CC BY
25
О Коллектив авторов, 1994 УДК 612.112.94.017.1.014.467
Е. А. Фролова, А. Ю. Барышников, М. А. Френкель,
Н. Б. Лебедева, В. А. Боценовский, А. Б. Сыркин
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА 1СО-115 К АНТИГЕНУ СЭ34 ЧЕЛОВЕКА
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей,
НИИ клинической онкологии
В 1984 г. С. I. Стп и соавт. описали моноклональные антитела (МКА) Му 10, реагирующие с высокогли-козилированным трансмембранным белком с молекулярной массой 107—120 кД, который селективно экспрессирован на незрелых гемопоэтических клетках-предшественниках человека [11]. Позднее были описаны несколько других МКА сходной реактивности, которые сформировали кластер дифференцировочных антигенов СШ4 [5].
Антиген С034 экспрессирует только 1% мононук-леарных клеток нормального костного мозга человека [10, 14]. Популяция СБ34+ клеток костного мозга не является гомогенной. Среди них найдены примитивные мультипотентные предшественники (СВ34+ ТЬу1+), более дифференцированные предшественники, характеризующиеся приобретением антигенов СБ38 и НЬА-ЭЯ, а также коммитированные предшественники, экспрессирующие маркеры ранней лимфоидной и миело-идной дифференцировки [6, 9, 16]. В нормальных тканях человека СВ34 экспрессирован только на эндотелии капилляров. Антиген выявляется на бластных клетках больных острым нелимфобластным лейкозом (ОНЛЛ), острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), бластным кризом хронического миелолейкоза (БК ХМЛ) [4, 13].
Целью данной работы явилось получение отечественных МКА к антигену СБ34, пригодных для иммунофено-типирования лейкозов и солидных опухолей человека.
Материалы и методы. МКА 1СО-115 были получены при слиянии клеток миеломы PЗX63Ag8. 653 с клетками селезенки мыши, иммунизированной клетками перевиваемой клеточной линии КС 1 а. В качестве МКА использовали супернатант клеточной культуры в разведении 1:10 и асцитическую жидкость мышей-носителей гибридомы в разведении 1:100. Тестирование МКА 1СО-115 проводили с использованием трех методов (проточная цитометрия на фитофлуориметре РАСЗсап [3]; люминесцентная микроскопия окрашенных МКА кри-остатных срезов опухолей человека [1]; иммуноферментный метод АРАР на мазках крови и костного мозга [2]). Исследование реактивности МКА 1СО-115 с клетками больных проводили в сравнении с панелью МКА к различным дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека. Положительной считалась реакция МКА с более чем 10% бластных клеток.
Результаты и обсуждение. Тестирование сравниваемых МКА на клетках больных гемобластозами показало, что процент антигенположительных клеток, выявляемых МКА 1СО-115, был близок значениям, полученным при использовании контрольных анти-СВ34 МКА МуЮ (табл. 1). При окрашивании клеток больных БК ХМЛ МКА 1СО-115 и МуЮ обнаружили также сходство профилей флуоресценции клеток, окрашенных сравниваемыми МКА (рис. 1).
МКА 1СО-115 не реагировали с лимфоцитами, гра-нулоцитами, моноцитами, тромбоцитами и эритроцитами периферической крови всех 18 тестированных здо-
А /А
Л Л М /Л АД /л
/ \ А -Л / V _л
А.
Рис. 1. Профили иммунофлуоресценции клеток крови 5 больных БК ХМЛ, окрашенных МКА 1СО-115 и МуЮ против антигена С034 человека.
ровых доноров, а также клетками перевиваемых клеточных линий, за исключением СОЭ4+ линии КО 1а. МКА 1СО-115 и МуЮ выявляли 0,9% клеток нормаль-
Таблица 1 . Реактивность МКА 1СО-115 и МуЮ с клетками больных лейкозами
Диагноз Бластоз, % 1СО-115, % МуЮ, %
ХМЛ БК 75 45,2 51,7
ХМЛ БК Н. д.* 5,2 19,7
ХМЛ БК 66 7,8 12,5
ХМЛ БК Н.д. 14,1 23,7
ХМЛ БК 46 12,2 14,5
ХМЛ БК 50 7,3 0,1
ХМЛ БК 26 26,7 31,5
ХМЛ БК 44 79,1 81,2
ХМЛ БК 82 55,4 54,9
ХМЛ БК 40 21,2 20,4
ХМЛ БК 27 36,5 46,1
ХМЛ БК 25 21,2 20,4
ОЛЛ 74 31,2 17,2
ОМЛ Н.д. 23,6 49,4
ОММЛ 50 21,9 40,1
* —Нет данных.
Таблица 2. Частота экспрессии дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека у больных БК ХМЛ
Маркер Количество положительных случаев Количество тестирован- ных больных Частота экспрессии антигена, % Процент антигенполо- жительных клеток
СВ34 20 26 76,9 33+/-1
СОЮ 12 26 46,1 48+/-2
НЬА-ЭЯ 20 26 76,9 35+/-2
С019 10 26 38,4 43+/-2
СЭ22 2 24 8,3 19+/-1
СЭ15 8 26 30,7 29+1-1
СОПЬ 8 18 44,4 22+1-2
СЭ14 4 18 22,2 19+/-5
СЭ13 6 9 66,6 42+/-Ю
НАЕ-9 9 19 47,4 22+1-5
ного костного мозга. Анализ этой реакции с использованием программы Ра1Ш-а-Са1е показал, что 1СО-115+ клетки, как и Му10+ клетки, располагались по характеру светорассеяния в области локализации наиболее ранних плюрипотентных клеток-предшественников [10].
Обработка клеток больных БК ХМЛ насыщающей концентрацией МКА Му 10 блокировала присоединение к этим клеткам меченных биотином МКА 1СО-115. В то же время МКА Му32 против СБ13 не обладали этим свойством. Исходя из приведенных выше данных, мы сделали вывод о направленности МКА 1СО-115 к антигену СБ34 человека.
Методом проточной цитометрии изучали экспрессию антигена, определяемого МКА 1СО-115, а также других маркеров дифференцировки клеток у 26 больных БК ХМЛ в момент постановки диагноза (табл. 2). У всех больных количество бластных клеток превышало 40%.
Антиген СБ34, наряду с НЬЛ-БЯ антигенами, являлся наиболее часто встречающимся антигеном бластных клеток ХМЛ, что подтверждало вывод РЛ. Г1а1кош и соавт. [12] о поражении гемопоэза при ХМЛ на уровне стволовой клетки и данные Б. ВапауаН и соавт., обнаруживших экспрессию антигена С034 у 27—97% больных БК ХМЛ [4].
У 10 больных ХМЛ проводили исследования по изучению динамики экспрессии антигена С034 на бластных клетках по мере лечения больных, как правило, у тех больных, в крови которых СВ34+ клетки циркулировали в момент диагноза, падение бластоза в результате циторедуктивной терапии шло параллельно со снижением количества СЭ34+ клеток. Вместе с тем нарастание бластоза при прогрессировании заболевания у больных, резистентных к химиотерапии, сопровождалось и ростом пула СБ34+ клеток. Очевидно, преимущественный рост этих бластов являлся результатом их меньшей чувствительности к воздействию химиотерапии.
При помощи метода иммуноферментного окрашивания изучали экспрессию маркеров дифференцировки гемопоэтических клеток человека у больных ОНЛЛ, ОЛЛ, волосатоклеточным лейкозом (ВКЛ), хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) и пролимфоцитарной лим-фосаркомой (ПЛСА) (табл. 3).
Таблица 3. Реактивность МКА ІСО-115 с клетками больных лейкозами
Диагноз Количество положительных случаев Количество тестированных больных Частота экспрессии антигена, % Процент С034+ клеток
ОНЛЛ 3 11 27,3 39+/-25
ОЛЛ 6 7 85,7 11+/-1
ВКЛ 2 5 40,0 18+/-2
ХЛЛ 2 4 50,0 27+/-15
ПЛСА 6 10 60,0 25+/-1
При исследовании больных ОНЛЛ антиген был обнаружен в 27% случаев, при этом не было выявлено соответствия экспрессии С034-антигена с вариантом лейкоза, по РАВ-классификации, такими цитохимическими маркерами, как результат исследования на пероксидазу, липиды, неспецифическую эстеразу и РАБ-реакцию, а также с экспрессией СЭ11Ь, СЮ 13, СІ) 14, СО 15, СЮ7, СІЗЗЗ и НЬЛ-БЯ антигенов.
Антиген был выявлен у 3 из 3 больных пре-В-ОЛЛ и у 2 из 4 больных Т-ОЛЛ. Не было обнаружено взаимозависимости с вариантом лейкоза, по РАВ-классификации. Эти данные согласуются с другими литературными данными [7,8,13] и позволяют предположить, что у ряда больных ОННЛ и ОЛЛ поражение гемопоэза затрагивает наименее зрелые С034+ клетки.
В литературе не описаны случаи СБ34+ ХЛЛ. Методом иммуноферментного окрашивания мы обнаружили СБ34+ случаи ХЛЛ. Методом проточной цитометрии мы также выявили антиген С034 у 3 из 6 исследованных больных, при этом наряду с МКА ІСО-115 использовались контрольные МКА Му 10. Этот феномен требует дальнейшего изучения.
МКА ІСО-115 тестировали на криостатных срезах некоторых солидных опухолей человека различного происхождения и локализации (табл. 4). МКА ІСО-115 не связывались ни с одним типом исследованных опухолей.
Таблица 4. Реактивность МКА ІСО-115 с солидными
опухолями человека
Тип солидной Количество Количество
опухоли тестированных случаев ІСО-115+ случаев
Меланома 4 0
Остеосаркома 1 0
Рак мочевого пузыря 3 0
Л имфогранулема-тоз 1 0
Нефробластома 1 0
Рак матки 4 0
Рак желудка 2 0
Нейробластома за-брюшинного пространства 6 0
Злокачественный гистиоцитоз 1 0
Таким образом, были получены и охарактеризованы МКА 1СО-115 к антигену СЮ34 человека и с их помощью изучена экспрессия антигена СЭ34 у больных злокачественными новообразованиями. Эти МКА являются необходимым инструментом при иммунодиагностике гемобластозов для мониторинга химиотерапии пациентов с лейкозами. Кроме того, перспективным является применение этих МКА при аутотрансплантациях костного мозга онкологических пациентов, в том числе для положительной селекции клеток-предше-ственников, используемых при трансплантации и для оценки «минимального остаточного заболевания», т.е. остающихся после трансплантации злокачественных клеток.
ЛИ ТЕ Р А ТУРА
1. Зикиряходжаев Д. 3., Тупицын Н. Н„ Барышников А. Ю., Блинов В. М. II Эксперим. онкол. — 1987.—Т. 9.—№ 4.— С. 62—65.
2. Френкель М. А., Лебедева Н. Б., Соловьева Е. Л. // Эксперим. онкол. — 1991. — Т. 13. — №4. —С. 48—51.
3. Фролова Е. А., Барышников А. Ю., Моисеенкова И. К. и др. // Ге-матол. и трансфузиол. — 1992. —№ 5. —С. 6—10.
4. Bamvali Sh, Silverstri F., Hutette В. et al. // Leukemia Res. — 1991. — Vol. 15. — № 7. — P. 603—608.
5. Batinic !)., Tindle R., Bobah D. et al // Leukemia Res. — 1990. — Vol. 13, —N 1— P. 83—85.
6. Baum С. М., Weissman I. L., Tsukamoto A. S. et al // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1992. — Vol. 89. — P. 2804—2808.
7. Borowitz M. J., Gosserman J. P., Moore J. O. et al // Amer. J. Clin. Pathol. — 1989. — Vol. 91. — P. 265.
8. Borowitz M. J., Shuster J. J., Civin С. I. et al. // J. Clin. Oncol. — 1990.— Vol. 8.— P. 1389.
9. Briddel R. A., Broudy V. C., Bruno E. et al. // Blood. — 1992. — Vol. 79. — N 12.— P. 3159—3167.
10. Civin C. /., Banquerigo M. L., Strauss L. C. et al. // Experim. Hematology. — 1987. — Vol. 15. — P. 10—17.
11. Civin С. I., Strauss L. C., Brocall C. et al. // J. Immunol. — 1984. — Vol. 133.— P. 157—165.
12. Fialkow P. J., Jacobson R. J., Papayanopoulou T. II Am. J. Med. — 1977.— Vol. 63.— P. 125—129.
13. Geller R.B., Zahurac М., Hurwitz C. A. et al. // Brit. J. of Haemo-tology. — 1990. — Vol. 76. — P. 340—347.
14. Loken M. R., Shah V. O., Dattilio K. L., Civin С. I. II Blood. —
1987. — Vol. 79. — N 5. — P. 1316—1324.
15. Pechel С. H., Koller V. II Leucocyte Typing IY: White Cell Differentiation Antigens.—Oxford University Press. — 1989.— P. 817—818.
16. Terstappen L., Huang S., Safford M. et al. // Blood. — 1991.— Vol. 77. — N 6.— P. 1218—1227.
17. Vaughan W. P., Civin C. /., Weisenburger D. D. et al. // Leukemia. —
1988.— Vol. 2.— P. 661.
Поступила 20.04.93
Pharmacia
Kabi-Farmitalia Carlo Erba v J
© Коллектив авторов, 1994 УДК 575.1:559.324.4
Б. 77. Копнин, О. С. Кременецкая, В. С. Осовская,
77. М. Чумаков
ВВЕДЕНИЕ ГЕНА р53 С МУТАЦИЕЙ В КОДОНЕ 273 И УВЕЛИЧЕНИЕ ЗАВИСИМОСТИ ЛЕИКОЗНЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ К562 ОТ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ СЫВОРОТКИ И КОНДИЦИОНИРОВАННОЙ СРЕДЫ
НИИ канцерогенеза, Институт молекулярной биологии РАН
Известно, что р53 — ядерный фосфобелок, обладающий способностью модулировать транскрипцию многих генов, — играет ключевую роль в негативном контроле клеточной пролиферации [10, 11, 17]. Мутации гена р53 являются наиболее частым, из известных к настоящему времени, изменением генома в различных новообразованиях человека [6, 10, 16]. Они обнаруживаются в разных его участках, но чаще всего в 4 консервативных доменах (аминокислоты 117—142, 171—181, 234—258, 270—286), особенно часто в кодонах 175, 248 и 273 [6, 10]. Мутантный р53 способен взаимодействовать с продуктом неповрежденного аллеля и образовывать комплекс с ингибированной функцией (так называемый доминантно-негативный эффект) [11, 15, 17]. Показано, что нарушения нормальной функции р53 ведут к инактивации его антипролиферативных свойств, отменяя, в частности, способность вызывать остановку в 0,-фазе клеточного цикла [9, 16, 17]. Ряд данных свидетельствует, однако, в пользу того, что изменения р53, вызванные некоторыми мутациями, могут сопровождаться не только утратой его рост-супресси-рующих свойств, но и приобретением каких-то новых (доминантных) функций, способствующих процессу злокачественной трансформации клеток [10, 16].
При хроническом миелоидном лейкозе (ХМЛ) спектр изменений гена р53 отличается от наблюдаемого при большинстве других форм опухолей. При ХМЛ, как, впрочем, и при остеосаркоме, часто обнаруживаются крупные перестройки в области 1-го интрона или нонсенс-мутации, приводящие к синтезу укороченного полипептида [2, 4, 8, 14], тогда как в опухолях эпителиальной природы, как правило, выявляются миссенс-му-тации [6, 10]. Более того, обнаруженные при ХМЛ к настоящему времени миссенс-мутации не содержат ни одного случая замен в 8-м экзоне, в том числе в кодоне 273, являющимся одной из трех «горячих» точек мутаций р53 при других злокачественных новообразованиях [5]. Как известно, мутации в 8-м экзоне в меньшей степени, чем мутации в других консервативных участках гена, изменяют конформацию и другие свойства р53 [10, 11]. В связи с этим возникает предположение, что ряд аминокислотных замен, в частности те, которые несильно изменяют конформацию р53, но достаточные для отмены его рост-супрессиру-ющих свойств во многих типах клеток, являются слишком «мягкими» мутациями для инактивации нормальной функции р53 в миелоидных клетках, находящихся на определенных этажах дифференцировки.
Прямым способом проверки такой возможности является исследование эффектов, вызываемых введением в миелоидные клетки генно-инженерных конструкций,
