CC BY
34
МОНИТОРИНГ ОВЕЦ НЕКОТОРЫХ ГРУБОШЕРСТНЫХ ПОРОД РОССИИ ПО ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ВОСПРИИМЧИВОСТИ К СКРЕПИ
Денискова Т.Е.1, Костюнина О.В.2, Брем Г.3, Селионова М.И.4,
Зиновьева Н.А.5 @
1Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста;
2доктор биологических наук, руководитель лаборатории, Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста; 2доктор ветеринарных наук, руководитель группы, Институт животноводства и генетики,
Ветеринарно-медицинский университет;
3доктор биологических наук, профессор РАН, директор, Всероссийский научно-исследовательский институт овцеводства и козоводства; 4доктор биологических наук, профессор, академик РАН, директор, Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста.
Аннотация
Скрепи является смертельным нейродегенеративным заболеванием овец, которое встречается в двух формах - классической и атипичной. В настоящей работе нами был проведен мониторинг генетической устойчивости грубошерстных овец, принадлежащих к десяти породам, к обеим формам скрепи. Из 180 голов 68, 33 % животных принадлежали к классу G3, то есть характеризовались слабой устойчивостью к классическому скрепи. Было идентифицировано четыре овцы-носителя восприимчивого к атипичному скрепи аллеля. Проведенные исследования наглядно демонстрируют необходимость внедрение обязательного тестирования овец для выявления устойчивых генотипов и производства безопасных продуктов питания для человека.
Ключевые слова: генетический мониторинг, грубошёрстные породы овец, скрепи, генетическая устойчивость.
Keywords: genetic monitoring, coarse-wool sheep breeds, scrapie, genetic sustainability.
Современные концепции животноводства требуют разработки диагностических платформ ранней профилактики и обнаружения патогенов инфекционных заболеваний, что, в свою очередь, является необходимым условием производства безопасных для человека продуктов питания и формирования стад, свободных от скрытого носительства болезней.
Скрепи - это смертельное нейродегенеративное заболевание овец, которое вместе с губчатой энцефалопатией крупного рогатого скота (BSE), хронической изнуряющей болезнью лосей и оленей (CWD) и болезнью Крейтцфельдта-Якоба (CJD) у людей образуют класс трансмиссивных губчатых энцефалопатий (TSEs), или прионных болезней [1,8386]. В центральной нервной системе зараженных скрепи овец происходит накопление патологической изоформы (PrPSc) клеточного прионного белка (PrPC), кодируемого хозяином [2,736]. Аномальный белок может также накапливаться в других тканях, например, в лимфоретикулярной системе и, возможно, в других тканях или биологических жидкостях инфицированного организма [1,8386]. Одной из наиболее негативных эпидемиологических особенностей прионного патогена является его высокая выживаемость в среде обитания. В частности, в Исландии были установлены случае рецидивов скрепи через 14-21 лет после уничтожения зараженных стад овец и тщательной дезинфекции помещений для животных [3,3738].
® Денискова Т.Е., Костюнина О.В., Брем Г., Селионова М.И., Зиновьева Н.А., 2017 г.
На настоящий момент известны две формы скрепи - классическая и атипичная (или штамм Nor98). Классическая форма скрепи наблюдается в Европе с 18 века и является архетипом всех TSEs [1,8386].
Штамм Nor98, или атипичное скрепи, было впервые детектировано в Норвегии в 1998 году и является прионным заболеванием, отличающимся по фенотипическим признакам от классической формы болезни [4,205]. Начиная с 2002, Nor98 был обнаружен в большинстве стран Европейского Союза [5,19], Канаде [6,409], США [7,456] и Новой Зеландии [8,867], которая является официально свободной от классического скрепи.
В отличие от архетипа Nor98 представляет собой спонтанное генетическое заболевание, и его потенциальное присутствие и распространение вероятны на всех территориях, где разводят мелкий рогатый скот. Несмотря на отсутствие эпидемиологических доказательств естественной передачи штамма Nor98, его трансмиссивность была экспериментально продемонсрирована у трансгенных мышей [9,16034] и овец [10,850], а инфекционная активность была также обнаружена в периферических тканях [10,850; 11,6]. Все вышеизложенное указывает на то, что потенциально инфекционный материал может войти в пищевую цепь человека.
Восприимчивость овец к скрепи зависит от генетического фона хозяина, обусловленного в первую очередь аминокислотной последовательностью гена PrP [12,990;13,333]. Ген PrP овец характеризуется высоким уровнем полиморфизма, и было показано, что мутации в кодонах 136(A/V), 154(R/H) и 171(R/Q/H) определяют генетическую восприимчивость овец к классической форме скрепи. [14,390; 15,510; 16,2670; 17, 2478; 18,33]. Аллель ARR является желательным. Животные, несущие данный аллель, не заболевают классическим скрепи, клеточный прионный белок с таким аминокислотным составом не перерождается в патологическую изоформу. В свою очередь, аллель VRQ является наиболее нежелательным, и овцы- носители должны жестко выбраковываться из стад для предупреждения эпидемии и массового уничтожения поголовья. Что касается штамма Nor98, то однонуклеотидная замена T на C в 141 кодоне предопределяет аминокислоту фенилаламин. Животные с таким генотипом крайне неустойчивы к заражению атипичной формой скрепи. Следует подчеркнуть, что генетическая устойчивость к одной форме скрепи не гарантирует невосприимчивость к другой [9,16034].
Тестирование овец по четырем информативным кодонам (136, 141, 154 и 171), характеризующим устойчивость овец к обеим известным формам скрепи, является важным аспектом формирования генетически резистентных стад, элиминирования патогенного приона из среды обитания, предотвращения значительных экономических потерь и производства безопасных для человека продуктов питания.
В связи с этим, целью нашей работы был мониторинг овец отечественных грубошерстных пород на генетическую устойчивость к классической и атипичной формам скрепи.
Материалы и методы исследований. Выборка для нашего исследования включала 180 голов овец некоторых грубошёрстных пород России, включая андийскую (ANDI, n=16), Буубэй (BUUB, n=21), эдильбаевскую (EDLB, n=16), карачаевскую (KRCH, n=17), кучугуровскую (KUCH, n=14), калмыцкую (KALM, n=16), каракульскую (KARA, n=15), лезгинскую (LEZG, n=16), тушинскую (TUSH, n= 27), тувинскую короткожирнохвостую (TUVA, n=22).
Выделение ДНК проводили на колонках Nexttec (Nexttec Biotechnologie GmbH, Германия) и с помощью набора «ДНК-Экстран» (ЗАО «Синтол», Россия) согласно рекомендациям производителей. ПЦР-амплификацию фрагмента прионового протеина овец длиною в 262 пары нуклеотидов выполняли согласно «Методическим рекомендациям по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве» [19,27]. Качество прохождения ПЦР оценивали путем электрофоретического разделения в 2%-ном агарозном геле. Подготовка ПЦР продуктов к
анализу проводилась в несколько этапов: инкубирование с частицами сефарозы при комнатной температуре на шейкере; промывка ПЦР продуктов в 70%-ном этиловом спирте, денатурация ДНК с помощью раствора №OH, промывка в Washing buffer с использованием вакуумной рабочей станции Vacuum Prep Workstation; гибридизация секвенирующих праймеров с одноцепочечной ДНК-матрицей. Полиморфизм аллелей в кодонах 136 (A/T/V), 141 (L/F), 154 (R/H) и 171 (Q/R/H/K) определяли на пиросеквенаторе PSQ96MA (Pyrosequencing, Швеция) и программного обеспечения PSQ96MA SNP Software v.2.0. Полученные данные были статистически обработаны в программах Microsoft Excel и GenAlEx 6.501 [20,25].
Результаты. Анализ полиморфизма фрагмента гена прионового протеина овец показали наличие в изучаемой выборке овец пяти аллелей (ARR, ARQ, AHQ, ARH, ARK) и шести гаплотипов (ARR/ARR, ARR/ARQ, ARQ/ARQ, ARQ/AHQ, ARQ/ARH, ARQ/ARK).
На рисунке 1 проиллюстрированы частоты встречаемости аллелей прионового протеина в кодонах 136, 154 и 171. Наиболее распространённым аллелем во всех породах овец был аллель «дикого» типа ARQ (76,9% по всей выборке). Его доля варьировала от 59,4% (минимум) в лезгинской и до 96,4% (максимум) в кучугуровской породе. Грубошерстные породы России являются по большей части аборигенным, которые не были (или незначительно) улучшены «культурными» породами, что, возможно, объясняет высокую частоту встречаемости аллеля «дикого» типа.
Интересным фактом было то, что в изучаемой выборке овец грубошерстных овец не было найдено ни одного аллеля V136. По мнению некоторых авторов [14,393], в породах, где аллель VRQ отсутствует или встречается очень редко, именно аллель «дикого типа» ARQ ассоциируется с наивысшей восприимчивостью к классическому скрепи.
«Желательный» аллель ARR был идентифицирован во всех десяти породах и встречался во всей изучаемой выборке с частотой 16,4 %. При этом его доля варьировала от 3,1% в эдильбаевской до 30% в каракульской породах овец.
Аллель ARH занимал третье место по распространенности в данной выборке и встречался с частотой 5,6 %. Однако для популяций каракульской и кучугуровской пород он не был характерен, в то время как наивысшая частота встречаемости ARH в 9,4% была зафиксирована в популяциях лезгинской и калмыцкой породах. Аллель AHQ был обнаружен только в тушинской породе (0,28%).
В изучаемой выборке нами был детектирован очень редкий аллель ARK (аминокислота лизин в кодоне 171). С частотой встречаемости 0,83%, он был зафиксирован в двух породах- эдильбаевской и тувинской.
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
TUSH AN 1)1 LEZG KRCH KALM EDLB KARA KUCH TUVA BULB
■ ARR □ ARQ nAHQ MARK DARK
Рис. 1. Частота встречаемости аллелей фрагмента гена прионового протеина в кодонах
136, 154 и 171, обуславливающих устойчивость к классической форме скрепи, в изучаемых популяциях овец десяти грубошерстных пород. ARR, ARQ, AHQ, ARH, ARK-аллели в кодонах 136, 154 и 171. Аббревиатуры пород овец представлены в разделе
«Материалы и методы исследований».
При распределении овец по классам генетической устойчивости к классической форме скрепи в зависимости от генотипа в 136, 154 и 171 было установлено, что изучаемые животные принадлежали к трем из пяти существующих классам генетической устойчивости к классической форме скрепи, а именно: G1, G2 и G3 (табл.1).
Класс G3 был наиболее многочисленным и представленным животным, имеющими гаплотипы ARQ/ARQ, ARQ/AHQ, ARQ/ARH. Овцы данного класса вследствие отсутствия аллеля ARR характеризуются слабой устойчивостью к классической форме скрепи, что необходимо учитывать при выборе селекционной стратегии.
Около 3,3% овец из пяти пород (тушинская, лезгинская, карачаевская, каракульская и тувинская) составляли класс G1. Данные животные высоко устойчивы и не заболевают данной формой инфекции.
Хорошим показателем является тот факт, что во всех изучаемых популяциях присутствуют животные класса G2 (от 6,3% в эдильбаевской до 46,7% в каракульской породах). Наличие таких животных, несущих аллель ARR, делает возможным проводить подбор родительских пар с таким расчетом, чтобы минимизировать вероятность появления «неустойчивых» гаплотипов в потомстве.
Вследствие очень низкой частоты встречаемости аллеля ARK в мировом генофонде пород овец на настоящий момент не было достоверно показано его влияние на восприимчивость к классической форме скрепи. В связи с этим, животные с гаплотипом ARQ/ARK не могут быть отнесены к определенному классу, однако отсутствие аллеля ARR, скорее всего, позволяет предположить, что такие животные отличаются невысокой устойчивостью к классической форме скрепи.
Таблица 1
Распределение генотипов 136, 154 и 171 и классов устойчивости к классической форме скрепи в изучаемых популяциях овец десяти грубошерстных пород
Порода Класс генетической устойчивости и генотип 136/154/171
G1 G2 G3 Неизвестен
ARR/ARR ARR/ARQ ARQ/ARQ ARQ/ARH ARQ/AHQ ARQ/ARK
TUSH 3,70 29,63 55,56 7,41 3,70 -
ANDI - 18,75 75 6,25 - -
LEZG 12,50 37,50 31,25 18,75 - -
KRCH 5,88 41,18 35,29 17,65 - -
KALM - 12,50 68,75 18,75 - -
EDLB - 6,25 75,00 12,50 - 6,25
KARA 6,67 46,67 46,67 - -
KUCH - 7,14 92,86 - -
TUVA 4,55 18,18 50,00 18,18 - 9,09
BUUB - 42,86 47,62 9,52 - 0,00
Всего 3,33 26,67 68,33 1,67
Примечание: G1, G2, G3- классы генетической устойчивости к классической форме скрепи. Аббревиатуры пород овец представлены в разделе ««Материалы и методы исследований».
В результате тестирования исследуемой выборки овец на генетическую устойчивость к штамму Nor98 нами были обнаружены четыре головы, несущие «нежелательный» аллель F в кодоне 141, обуславливающий повышенную восприимчивость к данной форме скрепи. Данные животные принадлежали к карачаевской (1 голова), калмыцкой (1 голова) и эдильбаевской (2 головы) породам.
В результате нашего исследования было показано, что значительное количество овец российских пород характеризуются слабой генетической устойчивостью к классической форме скрепи. Кроме того, нами было обнаружено, что 2,22 % животных имеют генотипы, неустойчивые к штамму Nor98. В связи с этим, необходимо внедрение обязательной рутинной генетической диагностики овец на предмет восприимчивости к обеим известным формам скрепи.
Исследования проведены при поддержке Фонда ««Участник молодежного научно инновационного конкурса (УМНИК)», договор № 5307ГУ1/2014 и 10744ГУ2/2016.
Литература
1. C. Bucalossi, G. Cosseddu, C. D'Agostino, M.A. Di Bari, B. Chiappini, M. Conte, F. Rosone, L. De Grossi, G. Scavia, U. Agrimi, R. Nonno, G. Vaccari - Assessment of the Genetic Susceptibility of Sheep to Scrapie by Protein Misfolding Cyclic Amplification and Comparison with Experimental Scrapie Transmission Studies // Journal of virology. - 2011. - № 85(16). -P. 8386-8392.
2. B. Oesch, D. Westaway, M. Walchli, M.P. McKinley, S.B.H. Kent, R. Aebersold, R.A. Barry, P. Tempst, D.B. Teplow, L.E. Hood, S.B. Prusiner, C. Weissmann - A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein // Cell. -1985. -№ 40. -P. 735-746.
3. G. Georgsson, S. Sigurdarson, P. Brown -Infectious agent of sheep scrapie may persist in the environment for at least 16 years // Journal of General Virology. - 2006. - № 87. - P. 3737-3740.
4. S.L. Benestad, P. Sarradin, B. Thu, J. Schonheit, M.A. Tranulis, B. Bratberg- Cases of scrapie with unusual features in Norway and designation of a new type, Nor98// Veterinary Research. - 2003. -№ 153. - P. 202-208.
5. S.L. Benestad, J.N. Arsac, W. Goldmann, M. Noremark. - Atypical/Nor98 scrapie: properties of the agent, genetics, and epidemiology // Veterinary Research. - 2008. - № 39. - P. 19.
6. G.B. Mitchell, K.I. O'Rourke, N.P. Harrington, A. Soutyrine, M.M. Simmons, S. Dudas, D. Zhuang, H. Laude, A. Balachandran- Identification of atypical scrapie in Canadian sheep // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. - 2010. - № 22. - P. 408-411.
7. C M. Loiacono, B.V. Thomsen, S.M. Hall, M. Kiupel, D. Sutton, K. O'Rourke, B. Barr, L. Anthenill, D. Keane - Nor98 scrapie identified in the United States // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. - 2009. - № 21. - P. 454-463.
8. R. Kittelberger, M.J. Chaplin, M. M Simmons, A. Ramirez-Villaescusa, L. McIntyre, S.C. MacDiarmid, M.J. Hannah, J. Jenner, R. Bueno, D. Bayliss, H. Black, C.J Pigott, J.S. O'Keefe -Atypical scrapie/Nor98 in a sheep from New Zealand // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. - 2010. - № 22. - P. 863-875.
9. Le Dur, V. Beringue, O. Andreoletti, F. Reine, T.L. Lai, T. Baron, B. Bratberg, J.L. Vilotte, P. Sarradin, S.L. Benestad, H. Laude - A newly identified type of scrapie agent can naturally infect sheep with resistant PrP genotypes // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2005. - № 102. - P. 1603116036.
10. M.M. Simmons, S.J. Moore, T. Konold, L. Thurston, L.A. Terry, L. Thorne, R. Lockey, C. Vickery, S.A. Hawkins, M.J. Chaplin, J. Spiropoulos- Experimental oral transmission of atypical scrapie to sheep // Emerg Infect Dis. - 2011. - № 17. - P. 848-854.
11. Andreoletti O, Orge L, Benestad SL, Beringue V, Litaise C, S. Simon, A. Le Dur, H. Laude, H. Simmons, S. Lugan, F. Corbière, P. Costes, N. Morel, F. Schelcher, C. Lacroux- Atypical/Nor98 scrapie infectivity in sheep peripheral tissues // PLoS Pathog. - 2011. - № 7. - P. e1001285.
12. W. Goldmann, N. Hunter, G. Smith, J. Foster, J. Hope. - PrP genotype and agent effects in scrapie: change in allelic interaction with different isolates of agent in sheep, a natural host of scrapie // J. Gen. Virol. - 1994. - № 75(5). - P. 989-995.
13. N. Hunt- PrP genetics in sheep and the applications for scrapie and BSE // Trends Microbiol. -1997. - № 5. - P. 331-334.
14. M. Baylis, W. Goldmann - The genetics of scrapie in sheep and goats // Curr. Mol. Med. - 2004. -№ 4. - P. 385-396.
15. P.B.G.M. Belt, I.H. Muileman, B.E.C. Schreuder, J. Bos-De Ruiter, A. L. J. Gielkens, M.A. Smits-Identification of five allelic variants of the sheep PrP gene and their association with natural scrapie // J. Gen. Virol. - 1995. - № 76(3). - P. 509-517.
16. Bossers, B.E. Schreuder, I.H. Muileman, P.B. Belt, M.A. Smits - PrP genotype contributes to determining survival times of sheep with natural scrapie // J. Gen. Virol. - 1996. - № 77(10). - P. 2669-2673.
17. W. Goldmann, N. Hunter, J.D. Foster, J.M. Salbaum, K. Beyreuther, J. Hope - Two alleles of a neural protein gene linked to scrapie in sheep // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1990. - № 87. - P. 2476-2480.
18. J.L. Laplanche, J. Chatelain, D. Westaway, S. Thomas, M. Dussaucy, J. Brugere-Picoux, J.M. Launay- PrP polymorphisms associated with natural scrapie discovered by denaturing gradient gel electrophoresis // Genomics. - 1993. - № 15. - P. 30-37.
19. Н.А. Зиновьева, А.Н. Попов, Л.К. Эрнст. - Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве// Дубровицы: ВИЖ. - 1998. - 47 с.
20. R. Peakall, P.E. Smouse. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-an update // Bioinformatics. - 2012. -№ 28. - P. 2537 - 2539.
