these cases were assessed morphocytochemically as ALL. Stem-1 ALL was diagnosed in 1 patient only. Blasts in this case failed to express even CD50 (ICAM-3) whose appearance is associated with hemopoietic differentiation.
High frequency of leukemias with different lineage markers (40%, 28/70) in the SC group is of much scientific interest. We refer the term ’leukemias with different lineage markers’ to CD34+ leukemias only because coexpression of markers of different hemopietic lineages may occur at the level of stem cells. This group includes the following cases: 23 cases with expression of myeloid antigens, i. e. 4 T-ALL, 2 pro-B ALL, 17 pre-pre-B ALL (inclusive of 1 CD7+) and 1 pre-pre-B BC CML; 1 pre-pre-B CD7+; 2 AML CD7+; 1 BC CML (Ml) CD7+; 1 AML CD10+.
Discussion. Study of immunophenotype and functional role of membrane molecule of CD34+-leukemic cells is in the focus of attention in search for ways of regulation of differentiation and proliferation of leukemic progenitor cells.
Leukemic cells in SL and normal SC are rather well characterised immunophenotypically. While functional role of expression of CD38, CD71, CD7, CD34, HLA-DR and some other molecules on SC, unlike mature lymphocytes, is not clear yet. One of the common methods of evaluation of the functional role of membrane antigen/receptor molecules is their binding with a relevant ligand (if known) or with MAb [6]. We applied the method of cross-ligation of membrane antigens of early hemopoietic precursors (CD34, CD38, HLA-DR, CD71, CD7) using MAb. The culture time was sufficient for complete internalization or shedding of the antigen/MAb complexes as well as for molecule re-synthesis.
The MAb functional effects were diverse and depended both on leukemia morphocytochemical type and on blast cell immunophenotype. Although statistically significant differences were observed for CD 10 only. This marker expression decreased significantly after treatment of pre-pre-B lymphoblasts with MAb to CD38. This may be an early effect of anti-CD38 on B-lym-phocytopoiesis. Anti-CD38 MAb are known to suppress B-cell growth at the stage of immature slg-CD19+ pro-
появляются маркеры поздних стадий дифференцировки, а антигены несвойственной линии утрачиваются [11]. Плюрипотентные стволовые гемопоэтические клетки (CD34+ HLA-DR+ CD38) дают рост как миелоидных, так и лимфоидных колоний. Кроме того, известна ассоциация экспрессии CD34 с CD38, HLA-DR, Thy-1, CD71, CD50, CD13, CD33, CD19, CD10, CD7 [7, 15]. Функциональная роль большинства этих молекул на ранних гемопоэтических предшественниках остается малоизученной.
Нами предпринята попытка выделения группы CJI, сопоставления их фенотипических особенностей с HCJ1, а также оценки функциональной роли блокады ряда мембранных молекул. С этой целью отобраны 70 случаев CJI из 222 случаев острых лейкозов, подробно изученных иммунофенотипически.
Экспрессия CD34 при OJ1 ассоциировала, как и на нормальных СК, с миелоидными антигенами CD13, CD33, ранним В-клеточным антигеном CD 10, трансмембранного гликопротеина CD38, а также CD22, что соответствует данным других авторов [2, 9]. Подобная ассоциация заключалась в существовании корреляционных связей, более высоких уровнях экспрессии антигенов CD13, CD33, CD10, CD22, CD38, а также в большей частоте CD13+ и СОЗЗ+-случаев при СЛ.
Углубленный анализ структуры СЛ показал, что частота различных типов CD34+ ОЛ в известной степени соответствует пропорции соответствующих клеточных типов среди нормальных СК. Так, выявлено только 5 из 70 СЛ, не имеющих маркеров линейной принадлежности (7,1%)- Причем лишь у 1 (1,4%) больного отмечен редкий в норме фенотип CD34+CD38-HLA-DR'. При отсутствии экспрессии CD50 этот тип СК может давать рост негемопоэтических колоний [15]. Интересно отметить, что описываемое нами наблюдение (обозначено как вариант Stem-1) было CD50 Отсутствие маркеров линейной принадлежности наблюдается и в популяции СК (HLA-DR+ CD38-), способных дифференцироваться как по миелоидному, так и по лимфоидному пути [12]. Подобный фенотип (Stem-2) установлен нами у 2 (2,8%>) больных. Таким образом, общее число CD34+ CD38~ lin~ ОЛ (3/70; 4,3%) соответствует пропорции этих клеток в пуле СК нормального костного мозга и пуповинной крови [10]. В ходе дальнейшей дифференцировки клетки приобретают CD38 (Stem-3; 2 наблюдения).
Совокупность CD34 + Ип' ОЛ (Stem 1—3) можно назвать «истинными» СЛ, при которых злокачественные СК полностью утрачивают способность к диффе-ренцировке по той или иной гемопоэтической линии. Предложены различные названия для этой группы ОЛ: стволовоклеточные, примитивные и т. д. [1, 3]. Однако детальной характеристики этой группы ОЛ не проводилось. В работе [3] описаны 7 случаев СЛ, все были CD34+HLA-DR+, авторы учитывали даже низкое ( 11 %) содержание СК в популяции бластов.
Почти половину случаев СЛ (40%) составляли линейно разномаркерные ОЛ, причем 23 из 28 случаев
genitors [6] due to DNA synthesis inhibition and apop-tosis induction. This MAb effect is not associated with CD38 enzymatic activity. It is of interest that anti-CD38 MAb’s action on mature B-cells of germ centers and T-lymphocytes is absolutely different: the antibody activates and blocks apoptosis, respectively [5,16]. Therefore the effects of MAb to certain differentiation antigens even on cells of the same hemopoietic lineage but of different maturation phases may be absolutely contrary. This variety of the effects is also seen in study of AL with different immunophenotypes.
There are both distinctive and common features in normal hemopoietic SC from peripheral blood, bone marrow and umbilical cord blood [14].
Expression of CD34 is characteristic both for hemopoietic and stromal precursors whose frequency is rather low: within the CD34+ pool of CD34+ CD38-HLA-DR* immunophenotype [15]. HLA-DR and, further, CD38 molecules appear at the next differentiation stage [15]. The cells begin to express immature lymphoid antigens, CD45 contents rise sharply, and upto 30% of the cells simultaneously bear markers of the myeloid series [11]. As the (myeloid or lymphoid) differentiation progresses, distinctions of one of the cellular lineages become more noticeable, markers of later differentiation stages come into sight while antigens of the other lineage disappear [11]. Pluripotent stem hemopoietic cells (CD34+ HLA-DR+ CD38") give rise both to myeloid and lymphoid colonies. Besides, expression of CD34 is known to associate with CD38, HLA-DR, Thy-1, CD71, CD50, CD13, CD33, CD19, CD10, CD7 [7,15]. Functional role of most of these molecules on early hemopoietic precursors is yet unknown.
We attampted to distinguish a group of SL, to compare its phenotypic characteristics with those of NSL and to evaluate functional role of block of some membrane molecules. For this purpose we selected 70 SL cases out of 222 acute leukemia cases whose immunophenotype was known in detail.
Like on normal cells expression of CD34 in AL associated with myeloid antigens CD13, CD33, early B-cell antigen CD10, transmembrane glycoprotein CD38 as well as with CD22 which is in accordance with other publications [2, 9]. The association manifested itself as correlation, greater expression of CD13, CD33, CD10, CD22, CD38 and higher frequency of CD13+, CD33+ SL.
A profound analysis of SL structure demonstrated that the frequency of different CD34+ AL types was to a certain degree similar to proportion of corresponding cell types among normal SC. For instance, there were only 5 (7.1%) of the 70 SL free from lineage markers. And there was 1 (1.4%) patient only with CD34+ CD38-HLA-DR' phenotype rarely encountered in normal individuals. In the absence of CD50 expression this stem cell type may give rise to non-hemopoietic colonies [15]. Of note that this case (marked as Stem-1) was CD50~. The absence of lineage markers was also observed in the SC (HLA-DR+ CD38-) with a capacity to differentiate following both the myeloid and lymphoid lines [12].
были представлены ОЛЛ с экспрессией миелоидных антигенов (CD13, CD33, CD15, CDllb). Это соответствует нормальному этапу дифференцировки СК с возрастанием уровней CD45, появлением ранних лимфоидных антигенов, до 30% клеток коэкспрессируют миелоантигены [11]. Доминирующим типом линейной разномаркерности при СЛ, так же как и в норме, является сочетание В-линейных и миелоидных антигенов (20 из 23). На последующих этапах созревания экспрессия CD34 сохраняется на клетках, имеющих уни-линейные характеристики и утративших маркеры несвойственных линий (миелоидной или лимфоидной). Это была доминирующая группа (37 случаев; 53%) в пределах СЛ. Следовательно, структура СЛ в известной степени соответствует структуре нормальных СК: чем реже тот или иной тип встречается в норме, тем реже он становится мишенью лейкозной трансформации. В лейкозологии данное положение соблюдается далеко не всегда: например, пре-пре-В (CD10+ir Ц~) клетки составляют доли процента в пределах В-лимфоцитов у детей, но 70—80% детского ОЛЛ иммунофенотипически соответствуют этим клеткам («общий» подвариант).
Проведенное исследование позволило установить регуляторную роль молекулы CD38 на ранних этапах дифференцировки В-клеток (пре-пре-В-лимфобласты), а также ассоциацию экспрессии CD34 при СЛ с ранними миелоидными (CD13, CD33), В-клеточными (CD10, CD22) и линейно не рестриктированными (CD38) молекулами.
Работа выполнена при финансовой поддержке МНФ и правительства РФ по гранту «Regulatory role of differentiation antigens of early precursors of human hemopoietic cells».
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Барышников А. Ю., Туркина А. Г., Моисеенкова И. В. и др.//Тер. арх,—1995,— Т. 67, № 7.— С. 44—47.
2. Borowitz М. J., Shuster J. /, Civin C. /. et al. // J. clin. Oncol. — 1990. — Vol. 8, —P. 1389— 1394.
3. Brito-Babapulle F., Pullon H., Layton D. M. et at. // Br. J. Haemat. — 1990, — Vol. 76, N 2. — P. 210— 214.
4. Frenkel M. A., Tupitsyn N. N., Protasova A. K. et al. // Ibid. —
1994.—Vol. 87.— P. 708— 714.
5. Funaro A., Spa gnoli G. C., Ausiello C. M. et al. //J. Immunol. — 1990.— Vol. 145, N 8,— P. 2390—2396.
6. Kumagai M., Coustan-Smith E„ Murray D. J. et al. // J. exp. Med. — 1995. — Vol. 181, N 3. — P. 1101—1110.
7. Lamkin Т., Brooks J., Annett G. et al.//Leukemia. — 1994. — Vol. 8, N 11, —P. 1871— 1878.
8. Olwens J., Lund-Johansen F., Terstappen L. W. II Blood.—
1995,—Vol. 85, N 9. —P. 2402—2413.
9. Pui C. N.. Behm F., Crist W. M. //Ibid. — 1993. — Vol. 82, N 2.— P. 343—362.
10. Steen R., Tjonnfjord G. E., Egeland T.Hi. Haemat.— 1994.— N 3—4.— P. 253.
11. Syrjala M., Ruuti Т., Jansson S. E. II Br. J. Haemat. — 1994. — Vol. 88, N 4.— P. 679—684.
12. Terstappen L. IV., Huang ¿'.//Blood Cells. — 1994. — Vol. 20, N 1— P. 45—61.
This phenotype (Stem-2) was encountered in 2 (2.8%) patients. Thus, the total of CD34+ CD38~ lin' AL (3/70, 4.3%) corresponded to the proportion of these cells in SC pools of normal bone marrow and of umbilical cord blood [10]. As the differentiation proceeds the cells acquire CD38 (Stem-3; 2 cases).
CD34+ lin- AL (Stem 1-3) may be termed “true” SL in which malignant SC lose completely the ability to differentiate following either hemopoietic line. There are different terms proposed to characterize this AL group, such as stem-cell, primitive, etc. [1,3]. However, no comprehensive characterization of this AL group has been yet made. In publication [3] the authors described 7 SL cases with even low (11%) SC contents in blast population being recorded, and all of the cases were CD34+ HLA-DR+.
About half (40%) the SL cases had different lineage markers, and 23 of 28 cases were ALL demonstrating expression of myeloid antigens (CD13, CD33, CD15, CDllb). This is similar to the SC normal differentiation stage characterized by increase in CD45, appearance of early lymphoid antigens and coexpression of myeloan-tigens on upto 30%) of the cells [11]. Combination of B-lineage and myeloid antigens (20 of 23) is dominating among SL with different lineage markers like in normal individuals. As the maturation proceeds the CD34 continues to be expressed on cells with unilinear chracteristics that have lost markers of the other (myeloid or lymphoid) lineages. This group was dominating (37 cases; 53%>) within the SL cases. Therefore, SL structure is to a certain extent similar to that of normal SC: the lower frequency of this or that type in normal individuals the lower frequency of its leukemic transformation. Though this regularity is not common for all leukemia types, for instance, pre-pre-B (CD10+ cr |r) cells reach less than one per cent of B-lymphocytes in children while 70%) to 80% of pediatric ALL correspond in terms of immunophenotype to these cells (“common” subvariant).
Our study discovered the regulatory role of the CD38 molecule at early stages of B-cell differentiation (pre-pre-B-lymphoblasts), as well as association of CD34 expression with early myeloid (CD 13, CD33), B-cell (CD 10, CD22) and non-line restricted (CD38) molecules in SL.
This investigation was supported by the ISF and RF Government, grant “Regulatory role of differentiation antigens of early precursors of human hemopoietic cells”.
13. Tupitsyn N. N., Mechetner E. B., Baryshnikov A. Yu. et al. // Int. J. Cancer. — 1989.—Vol. 44.— P. 589—592.
14. Van Epps D. E., Bender J., Lee W. et al. // Blood Cells. —
1994.—Vol. 20, N 2—3, —P. 411—423.
15. Walter E. K., Olwens J., Lund-Johansen F. et al.//Blood.—
1995. —Vol. 85, N 9, —P. 2422—2435.
16. Zupo S., Pugari E., Dono M. et al. //Eur. J. Immunol. — 1994. — Vol. 24, N 5.—P. 1218—1222.
Поступила 09.11.95 / Submitted 09.11.95
