CC BY
64
Использование иммунофенотипирования для совершенствования диагностики и прогнозирования результатов терапии острых нелимфобластных лейкозов
И.Г.Маркина, Н.Н.Тупицын, Л.Ю.Андреева Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва
Эффективность лечения больных острыми лейкозами (ОЛ) в первую очередь зависит от своевременно и точно установленного диагноза. Основой диагностики биологически гетерогенной группы ОЛ является морфологический и цитохимический анализ бластных клеток, позволяющий выявить наиболее стойкие, гистогенетически обусловленные энзимохимические отличия родоначальных кроветворных клеток различного происхождения. На основании морфоцитохимических различий лейкозных клеток, согласно критериям РАВ-классификации, предусматривается выделение 3 вариантов острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) и 8 вариантов острого нелимфобластного лейкоза (ОН Л Л) [15]. Однако, современный уровень диагностики гемобласгозов, помимо морфологических и цитохимических исследований, предполагает использование иммунологических методов. В настоящее время им-мунофенотипирование при ОЛ стало неотъемлемым компонентом диагностического процесса. Использование широкой панели диагностических моноклональных антител (мкАТ) позволяет определять совокупность поверхностных и цитоплазматических антигенов злокачественных клеток с целью установления принад лежности этих клеток к определенной линии гемопоэза, а также выявления уровня возникновения патологического клона (т.е. стадию, на которой остановлено их нормальное развитие). При ОЛЛ иммунофенотипические особенности бластных клеток, в большей степени, чем их морфоцитохимические характеристики, коррелируют с рядом важных биологических и клинических параметров опухоли и, поэтому, имеют решающее значение при выборе программы терапии больных [28,36,42]. Иммунологический метод диагностики при ОН Л Л позволяет идентифицировать такие варианты как МО, Мб и М7 [13,29,38, 43], а также помогает проводить дифференциальную диагностику между М1 и М2, М2 и М3, М2 и М4 вариантами. Кроме того, использование иммунофенотипирования дает возможность выявлять гетерогенность в пределах морфоцитохимически однородной популяции лейкозных клеток внутри отдельных РАВ-вариантов, что, несомненно, является существенным для разработки иммуноклассификаций ОНЛЛ, ориентированных на индивидуализацию химиотерапевтических режимов для конкретных иммунологических подгрупп.
В Российском онкологическом научном центре РАМН накоплен достаточно большой опыт по диагностике и лечению ОНЛЛ. У истоков этих работ стоят школы акад. Г. И. Абелева, проф. А.Ю.Барышникова, проф. Н.Н.Тупи-цына. Исследования иммунофенотипа ОНЛЛ базируются на прочном морфо-иммуноцитохимическом фундаменте, критериях РАВ-классификации (этот раздел работ в РОНЦ возглавляет проф. М.А.Френкель). Приводимые нами в статье сведения о взаимосвязи экспрессии тех или иных антигенов с клиническими проявлениями и прогнозом получены совместно с проф. М.А.Волковой (отделение химиотерапии гемобласгозов (рук. - к.м.н. Д.Ш.Осма-нов) РОНЦ РАМН). Именно столь комплексный подход к проблеме позволил установить роль иммунофенотипирования как метода исследования и диагностики ОНЛЛ и рекомендовать широкое видение оценки мембранных маркеров в качестве основы совершенствования лечения этого заболевания. В данной публикации мы попытались представить не только алгоритм иммунодиагностики ОНЛЛ, но и дать характеристику наиболее часто используемых антигенов, а также их ассоциации с определенными биологическими свойствами опухоли и прогнозом заболевания на основании собственных наблюдений и анализа данных зарубежной литературы.
Согласно рекомендациям первой Европейской группы по иммунологической классификации лейкозов (ЕИЬ) [1] исследование бластных клеток при ОНЛЛ должно проводиться в два этапа. На первом этапе необходимо подтвердить миелоидную природу опухолевого клона клеток. Для этого используют наиболее специфичные маркеры миелоидного происхождения (анти-МПО, СО 13, СОЗЗ, ССКубб, СБ117), атакже линейно-неспецифические антигены и антигены, ассоциированные со стволовой клеткой (ТсГГ, СЭ34, НЬА-ОЯ). С целью дифференциальной диагностики с ОЛЛ в панель должны быть включены и наиболее специфичные лимфоидные маркеры, отражающие наиболее ранние стад™ В- и Т-клеточной направленности дифференцировки (СО 19, цитоплазматический С022, СБ79а, СО 10, цитоплазматический СОЗ, С02, СОТ). На втором этапе используется более широкая панель мкАТ с целью более детальной классификации вариантов ОНЛЛ.
В РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН иммунофенотипиро-вание ОЛ проводится в течение примерно 20 лет. Разуме-
ется, на протяжении этого периода панель мкАТ, используемых для иммунодиагностики ОЛ дополнялась и уточнялась с учетом диагностической и прогностической значимости маркеров. Накопленный нами опыт позволил полностью отказаться от алгоритма двух- или трехэтапного иммунофенотипирования по следующим причинам [5]:
1. При диагностике вариант ОЛ не известен и необходимо применение широкой панели мкАТ как к миелоид-ным, так и к лимфоидным антигенам.
2 В обязательном порядке в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН проводится полное цитохимическое исследование [8]. По эти причинам иммунофенотипирование при ОНЛЛ не является главным методом диагностики варианта лейкоза. Диагностическая роль иммунофенотипирования имеет решающее значение при редких вариантах ОНЛЛ -МО, М6иМ7.
3. В зі іачитсльной части случаев ОНЛЛ решающую роль играют не маркеры линейной принадлежности, а стадиеспецифичные и линейно не ресгриктированные антигены.
4. Двух-и трехэтапная постановка реакции технически не удобна для лаборантов, так как им приходится неоднократно обрабатывать один и тот же материал (клетки больного), что требует большего времени и не является оправданным.
Используемая в РОНЦ РАМН панель для диагностики ОНЛЛ приведена в табл. 1 [5].
Представленный перечень не является исчерпывающим, он может быть дополнен другими антигенами. Чем шире набор диагностических мкАТ, тем большая вероятность выявления аномалий опухолевого фенотипа, что может быть использовано в дальнейшем для контроля минимальной резидуальной болезни. Использование широкой панели мкАТ дает возможность установить линейную коммитацию бластов и позволяет более точно охарактеризовать лейкозный клон клеток миелоидного происхождения для выявления определенных закономерностей между различными морфоцитохимическими вариантами ОНЛЛ и уровнями экспрессии ряда антигенов.
Миелоидная направленность бласгных клеток при ОЛ может быть определена по экспрессии двух общемиело-идных антигенов - СО 13 и СОЗЗ. (В последние годы широкое распространение получили исследование СО\у65 и иммунологическое исследование миелопероксидазы, но мы не имеем соответствующего опыта работы с этими маркерами). Оба этих маркера (С013 и СОЗЗ) в нормальной дифференцировке появляются на С034+ клетках после линейно не ограниченных антигенов С038 и НЬА-ОЯ и в дальнейшем присутствуют на всех стадиях дифференци-ровки миелоидных клеток.
Антиген СОЗЗ представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 67кД, кодируемый геном, локализованным в длинном плече 19хромосомы. Имеет лектино-
Таблица 1. Иммунофенотипические маркеры, используемые при диагностике ОНЛЛ.
Антиген Клеточная специфичность
Миеломоноцитарные антигены CDllb CD 13 CD 14 CD15 CD33 Гранулоциты, моноциты, ЕК-клетки Гранулоциты, моноциты со стадии КОЕ-ГМ Моноциты, макрофаги, гранулоциты (слабо) Гранулоциты, моноциты Миелоидные клетки-предшественники, моноциты
Эритроидные антигены НАЕ-3 (гликофорин А) НАЕ-9 (антиген эритробластов) Эритроциты, эритроидные предшественники Ядросодержащие эритроидные клетки
Мегакариоцитарные антигены CD41, CD42, CD61 Тромбоциты, мегакариоциты
Антигены различных линий CD34 CD38 HLA-DR CD10 Стволовые клетки Гемопоэтические клетки-предшественники, активированные В- и Т-клетки, моноциты Гемопоэтические клетки-предшественники, активированные Т-клетки, В-клетки, моноциты/макрофаги В- и Т-клетки предшественники, гранулоциты
В-клеточные антигены CD 19 CD22 CD37 В-клеточные предшественники и В-клетки В-клетки Зрелые В-клетки, низкие уровни экспрессии на некоторых Т-клетках и миелоидных клетках
Т-клеточные антигены CDla CD3 CD2 CD4 CD5 CD7 Кортикальные тимоциты Зрелые Т-клетки Тимоциты, Т-лимфоциты, ЕК-клетки Т-хелперы, моноциты, макрофаги, гранулоциты Тимоциты, зрелые Т-клетки Т-клеточные предшественники и Т-клетки, ЕК-клетки, незрелые клетки миелоидного ряда
вую активность. Антиген экспрессируется на мультипо-тенгных клегках-предшесгвенниках гранулоцигарно-моно-цитарной, эритроидной и мегакариоцитарной линий (КОЕ-ГЭММ), а также на клетках-предшественниках, ком-митированных в грануломоноцитарном (КОЕ-ГМ) и эрит-роидном (БОЕ-Э) направлении (рис. 1). Экспрессия СОЗЗ выявляется в подавляющем большинстве случаев при М1
- М5 ОНЛЛ, реже - при МО, Мб и М7. СОЗЗ-позитивный иммунофенотип коррелирует с 1:( 15; 17) и 1(8;21) [ 11 ], молодым возрастом больных [3,33], отсутствием тромбоци-топении в дебюте заболевания [41] и весьма высокой чувствительностью к проводимой терапии [24].
Костный мозг Периферическая кровь
Рис. 1. Экспрессия антигена СОЗЗ в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток. Здесь и на последующих рисунках обозначения: о - отсутствие антигена на клетках; о _ экспрессия антигена на части клеток; ф - наличие антигена на клетках.
Антиген СЭ13 является гликопротеином с молекулярной массой 150 кД, который в нормальной клеточной диф-ференцировке экспрессируется на поверхности комми-тированных гранулоцитарно-моноцитарных предшественников и на клетках гранулоцитарного и моноцитарного направления всех стадий дифференцировки (рис. 2). Молекула СО 13 идентична аминопептидазе 14, которая известна как мембранная металлопротеаза, участвующая в метаболизме биологически активных пептидов клетками различных типов, включая макрофаги и гранулоциты. Экспрессия антигена С013 наблюдается приблизительно у 60% больных ОНЛЛ. Реакция на СО 13 положительна для 93-100% случаев М1 - М4, несколько реже она встречается при МО и М5 вариантах (67-86%) и не обнаруживается в большинстве случаев Мб и М7 ОНЛЛ. Отсутствие экспрессии СО 13 на поверхности бластных клеток коррелирует с вариантом М2, ассоциированным с г(8;21) [14] и с М5а, ассоциированным с 1(9; 11) [22]. Особенностями СО 13-позитивного иммунофенотипа, по нашим данным, также являются исходный гиперлейкоцитоз (58,8 +/- 3,07 против 23,5 +/- 6,29 тыс./мкл; р = 0,048), гиперклеточность костного мозга (201,4 +/- 57,9 против 106,2 +/-14,43 тыс./ мкл; р = 0,03), низкая общая выживаемость (медиана 5 мес. против 13 мес.; р = 0,06).
Костный мозг Периферическая кровь
Рис. 2. Экспрессия антигена С013 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
Помимо общемиелоидных маркеров, позволяющих подтвердить миелоидную природу лейкоза в 98% случаев
[17], изучаются линейно не рестриктированные антигены лимфоцитов, экспрессия которых в большинстве случаев ОНЛЛ коррелирует с незрелостью клоногенных элементов. В нормальном костном мозге процент клеток, коэкс-прессирующих маркеры различных гемопоэтических линий, невелик, однако этот феномен достаточно часто встречается при гемобластозах. Экспрессия маркеров различных линий кроветворения выявляется в среднем у 35-48% больных ОНЛЛ [12,30,37,48]. В таких случаях вариант заболевания трактуется по-разному в зависимости от того, какие именно «лимфоидные« антигены выявляются на бластных клетках ОНЛЛ. Общим термином, который применим во всей этой группе лейкозов, является термин «острые смешанно-линейные (mixed-lmeage) лейкозы (ОСЛЛ)». Наиболее частой разновидностью ОСЛЛ являются линейно-разномаркерные лейкозы, происходящие из клеток-предшественников, коэкспрессирующих в норме маркеры различных линий [6].
Один из наиболее часто встречающихся лимфоидных маркеров при ОНЛЛ антиген С07 - гликопротеин с молекулярной массой 40 кД, который, кроме клеток Т-ряда, обнаруживается на примитивных гемопоэтических клетках, способных к миелоидной дифференцировке (рис. 3). С07 играет роль в передаче внутриклеточного сигнала для последующего развития, активации и дифференцировки Т-клеток. Связывание мембранных С07 с помощью мкАТ вызывает секрецию цитокинов и изменяет клеточную адгезию. По нашим данным С07 экспрессируется на поверхностной мембране бластных клеток в 28% случаев ОНЛЛ и ассоциируется с МО, М1, М4, М5а и Мб морфоцитохимическими вариантами. Имеются убедительные данные об ассоциации экспрессии антигена С07 с наиболее важными факторами неблагоприятного прогноза - фенотипом множественной лекарственной устойчивости, наличием РЬ-хромосомы, аномалиями 5 и/или 7 хромосомы, а также со сложными нарушениями кариотшТа [48]. Некоторыми авторами также отмечается, что клиническими особенностями С07-позитивных ОНЛЛ являются вовле-
Костный мозг Периферическая кровь
Рис. 3. Экспрессия антигена С07 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
чение в опухолевой процесс центральной нервной системы, высокий лейкоцитоз в дебюте заболевания, гепато-спленомегалия [25]. По данным РОНЦ РАМН отсутствие на бластных клетках антигена С07 коррелирует с более длительной безрецидивной выживаемостью (медиана 15,5 мес. против 5 мес.; р = 0,01), рис. 4. Низкая эффективность стандартной противоопухолевой терапии, по мнению рада зарубежных исследований и нашим данным [2,3,5,30,32, 45], диктует необходимость исходной интенсификации терапии для больных ОНЛЛ с наличием в иммунофенотипе С07-позитивных бластов.
Месяцы
Рис. 4. Безрецидивная выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена С07 на поверхности бластных клеток при использовании цитозар-антрациклиновых программ.
Антиген С04 представляет собой мембранный гликопротеин с молекулярной массой 55кД и является рецептором антигена гистосовмесгимости II класса, а также принимает участие во внутритимической дифференцировке Т-клеток. Помимо экспрессии на Т-клетках, он может присутствовать на мембране гемопоэтических клеток-пред-шественников, находящихся на очень ранних стадиях развития (КОЕ-ГМ, БОЕ-Э, КОЕ-Мег), а также на поверхност-
ных мембранах моноцитов и макрофагов (рис. 5). Процент выявления С04 при ОНЛЛ, по данным разных авторов, колеблется от 13% до 48%. Этот антиген наиболее характерен для МО (57%), М4 (64%) и М5 (83%) вариантов ОНЛЛ [30]. В большинстве случаев данный иммунофенотип обнаруживается у пациентов с наличием аберрации 1Ц23 и коррелирует с низкой выживаемостью [37].
Костный мозг Периферическая кровь
Рис. 5. Экспрессия антигена С04 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
Антиген С02 является гликопротеином с молекулярной массой 50кД, относящимся к суперсемейству иммуноглобулинов. Этот многофункциональный маркер участвует в активации Т-клеток, продукции цитокинов, индукции апоптоза и в регуляции цитолиза, опосредованного Т-лимфоцитами. С02 экспрессируется на ранних стадиях внутритимической дифференцировки Т-клеток и на последующих этапах их развития, а также обнаруживается на ЕК-клетках (рис. 6). По данным разных авторов частота экспрессии этого антигена колеблется от 11% до 21% случаев ОНЛЛ. Наличие С02 наиболее часто наблюдается на поверхности бластных клеток при вариантах М3 (осо-
Костный мозг Периферическая кровь
Рис. 6. Экспрессия антигена С02 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
бенно при МЗу) и М4эоз. Коэкспрессия антигенов С02 и СО 19 является одной из наиболее частых при ОНЛЛ, причем при М3 такая комбинация маркеров отмечается в 2, а при М4эоз - в 8 раз чаще по сравнению с другими вариантами ОНЛЛ [12]. По данным этих же авторов, больные с иммунофенотипом [С02+; СО 19+] имеют достоверно более высокую частоту достижения ремиссии и более длительную 2-х летнюю выживаемость по сравнению с [С02; С019]-негативными пациентами.
АнтигенС019 является мембранным гликопротеином с молекулярной массой 95 кД, который экспрессируется в костном мозге самыми ранними предшественниками В-клеток и на всех последующих стадиях созревания В-лимфоцитов (рис. 7). СО 19 участвует в регуляции развития, активации и дифференцировки В-лимфоцитов. В нашем наблюдении частота экспрессии СО 19 при ОНЛЛ составила 15,5%. Наиболее часто он был выявлен при М1, М2 и М4 вариантах в 15%, 23% и 13% случаях соответственно. При варианте М2 экспрессия антигена СО 19 с высокой степенью вероятности (90%) коррелирует с транслокацией 1(8;21)[31]. По нашим данным прогностическая роль СО 19 реализуется в условиях лечения лейкозов по цитозар-идарубициновой программаме, которая в настоящее время является базисной в отделении химиотерапии гемобластозов РОНЦ РАМН [4].
Костный мозг
Периферическая кровь
Костный мозг
Рис. 8. Экспрессия антигена СОЮ в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
верно большая общая выживаемость больных (медиана 21 мес. против 6 мес.; р = 0,049), рис. 9.
Периферическая кровь ж
Месяцы
Рис. 7. Экспрессия антигена С019 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
Антиген СОЮ - одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой 100 кД, принадлежащий к семейству мембраноассоциированных пептидаз. Он участвует в росте и формировании В-клеток, гидролизе пептидов, влияющих на пролиферацию. Этот маркер выявляется на ранних лимфоидных родоначальных клетках костного мозга и эмбриональной печени, а среди нелимфоидных гемопоэтических клеток - на зрелых нейтрофилах (рис. 8). В нашем наблюдении [3,7] экспрессия антигена СОЮ на лейкеми-ческих бласгах больных с ОНЛЛ отмечалась в 11 (8%) из 137 исследованных случаев, а именно в 13% - при М1, в 8% - при М2 и в 7% - при М3 и при М4 вариантах. Особенностью СО 10-позитивных ОНЛЛ лейкозов явилась высокая частота полных ремиссий (91%) и за счет этого досго-
Рис. 9. Общая выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена СОЮ на поверхности бластных клеток при использовании цитозар-антрацикпиновых программ.
Современный уровень диагностики ОНЛЛ предполагает также использование линейно не ограниченных антигенов, которые помогают установить стадию зрелости бластных клеток, что, в ряде случаев, коррелируют с эффективностью лечения.
Сгволовоклеточный антиген CD34 представляет собой гликозилированный трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой около 110 кД, который экспрессируется только на незрелых клетках-предшественниках ге-мопоэза (рис. 10). Ген CD34 локализован в длинном плече
1 хромосомы. В нормальном костном мозге до 1,5% мо-нонуклеарных клеток являются С034-позитивными, из них только 5% находится в митотическом цикле, а остальные 95% пребывают в фазе покоя (G0). Популяция CD34+ клеток включает в себя все определяемые in vitro гемопоэ-тические колониеобразующие клеточные линии, которые обладают высоким пролиферативным потенциалом и способны полностью восстанавливать гемопоэз. При ОНЛЛ
Костный мозг
Периферическая кровь Костный мозг
Периферическая кровь Эрнтооцит
КОЕ-ГЭМ1
Т-клетка
О
Рис. 10. Экспрессия антигена С034 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
экспрессия СЭ34 наблюдается в среднем в 40% случаев. С наибольшей частотой экспрессия данного антигена обнаруживается при низкодифференцированных вариантах (МО, М1 и М5а) и при М4 и в основном отсутствует при М3 и М5б ОНЛЛ. При М2 ОНЛЛ С034-позитивные блас-ты наблюдаются примерно у 30% больных, особенно в случаях, ассоциированных с транслокацией I (8;21). Опухолевый клон клеток ОНЛЛ, экспрессирующий стволовоклеточный маркер, характеризуется низким уровнем Ю 67 - маркера активного синтеза ДНК [34]. Это свидетельствует о том, что большинство опухолевых клеток находится в фазах 00/01 клеточного цикла и, следовательно, являются слабо уязвимой мишенью для химиопрепаратов, действующих на делящиеся клетки. Это подтверждается и клиническими результатами. По данным большинства исследований [3,10,23,26,27,43], С034-позитивные ОНЛЛ характеризуются более высокой злокачественностью и резистентностью к химиотерапии. Имеются данные об ассоциации антигена С034 с высоким уровнем Ьс1-2
[18] и геном множественной лекарственной устойчивости [35]. Высокие уровни экспрессии С034 наблюдаются у больных пожилого возраста [34], а также при вторичных ОНЛЛ и ОНЛЛ, развившихся на основе миелодиспласти-ческого синдрома [26].
С038 представляет собой интегральный мембранный одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой 46 кД, около 20% которой приходится на долю углеводного компонента. Этот антиген обладает активностью (АЕ)Р)-рибозилциклазы, которая принимает участие в поступлении аденозин 5'-дифосфат-рибозы в клетку и регуляции ее количества, а также ЫАГ)+-гликогидразы. Кроме того, антиген СЭ38 участвует во внутриклеточном обмене кальция. В нормальном костном мозге экспрессия С038 отмечается на 99% С034+ мононуклеарах. Линейная коммита-ция клеток-предшественников различных ростков гемопо-эза ассоциируется со снижением уровня экспрессии С034 и повышением уровня С038. Экспрессия антигена С038 при нормальной клеточной дифференцировке показана на рис. 11. При ОНЛЛ он выявляется в среднем в 61,5% случаев, наиболее часто при вариантах М0-М2, реже - при
Рис. 11. Экспрессия антигена С038 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
М3- М5. Прогностическое значение антигена СЭ38 особенно важно в условиях современных программ химиотерапии ОНЛЛ. По данным ЮНЦ РАМН препаратом выбора в лечении ОНЛЛ по цитозар-антрациклиновым программам должен являться идарубицин. Этот антрацикли-новый антибиотик полностью нивелирует негативное влияние всех клинико-гематологических и морфоцитохимических факторов на прогноз [3]. При этом прогностическое значение иммунологических маркеров бластных клеток резко возрастает. При использовании идарубицина, по сравнению с другими антрациклинами, пациенты с экспрессией СБ38 имели более высокую частоту полной ремиссии (68,2% против 33,3% соответственно), а также безрецидивную (медиана 14 мес. против 5 мес.; р = 0,013) и общую выживаемость (медиана 12 мес. против 1 мес.; р = 0,019), рис. 12.
НЬА-ХЖ антиген, так же как и антиген С038, экспрессируется на гемопоэтических клетках-предшественниках гемопоэза, он обнаруживается и на некоторых последующих стадиях созревания клеток гранулоцитарного, моно-цитарного, мегакариоцитарного и эритровдного направления (рис. 13). Присутствие НЬА-ОЯ антигена характерно для 69% больных ОНЛЛ. НЬА-ВЯ-позитивные бласгы регистрируются в подавляющем большинстве случаев МО,
0 10 20 30 40 50 60 70
Месяцы
Месяцы
Рис. 12. Общая (вверху) и безрецидивная (внизу) выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена С038 на поверхности бластных клеток при использовании идарубицин-цитарабиновой программе терапии.
М1, М5, Мб и М7 ОНЛЛ и у 60-70% пациентов с вариантами М2 и М4. Дифференциально-диагностическое значение имеет отсутствие НЬА-ОЯ антигена при остром про-миелоцитарном лейкозе, что, наряду с морфоцитохимической характеристикой, может учитываться для идентификации группы наиболее дифференцированных грану-лоцитарных лейкозов. Имеются данные о корреляциях между экспрессией данного маркера с экстрамедулляр-ными проявлениями заболевания [21] и с меньшей чувствительностью к противоопухолевой терапии как у детей с ОНЛЛ[7], так и у взрослых [2,16].
Костный мозг
Эритробддст
О
:пск
КОЕ-1
Ретикулоцит
о
Мспийрнобласт Мегїшї^иоцит
" Миелобласт Проыонопит Миелоцит
~ -О----------------О—
-о-
нтроц
-О
КОЕ-М Монобласт Промиелоцит Про-В Пре-прс-В Пре-В
^х-прс-В
лек
>o-i—о—о---------------------а ,
Про-Т {Субкортикальный Кортикальный Медуллярный
! ТИМОЦИТ ТИМОЦИТ ТИМОЦИТ
I
! Тимус
Маркер миелоидных клеток СО 15 является углеводным антигеном лакто-М-фукопентозы III и участвует в клеточной адгезии. Он появляется на стадии бипотентного предшественника и экспрессируется на большинстве незрелых и дифференцированных клеток, включая промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты, палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы и эозинофилы, моноциты, тучные клетки, макрофаги и клетки Лангерганса (рис. 14). На поверхности лейкемических клеток ОНЛЛ СО 15 обнаруживается в 37% случаев. По нашим наблюдениям, наиболее часто экспрессия антигена СО 15 обнаруживается при М2, М3 и М4 и М5б ОНЛЛ, несколько реже - М1 и Мб. Характерной особенностью МО и М7 ОНЛЛ является практически полное отсутствие этого антигена на поверхностных мембранах бластных клеток, поэтому СО 15 можно использовать для дифференциальной диагностики М1 и МО вариантов ОНЛЛ. У больных со специфической транслокацией К8;21) присутствие данного маркера наблюдается практически в 100% случаев [44]. Ряд исследователей указывает на высокую эффективность стандартной цито-зарантрациклиновой терапии для больных, имеющих в иммунофенотипе СО! 5-позитивные бласгные клетки [20,44].
Костный мозг
КОЕ-ГЭМ1
БОЕ-Э
Эритробласт
О
Нериферическая кровь
Эритроцит
Периферическая кровь Эри
Ретикулоцит
о
^ -О-
Мегакариобласт Мегакариоцит
КОЕ-Г Миелоблает Промоношгг Миелоцит ‘ #----------------•----------•—
■О
КОЕ-М Монобласт Промислоцит
NK-клетки
-о
•-В Пре-пре-В Пре-В ! В-клетка
о--------------------о—і—о
ри^оц
Тромбоцит
О
Гранулоцит —#
ОЦИТ
Тромбоцит
О
Гранулоцит
—О
^оцит
NJt-клетки
-О
В-клетка
Про-Т
О
-о
| Субкортикальный Кортикальный Медуллярный
! ТИМОЦИТ ТИМОЦИТ ТИМОЦИТ !
! Тимус |
Т-клетка
-О
Т-клетка
-О
Рис. 13. Экспрессия антигена ША-ОК в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
Панель мкАТ для иммунодиагностики ОНЛЛ включает линейно-специфичные маркеры, характерные для эрит-роидной и мегакариоцитарной направленности, а также стадиеспецифичные маркеры, которые появляются на более поздних стадиях дифференцировки гранулоцитар-ных или моноцитарных клеток.
Рис. 14. Экспрессия антигена CD15 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
CD 14 - одноцепочечный мембранный гликопротеин с молекулярной массой 55 кД - представляет собой маркер специфичный для клеток моноцитарной линии поздних этапов дифференцировки (рис. 15). В ряде случаев имеет место экспрессия данного маркера при гранулоцитарных лейкозах. Являясь высокоафинным рецептором для липо-полисахаридов, мембранная форма CD 14 принимает участие в активации продукции цитокинов (туморнекроти-ческого фактора, интерлекинов 1 и 6), а также, в транспорте липидов. Ген, кодирующий CD14, локализуется на 5 хромосоме в регионе, содержащим множество генов ростовых факторов и рецепторов факторов роста. Экспрессия антигена CD 14 обнаруживается у больных ОНЛЛ в среднем в 32% случаев и коррелирует со снижением уровня гемоглобина в дебюте заболевания [41] и низкой эффективностью современной противоопухолевой терапии [19,21,25].
Костный мозг Периферическая кровь
Рис. 15. Экспрессия антигена С014 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
Наиболее поздний миелоидный антиген С011Ь является рецептором дня СЗЫ-комплемента, фибриногена, гепарина и т.д. Он осуществляет взаимодействие кроветворных клеток с активизированным эндотелием, участвует в дегрануляции, хемотаксисе и фагоцитозе нейтрофилов. МкАТ к антигену СЭ11Ь реагируют с созревающими клетками гранулоцитарного ряда, начиная со стадии миелоб-ласта, а также с моноцитами, ЕК-клетками, субпопуляцией лимфоцитов (рис. 16). Экспрессия антигена СЭ11Ь наблюдается в среднем в 33% случаев ОНЛЛ и позволяет прогнозировать высокий риск развития рецидива [19,39].
Костный мозг Периферическая кровь
Рис. 16. Экспрессия антигена С011Ь в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
Как видно из представленных выше данных, иммуно-фенотипирование не позволяет с такой надежностью как морфология установить тип властных клеток при М1-М5 вариантах ОНЛЛ, однако дает возможность выявить множество дополнительных субтипов в морфоцитохимически однородной популяции злокачественного клона клеток, описывая, тем самым, более детальную картину опу-
холевого субстрата заболевания. Принципиальное значение иммунологическое исследование имеет при установлении ОНЛЛ с эритроидной и мегакариоцитарной направленностью дифференцировки, которые в подавляющем большинстве случаев не могут быть определены на основании морфоцитохимических критериев. С целью распознавания этих редких вариантов ОНЛЛ используют линей-но-специфичные маркеры - гликофорин А (мкАТ НАЕ-3) для варианта Мб и С1Э41, СШ2, СОб1 для варианта М7.
Гликофорин А является специфическим антигеном клеток эритроидного ряда, который выявляется на всех морфологических стадиях, начиная с эритробласта и заканчивая зрелыми эритроцитами (рис. 17). Экспрессия других дифференцировочных маркеров (СЭ34, С038, Н1А-БЯ, СБЗЗ, СО 13, СО 15, С07), по нашим данным, может быть весьма разнообразной и не влияет на установление диагноза. Однако, высокая частота обнаружения таких антигенов, как С034, СОТ, а также линейно не ограниченных маркеров, свидетельствует, что основную массу в пуле опухолевых клеток при Мб варианте ОНЛЛ составляют ранние эритроидные предшественники (БОЕ-Э).
Костный мозг Периферическая кровь
Рис. 17. Экспрессия антигена гликофорина А в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
Дополнительным маркером, свидетельствующим о признаках эритроидной дифференцировки, может служить антиген эритробластов (НАЕ-9), мкАТ к которому получены в лаборатории акад. Г.И.Абелева РОНЦ им.
Н.Н.Блохина РАМН. В дифференцировочном ряду этот антиген появляется раньше гликофорина А и отсутствует на зрелых эритроцитах. НАЕ-9 выявляется в среднем в 78% случаев Мб ОНЛЛ, однако также обнаруживается у 14% больных с другими вариантами (наиболее часто - при М2 и М4 ОНЛЛ в 16 и 21% случае соответственно). Проведены обширные исследования (более 400 больных) экспрессии эритроидных антигенов при гемобластозах, включая ОНЛЛ [47], и, тем не менее, время вопрос об их прогностической значимости во многом остается открытым. По нашим данным экспрессия бласгными клетками гликофорина А была ассоциирована с более короткой продолжительностью ПР (медиана 1,5 мес. против 16 мес.; р = 0,02).
В более ранних исследованиях нашей клиники негативное влияние на БРВ обоих эритроидных маркеров оказалось взаимодополняющим [2].
Для установления мегакариоцитарной природы властных клеток при М7 варианте ОН Л Л применяют мкАТ к маркерам СЕ)41, СЕ>42 и СОб 1. Экспрессия антигена СЭ61 (гликопротеин тромбоцитов вРШа) позволяет выявить самые ранние клетки-предшесгвенники, коммитированные в мегакариоцитарном направлении. Наиболее специфичным маркером тромбоцитов и мегакариоцитов является антиген СЕ)41 (гликопротеин тромбоцитов вР ИЫШа), появление которого предшествует процессу полиплоидиза-ции. К более поздним маркерам мегакариоцитарной диф-ференцировки относится антиген С042 (гликопротеин тромбоцитов СР1Ь), появление которого совпадает с началом процесса полиплоидизации. Экспрессия антигенов СБ61, СБ41 и С 042 при нормальной клеточной диффе-ренцировке показана на рис. 18,19и20.
ЮЕ-Э Эритробдает
О
Периферическая кровь Эритооцвт
РеТИКУЛОЦИТ
о
Мегакариобласт Мегакариоцит
КОЕ-Г Мислоблает Промопоцнт Миелоцит ;
~ —о—о—
КОЕ-М Моне гг Промиелоцит Про-В -пре-В Пре-В
Тромбоцит
ГЪапулоцит
—О
Моноцит
-О
NK-клетки
-О
В-клетка
-О
Костный мозг
! Субкортикальный Кортикальный Медуллярный тимоцит ткмоцит тимощгг !
Рис.18. Экспрессия антигенов CD61 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
Т-клетка
о
Периферическая кровь
Эритроцит Тромбоцит
Гранулоцит
О
Моноцит
-О
NK-клетки
О
В-клетка
О
Рис. 20. Экспрессия антигена CD42 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.
Сказанным, разумеется, не исчерпывается маркерный набор, изучаемый на мембране бластных клеток ОН Л Л. Одним из перспективных антигенов для последующих иммунодиагносгических работ в этом направлении является панмакрофагальный рецептор CD 163. Наши работы указывают на целесообразность использования мкАТ D11 к этому антигену в иммунофенотипировании лейкозов [9,46], однако, его прогностическая роль еще предстоит оценить в последующем.
По данным Reading С.L. ссоавт. одновременная экспрессия антигенов, в норме не встречающихся, определяется в 85 % случаях ОНЛЛ [40]. Основные иммунофено-типические характеристики бластных клеток различных морфоцитохимических вариантов ОНЛЛ суммированы в табл. 2.
В заключение еще раз хотелось подчеркнуть, что в связи с тенденцией к углубленному изучению биологических свойств опухолевой популяции при ОНЛЛ отнюдь не снижаются требования к морфоцитохимическому методу исследования, позволяющему детально описать субстрат заболевания. Однако актуальность иммунофеноти-пирования, позволяющего выявить характерные и атипические свойства бластных клеток, все более возрастает. Принимая во внимание собственные данные и публикации последнего времени, следует признать, что результаты терапии отдельных иммунологических вариантов ОНЛЛ являются неудовлетворительными, несмотря на существенные достижения в лечении этого заболевания в целом. Это диктует необходимость индивидуализации химиотерапевтических режимов для больных с различными иммунофенотипами бластных клеток. Помимо вышеперечисленного, детальный анализ опухолевой популяции при диагностике ОНЛЛ, выявляющий аберрантные комбинации антигенов, создает предпосылки для возможности контроля за остаточной опухолевой популяцией. Это, по-ввдимому, позволит сделать прогнозОНЛЛ более предсказуемым.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСХИЙ ЖУРНАЛ
Таблица 2. Особенности иммунофенотипа бластных клеток при различных вариантах ОНЛЛ (таблица составлена на основании следующих источников: 3, 5, 6, 30, 40, 48 и др.)
Экспрессируемые антигены Морфоцитохимические варианты ОНЛЛ
МО Ml М2 М3 М4 M5 M6 M7
TdT +/- +/- -/+ - -/+ -/+ - -/+
МПО + + + + + -/+ + +
CD34 + +/- +/- -/+ +/- -/+[3] +/- +/-
CD38 + + + -/+ + -/+ +/- +/-
HLA-DR + + + - + + + +
CD33 +/- + + + + + +/- +/-
CD13 +/- + + + + +/- -/+ -/+
CD15 - +/- + +/- +/- -/+ -/+ -
CD lib - -/+ +/- -/+ + + -/+ -
CD14 - - -/+ - + +/-[3] - -
НАЕ-3 - - - - - - + -
НАЕ-9 - -/+ -/+ - -/+ - + -
CD41 / CD42/CD61 - -/+ [і] -/+ [і] - - -/+ [1] - +
CD10 - * * * * - - -
Т-клеточные CD7*** CD2* CD2** CD2*** CD2*[2] CD2** CD2* CD4**
CD4*** CD4** CD7** CD4* CD5* CD7* CD5* CD3*[2] CD4** CD5*[2] CD7** CD3** CD4*** CD5*[3] CD7** CD4* CD5* CD7*** CD7**
В-клеточные - CD 19* CD19** CD 19* CD 19* - CD19* -
Примечание: *** часто, ** редко, * крайне редко
[1] только для антигена CD61
[2] для М4эоз с аномалиями хромосомы 16 - CD2***, CD3**, CD5**
[3] для М5Ь обычно CD34 (-), CD14 (+), для М5а - CD5**
Литература
I. Бене М.К., Кастолди Г., Напп В. и др. Гематол. и трансфузиол.-1996.-Т.41,N6. -С.43-45.
2 Калетин Г.И., Тупицын Н.Н., Волкова М. А. и др. В кн.: Новое в онкологии. Вып.2/Подред. И.В.Поддубнойи Н.А. Огнерубова. - Воронеж, 1997. - С. 11-14.
3. Маркина И.Г. Автореф. дисс. канд. мед. наук. - М. -2000.-30 С.
4. Маркина И.Г., Волкова М. А., Тупицын Н.Н. и др. Вестник ЮНЦ им. Н.Н.БлохинаРАМН. -2000. -N2. -С. 30-
36.
5. Тупицьш Н.Н. В кн.: Клиническая онкогематология
| /Под ред. М.А.Волковой. - Москва, 2001. - С. 124-145.
f 6. Тупицьш Н.Н. Гематол. и трансфузиол. -1990. - Т.
35, N9.-С. 18-20.
7. Тупицьш Н.Н., Попа А.В., Маркина И.Г. и др. Гематол. и трансфузиол. -1999. - Т. 44, N. 3. - С. 3-8.
8. Френкель М.А. В кн.: Клиническая онкогематология/Под ред. М.А.Волковой. - Москва, 2001. - С. 146-155.
9. Френкель М.А., Тупицьш Н.Н.,РудинскаяТ.Д. и др. Гематол. и трансфузиол. -1995.-Т. 40, N4.-С. 13-16.
10. Adamczyk-CiochM.B., Dmoszyncka A., Hus М. etal. Pol. Arch. Med. Wewn. -1995. - Vol. 94(1). - P. 40-46.
II. Baer M.R., Stewart C.C., Lawrence D. et al. Prog.
I Annu. Meet. Am. Soc. Clin. Oncol. -1994. - Vol. 13. - abstr.
I A1004.
12. BallE.D.,DavisR.B.,GriffinJ.D.etal. Blood.- 1991.-Vol.77(10).-P. 2242-2250.
13. Ball E.D., Fanger M.W. Blood. -1993. - Vol. 61 (3). - P. 456463.
14. Bene M.C., Bernier М., Casasnovas R.O. et al. Leukemia. -1998. - Vol. 2. -P. 54.
15. Bennet J.M., Catovsky D., Daniel M.T. et al. Brit.J. Haematol. -1991.-Vol. 78. -P. 325-328.
16. Bernier М., Massy М., De Leeuw N. et al. Leuk. Lymphoma. -1994. - Vol. 13(1). - P. 109.
#
17. Bloomfield C., Lawerence D., Byrd C. et al. Cancer Res. -1998. - Vol. 58 (18). - P. 4173-4179.
18. Bradbury D.A., Russel N.H. Br.J. Haematol. - 1995.-Vol.91.-P.374-379.
19. Bradstock K., Matthews J., Benson E. et al. Blood. -
1994. - Vol. 84 (4). - P. 1220-1225.
20. Campos L., Guyotat D., Archimbaud E., et al. Br. J. Haematol. -1989. - Vol. 72. -P. 161-166.
21. Casasnovas R.O., Solary E., Campos L. et al. Leuk. Lymphoma. -1994. - Vol. 13(1). -P. 109.
22. CreutzigU.,RitterY.,LudwigW.D.etal. Klin.Radiatr. -1993. -Vol. 205. -P. 272-300.
23. Cuneo A., Fagioli F., Passi I. et al. Leuk. Res. -1992. -Vol. 16 (8).-P. 789-796.
24. De Nully Broun P., Jurlander J., Pedersen-Bjergaard J. etal. Leuk.Res.-1997.- Vol.21(10).- P.985-995.
25. Del Poeta G., Stasi R., Venditti A. et al. Leukemia. -
1994.-Vol. 8(3).-P. 388-394.
26. Fagioli F., Cuneo A., Carli M.G. et al. Cancer Genet. Cytogenet. - 1993. - Vol. 71 (2). - P. 119-124.
27. GuinotM.,SansG.F.,SempereA.etal. Br.J.Haematol. -1991.-Vol. 78.-P. 533-534.
28. HerlzerD.,SeipeltG. Leukemitherapie. - Bremen: Uni-Med Verlag A.G. -1998. - P. 66-80.
29. Jennings C.D., FoonfLA. Blood. -1997. - Vol. 90. - P. 2863.
30. KhalidiH.S.,MedeirosL.J.,ChangK.L. etal. Am.J. Clin. Pathol. -1998. - Vol. 109. - P. 211-220.
31. KitaK., MiwaH.,NakaseK.etal.. Blood. -1992.- Vol. 80.-P. 470-477.
32. KitaK.,MiwaH.,NakaseK.etal.. Blood.-1993.- Vol. 81(3).-P. 2399-2405.
33. Kristensen J.S., Hokland R. Leuk. Res. -1991. - Vol. 15(8).-P. 693-700.
34. Lanza F., Rigolin G.M., Moretti S. et al. Leuk. Lymphoma. -1994. - Vol. 13. -P. 81-85.
35. LeithC.P.,ChenI.M.,KopckeyK.J.etal. Blood.-
1995,-Vol.86.-P.2329-2342.
36. Luesma-Gonalons M., Pavlovsky S., Santarelli M.T. et al. Ann. Oncol. -1992. - Vol. 2. - P. 33-39.
37. Mizutani M., Miwa H., Tarahashi T. et al. Br. J. Haematol. -1997. - Vol. 66. - P. 479.
38. NooterK.,SonneveldP. Cytotehtnology.- 1993.-Vol.
12.-P. 213-230.
39. PaiettaE.,AndersenJ.,YunisJ.etal. Br. J.Haematol. -1998. - Vol. 100(2). -P. 265-272.
40. ReadingCL.,EsteyE.H.,HuhY.O.etal. Blood.-1993. -Vol. 81.-P. 3083-3090.
41. SolaryE.,CasasnovasR.O.,CamposL. etal. Leukemia. -1992.-Vol. 6(5).-P. 393-399.
42. SullivanM.P.,PullenD.J.,CristW.M. etal. Leukemia. -1990.-Vol. 4.-P. 6-11.
43. Terstappen L.W., Safford M., Konemann S. et al. Leukemia. - 1991. - Vol. 5. - P. 75-80.
44. Tien H.F., Wang C.H., Lee M.C. et al. Cancer Genet. Cytogenet. -1995. - Vol. 84(11). - P. 60-68.
45. Tupitsyn N., Volkova M., Frenkel M. et al. Leuk. Lymph. -1994. - Vol. 13.(suppl. 1). - P. 109.
46. Tupitsyn N.N., Frenkel M.A., Rudinskaja T.D. et al. Int. J. Cancer. -1996. - Vol. 68. - P. 160-163.
47. Tupitsyn N.N., Mechetner E.B., Baryshniikov A.Yu. et al. Int. J. Cancer. -1989. - Vol. 44. - P. 589-592.
48. Venditti A., Del Poeta G., Bucdsano F. et al. Leukemia.
- 1998.-Vol. 12.-P. 1056-1063.
>
