CC BY
32
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2017, том 52, № 6, с. 1157-1165
УДК 636.32/38:636.082.12:577.21 doi: 10.15389/agrobiology.2017.6.1157rus
ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЛЕЛОФОНДА РОМАНОВСКОЙ ПОРОДЫ ОВЕЦ ПО ГЕНУ ПРИОНОВОГО БЕЛКА, АССОЦИИРОВАННОГО С ГЕНЕТИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К СКРЕПИ*
Е.А. ГЛАДЫРЬ1, Т.Е. ДЕНИСКОВА1, В.А. БАГИРОВ1, О.В. КОСТЮНИНА1, Н.Н. МАКАРОВА2, Г. БРЕМ1, 3, Н.А. ЗИНОВЬЕВА1
Романовская порода — уникальная аборигенная порода, разводящаяся в России и относящаяся к группе северных короткохвостых овец. Она известна во всем мире благодаря полиэст-ричности, феноменальной плодовитости (до 10 ягнят) и непревзойденному качеству овчин. Генофонд породы активно используется для создания новых типов современных многоплодных овец и рассматривается как важный генетический резерв для овцеводства будущего. Устойчивость к заболеваниям — важнейший селекционный признак овец. Губчатая энцефалопатия овец, известная также под названием скрепи, способна нанести серьезный экономический ущерб овцеводству. Это фатальное нейродегенеративное заболевание овец и коз, относящееся наряду с губчатой энцефалопатией крупного рогатого скота (BSE) к классу трансмиссивных губчатых энцефалопатий (TSE). С резистентностью или чувствительностью овец к классической скрепи ассоциировано три полиморфизма в аминокислотных кодонах 136 (A/V), 154 (R/H) и 171 (R/Q/H) гена прионового белка PRPN. В зависимости от генотипа по PRNP различают пять классов генетической устойчивости к скрепи (G1-G5). Желательным с точки зрения устойчивости считается гаплотип ARR. Вместе с тем открытие атипичной скрепи (Nor98) показало возможность передачи BSE животным различных классов устойчивости, включая G1 (генотип ARR/ARR). Показана роль аминокислотной замены L/F в позиции 141 в обеспечении устойчивости к атипичной скрепи. Целью настоящей работы было исследование аллелофонда овец романовской породы (Ovis aries) по гену PRNP, ассоциированному с устойчивостью как к классической, так и атипичной формам скрепи. Материалом для исследований служили пробы ткани 364 клинически здоровых животных романовской породы, представляющих три современные популяции Ярославской области и одну популяцию, интродуцированную для разведения в Камчатский край. Геномную ДНК выделяли с использованием колонок фирмы Nexttec («Nexttec Biotechnologie GmbH», Германия). Идентификацию аллелей в кодонах 136 (A/T/V), 141 (L/F), 154 (R/H) и 171 (Q/R/H/K) выполняли посредством пиросеквенирования на приборе PSQ96MA («Quiagen», США). Показано наличие в романовской породе четырех гаплотипов 136/154/171 (ARR, ARQ, AHQ и VRQ) и девяти генотипов PRNP (ARR/ARR, ARR/ARQ, ARR/AHQ, ARQ/ARQ, AHQ/ARQ, AHQ/AHQ, ARR/VRQ, VRQ/AHQ и ARQ/VRQ), относящихся ко всем пяти классам генетической устойчивости к классической скрепи. Наиболее распространенным оказался гаплотип «дикого» типа ARQ (от 0,704 до 0,933) и генотип ARQ/ARQ (класс устойчивости G3). Во всех группах выявлен желательный гаплотип ARR, частота которого варьировала от 0,022 до 0,089 и в среднем составляла 0,066. Нежелательный гапло-тип VRQ встречался в трех из четырех исследованных групп, при этом его частота была относительно низкой — от 0,011 до 0,022. Исследование полиморфизма PRNP по четырем кодонам 136/141/154/171 выявило наличие 5 гаплотипов — ALRR, ALrQ, ALHQ, VLRQ, AFRQ и 10 генотипов. Обнаружено одно животное, несущее «чувствительный» к атипичной скрепи аллель F в позиции 141 PRNP (генотип VLRQ/AFRQ), что соответствует частоте встречаемости аллеля 0,001. Полученные данные найдут применение при разработке программ селекции романовской породы овец, а также при стратегическом планировании мероприятий по сохранению популяционно-генетического разнообразия этой уникальной российской северной короткохвостой овцы.
Ключевые слова: ген прионового протеина (PRNP), аллелофонд, романовская порода овец, генетическая устойчивость, скрепи.
Сохранение уникального генофонда автохтонных пород России при их гармоничной интеграции в селекционный процесс с учетом мировых трендов в животноводстве — актуальная задача современной биологической науки (1-3). Животноводческая продукция, получаемая от таких пород, представляет интерес для нутрициологии и перерабатывающей промышленности. Романовская порода — уникальная российская аутен-
* Исследования выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-3600039) и Федерального агентства научных организаций (тема № 0600-2014-0004.3). В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» (ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста).
тичная порода, представляющая одно из отродий северных короткохвостых овец (4, 5). Самобытность романовской породы обусловлена сочетанием непревзойденньж качеств шубных овчин с феноменальной (до 10 ягнят) плодовитостью и полиэстричностью (6). История создания породы берет начало в XVII веке, впервые она упоминается в 1802 году (6). Сто лет назад грубошерстное овцеводство, сохраняемое в полунатуральных крестьянских хозяйствах, не только удовлетворяло потребности крестьян в шерсти и мясе, но и давало продукцию на экспорт (7). Признанный классик зоотехнической науки П.Н. Кулешов, обеспокоенный сокращением поголовья овец в России в начале прошлого века, предлагал наметить овцеводческие районы, среди которых на первое место ставил «овчинный район короткохвостой овцы с романовской в центре» (5). В настоящее время генофонд романовских овец рассматривается как важный резерв для создания новых стад, линий, типов многоплодных овец разного направления продуктивности.
Губчатая энцефалопатия овец, известная также под названием скрепи, — одно из заболеваний, способных нанести серьезный экономический ущерб овцеводству. Скрепи — фатальное нейродегенеративное заболевание, поражающее овец и коз, и относящееся к классу трансмиссивных губчатых энцефалопатий (transmissible spongiform encephalopathy, TSE). В эту группу входит также губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (bovine spongiform encephalopathy, BSE). Причиной TSE становится наличие инфекционных патогенов — прионов, которые не имеют нуклеиновых кислот и, по всей видимости, состоят исключительно из модифицированного белка (PrPSc). Нормальный клеточный PrP (PrPC) конвертируется в PrPSc посредством посттрансляционного процесса, результатом которого становится высокое содержание ß-листов (8). Установлено, что устойчивость к скрепи у овец обусловлена главным образом полиморфизмом гена прионового белка (PRNP), кодирующего нормальный PrPC. С резистентностью или чувствительностью овец к классической скрепи ассоциированы три мутации в аминокислотных кодонах 136 (A/V), 154 (R/H) и 171 (R/Q/H) (9-13).
Основные пять аминокислот (АК), кодирующих три знаковых ко-дона 136/154/171, предопределяют формирование 15 возможных генотипов PRNP (14, 15). Желательным с точки зрения устойчивости к скрепи считается гаплотип A136R154R171, обозначаемый ARR. В зависимости от генотипа по PRNP различают пять классов генетической устойчивости к скрепи, получивших название по мере снижения устойчивости от G1 до G5. К классу G1 относится наиболее предпочтительный генотип ARR/ARR. Среди десятков тысяч генотипированных овец класса G1 за последние 25 лет не было диагностировано ни одного случая заболевания классической скрепи (16, 17). Однако успешная передача BSE прионов овцам с генотипом ARR/ARR посредством внутримозговой инокуляции показала, что устойчивость этого генотипа к TSE агентам не абсолютная (18). Следует также указать на два диагностированных в Германии случая заболевания овец с генотипом ARR/ARR энцефалопатией, которая по характеристикам подобна классической форме скрепи (15).
Животные с генотипами ARR/AHQ, ARR/ARH, ARR/ARQ генетически устойчивы к скрепи. В целях исключения чувствительности к этому заболеванию у потомства они могут использоваться в селекции только при контроле подборов (G2). Особи с генотипами ARQ/ARQ (дикий тип), ARQ/ARH, ARQ/AHQ, AHQ/AHQ, ARH/ARH и AHQ/ARH (класс G3) обладают низкой генетической устойчивостью, однако при спаривании с
животными G1 дают устойчивое потомство. Носители генотипов ARR/VRQ (G4) и VRQ/AHQ, VRQ/ARH, VRQ/ARQ, VRQ/VRQ (G5) чувствительны к скрепи и должны исключаться из воспроизводства. Показано, что на устойчивость к прионовому протеину и BSE могут влиять иные аминокислотные полиморфизмы, в частности в позициях 101, 112, 143, 172, 175 и 176, большинство из которых встречаются с низкой (< 5 %) частотой (19). Описан октопептидный полиморфизм, проявляющийся в разном числе повторов восьми аминокислот P(Q/H)GGGWGQ, расположенных на N-терминальном конце. Число повторов у крупного рогатого скота, овец и коз варьирует как между, так и внутри видов, изменяясь от двух до пяти (20, 21). Выявлены полиморфизмы PRNP в трех позициях в про-моторной области (C5354A, T5382C и C5622G), при этом два последних полиморфизма могут оказывать существенное влияние на свойства факторов транскрипции (22, 23).
Открытие так называемой атипичной скрепи показало возможность передачи BSE животным различных классов устойчивости, включая G1 (генотип ARR/ARR). Впервые атипичная скрепи была обнаружена у норвежских овец в 2003 году и получила название Nor98 (24). В дальнейшем высокую заболеваемость атипичной скрепи установили в Германии и Франции (25). В Великобритании на атипичные случаи в 2005 году приходилось 37 % от общего числа овец, заболевших скрепи (26). Атипичная и классическая скрепи различаются по ряду важных признаков. Заболевание атипичной формой происходит в более позднем возрасте (4 года и старше), часто в инфицированном стаде обнаруживаются только отдельные заболевшие особи (27). В отличие от патологии классической скрепи, при атипичной форме лишь в редких случаях или вообще не наблюдается нейрональная вакуолизация или наличие иммуногистохомически детектируемого PrPSc в мозге (24). Аномальный PrP в атипичных случаях характеризуется большей чувствительностью к энзиматическому расщеплению по сравнению с классической формой (28). Исследования показали, что при заболевании атипичной формой Nor98 возрастает роль четвертой аминокислоты в знаковых АК кодонах 136/141/154/172 в позиции 141 (L/F). Большинство случаев атипичной скрепи были выявлено среди животных с низкой чувствительностью к классической скрепи (классы G1-G3) (28-30).
С обнаружением стойкой генетической резистентности у овец определенных генотипов по PRNP к классической скрепи и с выявлением природы атипичной скрепи (24) появилась возможность использовать полиморфизм PRNP в качестве дополнительного критерия в селекционных программах, достигая баланса между генетическим разнообразием популяций и возможностью превентивных мер в борьбе со скрепи.
Изучение овец романовской породы на ограниченной выборке показало невысокую генетическую устойчивость к классической скрепи (31). Однако исследованные стада имели в основном вторичное происхождение и были сформированы посредством завоза лимитированного числа линий. Следовательно, полученные данные не позволяют судить об аллелофонде породы. Исследования на устойчивость романовских овец к атипичной скрепи до настоящего времени не проводились.
Животные из генофондных стад Ярославской области могут быть наиболее яркой моделью, отражающей все генетическое разнообразие ал-лелофонда романовской породы. Для проверки гипотезы о том, что алле-лофонд вторично натурализованных стад этой породы, сформированных посредством завоза ограниченного числа линий и находящихся под давлением иных факторов отбора, нетипичен для породы в целом, актуально
включение таких животных в исследование.
Нами впервые проанализирован генетический полиморфизм популяций романовских овец (Ovis aries) в АК позиции 141 гена PRNP и определена их восприимчивость к атипичному прионовому белку Nor98.
Целью работы было изучение аллелофонда овец романовской породы по гену прионового протеина, ассоциированного с устойчивостью к классической и атипичной формам скрепи, на исторических территориях формирования породы и в местах ее вторичной натурализации.
Методика. Биоматериалом служили пробы ткани (ушной выщип, кровь) от 364 предварительно здоровых овец романовской породы, архивированные в 2013-2016 годах. Были изучены три популяции из Ярославской области, содержавшиеся в ООО «Авангард» (Pop_1, n = 168), ООО «Агро-фима Земледелец» (Pop_2, n = 98) и ООО «Заречье» (Pop_3, n = 46), и одна популяция, интродуцированная для разведения на территории Камчатского края в ОАО «Камчатагроплемсервис» (Pop_4, n = 52).
ДНК выделяли с использованием колонок Nexttec («Nexttec GmbH», Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Постановку ПЦР осуществляли по методике Н.А. Зиновьевой с соавт. (32). Реакции проводили согласно протоколу, изложенному Е.А. Гладырь с соавт. (33). Идентификацию аллелей в кодонах 136 (A/T/V), 141 (L/F), 154 (R/H) и 171 (Q/R/H/K) выполняли пиросеквенированием на приборе PSQ96MA («Qiagen», США).
Статистическую обработку данных проводили с помощью программ PSQ96MA SNP Software v.2.0, Microsoft Excel, GenAlEx 6.501.
Результаты. Исследования показали наличие в романовской породе четырех гаплотипов (ARR, ARQ, AHQ, VRQ) и девяти генотипов PRNP (ARR/ARR, ARR/ARQ, ARR/AHQ, ARQ/ARQ, AHQ/ARQ, AHQ/AHQ, ARR/VRQ, VRQ/AHQ, ARQ/VRQ), относящихся ко всем пяти классам генетической устойчивости к классической скрепи. При этом наблюдались различия в распределении гаплотипов и генотипов между группами. Наиболее распространенным оказался гаплотип дикого типа ARQ, который встречался с частотой от 0,704 в Pop_1 до 0,933 в Pop_4. Во всех группах был выявлен желательный га-плотип ARR, частота которого варьировала от 0,022 в Pop_3 до 0,089 в Pop_1 и в среднем составляла 0,066. Нежелательный гапло-тип VRQ встречался в трех из четырех групп (исключение — Pop_1), при этом его частота была относительно низкой — от 0,011 (Pop_2) до 0,022 (Pop_3) (рис.).
Наиболее часто во всех популяциях, как и прогнозировалось, встречался генотип дикого типа ARQ/ARQ, относящийся к классу устойчивости G3 (табл.). Вероятно, это обусловлено длительным разведением породы «в себе», направленным исключительно на закрепление ее уникальных адаптационных и продуктивных качеств. Отмечалась очень низкая частота генотипа ARR/ARR, наиболее устойчивого к классической
Чaci oía ветречаемости,
Распределение гаплотипов PRNP ARR (а), ARQ (б), AHQ (в), VRQ (г), ассоциированных с устойчивостью к классической форме скрепи, в популяциях овец романовской породы: Pop_1 — ООО «Авангард», Pop_2 — ООО «Агрофима Земледелец», Pop_3 — ООО «Заречье» (Ярославская обл.); Pop_4 — ОАО «Камчатагроплемсервис» (Камчатский край).
форме скрепи. Доля животных, несущих генотипы класса G2, различалась между стадами даже в пределах одного региона более чем в 8 раз. По всей видимости, это было связано с преимущественным использованием баранов-производителей разных линий.
В целом исследованная выборка романовских овец характеризовалась относительно невысокими частотами генотипов, относящихся к генетическим классам G4 и G5 и обусловливающих высокий риск заболевания классической скрепи. Такие генотипы были выявлены в трех из четырех популяций с частотой от 2,2 до 4,1 %.
Распределение генотипов по гену прионового белка РКМР (Г) и классов (К) устойчивости к классической форме скрепи в популяциях овец романовской породы
Генотип 136/154/171 Частота
Рор 1 Ро Р 2 Ро Р 3 Ро Р 4 В среднем
Г | К Г К Г К Г К Г | К
ARR/ARR
ARR/ARQ ARR/AHQ
ARQ/ARQ AHQ/ARQ AHQ/AHQ
ARR/VRQ
VRQ/AHQ VRQ/ARQ
0,143 0,066
0,446 0,316 0,030
0,208
-0,792
0,010 0,061
0,592 0,265 0,031
0,031 0,010
Класс G1 0,010 -Класс G2
0,061 °,(Ш
Класс G3 0,609 - 0,888 0,282 0,043 Класс G4 - 0,022 Класс G5
0,041
0,022
- 0,934
0,022
0,022
0,058
0,865 0,039
0,038
0,058
0,904
0,038
0,003
0,093 0,030
0,566 0,258 0,028
0,003
0,008 0,011
0,003
0,123
- 0,852
0,003
0,019
0,022
Примечание. Описание популяций см. в разделе «Методика». Прочерки означают отсутствие соответствующего генотипа в исследуемых популяциях.
Мы впервые оценили генетический статус романовской породы по предрасположенности к инфицированию атипичным прионовым белком №г98. В результате выявили совокупно пять различных гаплотипов — ЛЬКЯ, ЛЬЯд, ALHQ, VLRQ и AFRQ, а также десять генотипов РШР (136/141/154/171) — ALRR/ALRR, ALRR/ALRQ, ALRR/ALHQ, ALRQ/ALRQ, ALHQ/ALRQ, ЛLHQ/ЛLHQ, ALRR/VLRQ, VLRQ/ЛLHQ, VLRQ /ЛLRQ и VLRQ /ЛFRQ. В большинстве своем частота встречаемости гаплотипов и генотипов по четырем кодонам повторяла профили, полученные для кодо-нов 136/154/171. Только в Рор_4 обнаружили одно животное, несущее в позиции 141 РЯИР аллель F, ассоциированный с чувствительностью к атипичной скрепи (генотип VLRQ/AFRQ), что соответствовало частоте встречаемости аллеля 0,001. Важно отметить, что аллель F141 был идентифицирован в сочетании с гаплотипом VRQ, максимально восприимчивым к классической скрепи, в составе генотипа VRQ/ARQ (генетический класс G5).
Как известно, восприимчивость овец к классической скрепи напрямую зависит от определенных несинонимических единичных нук-леотидных полиморфизмов в пределах гена прионового протеина РВМР, локализованного на 13-й хромосоме (34-36). Современные молекулярно-генетические технологии позволяют исследовать генотип животного в первые дни жизни и осуществлять ранний контроль над распространением наследственных дефектов. Также выполняются работы по сохранению, использованию и развитию генофондов локальных пород для эффективной интеграции в современное животноводство с целью получения возможных новых селекционных форм и повышения численности животных нативных пород. Цель большинства программ разведения овец — контроль за состоянием генофонда породы посредством постепенного замещения генотипов, характеризующихся повышенной восприимчивостью к
скрепи, с использованием баранов с ARR/ARR генотипами. Аккумуляция в породах и отдельных популяциях гаплотипа ARR необходима для обеспечения превентивной защиты от классического патогенного приона, вызывающего скрепи. Этот факт подтверждают исследования, проведенные в Канаде в 2008-2012 годах на 184 овцах романовской породы, показавшие пластичность ее генофонда и позволившие с помощью селекции довести частоту встречаемости гаплотипа ARR и генотипа ARR/ARR соответственно до 0,592 и 0,359 (37). Вместе с тем высокая частота гаплотипа дикого типа в аборигенных и культурных породах, отмеченная в ряде исследований (38, 39), остается актуальной проблемой при селекционной работе.
Таким образом, наши данные позволили оценить аллелофонд овец романовской породы, разводимых на исторических территориях возникновения и в местах интродукции, на генетическую устойчивость к классической и атипичной формами скрепи. Средняя частота встречаемости нежелательного V136R154Q171 гаплотипа и аллеля F141, ассоциированного с чувствительностью к атипичной скрепи, составляла соответственно 0,011 и
0.001. что имеет положительное значение для дальнейшего совершенствования и сохранения романовской овцы. В изученных популяциях выявлен явный дефицит животных с генотипом, относящимся к генетическому классу G1, а частота встречаемости устойчивого к классической скрепи гаплотипа ARR составляла в среднем 0,066. Это создает предпосылки для выполнения стратегических селекционных программ по накоплению устойчивых к патогенному приону генотипов в генофондных стадах романовской породы. Чтобы предотвратить развитие классической и атипичной форм скрепи в российских популяциях, нужно вести селекцию на генетическую резистентность к скрепи, повышая число животных — носителей аллеля ARR и генотипа ARR/ARR. Для эффективной селекционной работы и сохранения популяционно-генетического разнообразия этой уникальной российской северной овцы необходимо исследовать аллело-фонд всего племенного поголовья романовской породы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А. Биологические проблемы животноводства в XXI веке. М., 2008.
2. Столповский Ю.А. Концепция и принципы генетического мониторинга для сохранения in situ пород доместицированных животных. Сельскохозяйственная биология, 2010, 6: 3-8.
3. Deniskova T.E., Selionova M.I., Gladyr' E.A., Dotsev A.V., Bobrysho-va G.T., Kostyunina O.V., Brem G., Zinovieva N.A. Variability of microsatellites in sheep breeds raced in Russia. Agricultural Biology, 2016, 51(6): 801-810 (doi: 10.15389/agrobiology.2016.6.801eng).
4. Иванов М.Ф. Овцеводство. М., 1933.
5. Кулешов П.Н. Овцеводство России. Петроград, 1916.
6. Эрнст Л.К., Дмитриев Н.Г., Паронян И.А. Генетические ресурсы сельскохозяйственных животных в России и сопредельных странах. СПб, 1994.
7. Д анкверт А.Г., Д анкверт С.А. История племенного животноводства России. М., 2004.
8. Prusiner S.B. Prions. PNAS, 1998, 95(23): 13363-13383.
9. Hunter N., Goldmann W., Foster J. D., Cairns D., Smith G. Natural scrapie and PrP genotype: case-control studies in British sheep. Vet. Rec., 1997, 141: 137-140 (doi: 10.1136/vr.141.6.137).
10. Smits M.A., Barillet F., Harders F., Boscher M.Y., Vellema P., Aguer-re X., Helling a M., McLean A.R., Bay lis M., Els en J.M. Genetics of scrapie susceptibility and selection for resistance. Proc. 51st Annual Meeting of the European Association for Animal Production. The Hague, Netherlands, 2000: Paper S.4.4.
11. Bossers A., Belt P.B.G.M., Raymond G.J., Caughey B., de Vries R., Smits M.A. Scrapie susceptibility-linked polymorphisms modulate the in vitro conversion of sheep prion protein to protease-resistant forms. PNAS, 1997, 94(10): 4931-4936 (doi: 10.1073/pnas.94.10.4931).
12. Ishiguro N., Shinagawa M., Onoe S., Yamanouchi K., Saito T. Rapid anal-
13.
14
15
16
17
18
19
20
21
22.
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
ysis of allelic variants of the sheep PrP gene by oligonucleotide probes. Microbiol. Immunol., 1998, 42: 579-582 (doi: 10.1111/j.1348-0421.1998.tb02327.x).
Buschmann A., Biacabe A.G., Ziegler U., Bencsik A., Madec J.Y., Erhardt G. Atypical scrapie cases in Germany and France are identified by discrepant reaction patterns in BSE rapid tests. J. Virol. Methods, 2004, 117: 27-36 (doi: 10.1016/j.jviromet.2003.11.017). DEFRA. National scrapie plan for great britain. London, 2001: 1-28.
Groschup M.H., Lacroux C., Buschmann F., Luhken G., Mathey J., Eiden M., Lugan S., Hoffmann C., Espinosa J.C., Baron T., Torres J.M., Erhardt G., Andreoletti O. Classic scrapie in sheep with the ARR/ARR prion genotype in Germany and France. Emerg. Infect. Dis., 2007, 13(8): 1201-1207 (doi: 10.3201/eid1308.070077). Renaville R. Résistance génétique a la «Tremblante» (aussi appelée scrapie) chez le mouton. FIOW Gembloux, Belgique, 2002.
Vaccari G., Di Bari M.A., Morelli L., Nonno R. Chiappini B., Antonucci G., Marcon S., Esposito E., Fazzi, P., Palazzini N., Troiano P., Petrella A., Guardo G.-D., Agrimi U. Identification of an allelic variant of the goat PrP gene associated with resistance to scrapie. J. Gen. Virol., 2006, 87: 1395-1402 (doi: 10.1099/vir.0.81485-0). Houston F., Goldmann W., Chong A., Jeffrey M., Gonzalez L., Foster J. Prion diseases: BSE in sheep bred for resistance to infection. Nature, 2003, 423: 498 (doi: 10.1038/423498a).
Ac i n C., Mart i n-Burriel I., Goldmann W., Lyahyai J., Monz о n M., Bolea R., Smith A., Rodellar C., Badiola J.J., Zaragoza P. Prion protein gene polymorphisms in healthy and scrapie-affected Spanish sheep. J. Gen. Virol., 2004, 85: 21032110 (doi: 10.1099/vir.0.80047-0).
Goldmann W., Chong A., Foster J., Hope J., Hunter N. The shortest known prion protein gene allele occurs in goats, has only three octapeptide repeats and is nonpathogenic. J. Gen. Virol., 1998, 79(12): 3173-3176 (doi: 10.1099/0022-1317-79-12-3173). Schl ä pfer J., Saitbekova N., Gaillard C., Dolf G. A new allelic variant in the bovine prion protein gene (PRNP) coding region. Anim. Genet., 1999, 30(5): 386-387 (doi: 10.1046/j.1365-2052.1999.00526-5.x).
O'Neill G.T., Donnelly K., Marshall E., Cairns D., Goldmann W., Hunter N. Characterization of ovine PrP gene promoter activity in N2a neuroblastoma and ovine foetal brain cell lines. J. Anim. Breed. Genet., 2003, 120(2): 114-123 (doi: 10.1046/j.1439-0388.2003.00381.x). O'Neill G.T., Cairns D., Toovey L., Goldmann W., Hunter N. New ovine PrP gene haplotypes as a result of single nucleotide polymorphisms in the PrP gene promoter. J. Anim. Breed. Genet., 2005, 122(2): 86-94 (doi: 10.1111/j.1439-0388.2005.00520.x). Benestad S.L., Sarradin P., Thu B., Sch ö nheit J., Tranulis M.A., B r a t b e r g B. Cases of scrapie with unusual features in Norway and designation of a new type, Nor98. Vet. Rec., 2003, 153: 202-208 (doi: 10.1136/vr.153.7.202).
Buschmann A., Biacabe A.G., Ziegler U., Bencsik A., Madec J.Y., Erhardt G., Luhken G., Baron T., Groschup M.H. Atypical scrapie cases in Germany and France are identified by discrepant reaction patterns in BSE rapid tests. J. Virol. Methods, 2004, 117: 27-36 (doi: 10.1016/j.jviromet.2003.11.017).
Everest S.J., Thorne L., Barnicle D.A., Edwards J.C., Elliott H., Jackman R., Hope J. Atypical prion protein in sheep brain collected during the British scrapie-surveillance programme. J. Gen. Virol., 2006, 87(2): 471-477 (doi: 10.1099/vir.0.81539-0). Luhken G., Buschmann A., Brandt H., Eiden M., Groschup M.H., E r h a r d t G. Epidemiological and genetical differences between classical and atypical scrapie cases. Vet. Res., 2007, 38: 65-80 (doi: 10.1051/vetres:2006046).
Le Dur A., B é ringue V., Andr é oletti O., Reine F., Lan La ï T., Baron T., Bratberg B., Vilotte J.-L., Sarradin P., Benestad S.L., Laude H. A newly identified type of scrapie agent can naturally infect sheep with resistant PrP genotypes. PNAS, 2005, 102(44): 16031-16036 (doi: 10.1073/pnas.0502296102).
Langeveld J.P.M., Jacobs J.G., Hunter N., van Keulen L.J.M., Lantier F., van Zijderveld F.G., Bossers A. Prion type-dependent deposition of PRNP allelic products in heterozygous sheep. J. Virol., 2016, 90(2): 805-812 (doi: 10.1128/JVI.02316-15). Gonzalez L., Jeffrey M., Dagleish M.P., Goldmann W., Siso S., Eaton S.L., Martin S., Finlayson J., Stewart P., Steele P., Pang Y., Hamilton S., Re id H.W., C h ia ni ni F. Susceptibility to scrapie and disease phenotype in sheep: cross-PRNP genotype experimental transmissions with natural sources. Vet. Res., 2012, 43: 55 (doi: 10.1186/1297-9716-43-55).
Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Буры лова С.С., Селионова М.И., Моисейкина Л.Г., Эрнст Л.К., Б р е м Г. Характеристика аллелофонда овец юга России. Достижения науки и техники АПК, 2012, 11: 34-37.
Зиновьева Н.А., Попов А.Н., Эрнст Л.К., Марзанов Н.С., Бочка-рев В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. Дубровицы, 1998. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Брем Г. Способ генодиагностики устойчивости
овец к скрепи. А.С. 2303067 (РФ) МПК C12N 15/00, C12N 15/12. ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста (Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства (ВИЖ) (РФ). № 2005128754/13. Заявл. 16.05.2005. Опубл. 20.07.2007. Бюл. № 20.
34. Belt P.B.G.M., Muileman I.H., Schreuder B.E.C., Bos-de Ruijter J., Giel-kens A.L., Smits M.A. Identification of five allelic variants of the sheep PrP gene and their association with natural scrapie. J. Gen. Virol., 1995, 76: 509-517 (doi: 10.1099/0022-1317-76-3-509).
35. Goldmann W., Hunte N., Benson G., Foster J.D., Hope J. Different scrapie-associated fibril proteins (PrP) are encoded by lines of sheep selected for different alleles of the Sip gene. J. Gen. Virol., 1991, 72: 2411-2417 (doi: 10.1099/0022-1317-72-10-2411).
36. Hunter N., Goldmann W., Smith G., Hope J. The association of a codon 136 PrP gene variant with the occurrence of natural scrapie. Arch. Virol., 1994, 137: 171-177 (doi: 10.1007/BF01311184).
37. Cameron С., Bell-Rogers P., McDowall R., Rebelo A.R., Cai H.Y. Prion protein genotypes of sheep as determined from 3343 samples submitted from Ontario and other provinces of Canada from 2005 to 2012. Can. J. Vet. Res., 2014, 78: 260-266.
38. Otelea M.R., Zaulet M.M., Dudu A., Otelea F., Baraitareanu S., Dane s D. The scrapie genetic susceptibility of some sheep breeds in southeast Romanian area and genotype profiles of sheep scrapie infected. Rom. Biotech. Lett., 2011, 16(4): 6419-6429.
39. Garcia- Crespo D., Juste RA, Hurtado A. Selection of ovine housekeeping genes for normalisation by real-time RT-PCR; analysis of PrP gene expression and genetic susceptibility to scrapie. BMC Vet. Res., 2005, 1: 3 (doi: 10.1186/1746-6148-1-3).
1ФГБНУ Федеральный научный центр Поступила в редакцию
животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 4 октября 2017 года 142132 Россия, Московская обл., г.о. Подольск, пос. Дубровицы, 60, e-mail: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected];
2ООО «Агриволга»,
152615 Россия, Ярославская обл., г. Углич, ул. Спасская, 11, e-mail: [email protected];
3Institut für Tierzucht und Genetik, University of Veterinary Medicine (VMU), Veterinärplatz, A-1210, Vienna, Austria, e-mail: [email protected]
Sel'skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2017, V. 52, № 6, pp. 1157-1165
CHARACTERISTICS OF ALLELE POOL OF THE ROMANOV SHEEP BREED FOR THE PRION PROTEIN GENE ASSOCIATED WITH GENETIC SUSTAINABILITY TO SCRAPIE
E.A. Gladyr1, T.E. Deniskova1, V.A. Bagirov1, O.V. Kostyunina1, N.N. Makarova2,
G. Brem1, 3, N.A. Zinovieva1
1L.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry, Federal Agency of Scientific Organizations, 60, pos. Du-brovitsy, Podolsk District, Moscow Province, 142132 Russia, e-mail [email protected] (corresponding author), [email protected], [email protected], [email protected], [email protected] (corresponding author); 2LLC «Agrivolga», 11, ul. Spasskaya, Uglich, Yaroslavl Province, 152615 Russia, e-mail [email protected]; 3Institut für Tierzucht und Genetik, University of Veterinary Medicine (VMU), Veterinärplatz, A-1210, Vienna, Austria, e-mail [email protected] ORCID:
Gladyr E.A. orcid.org/0000-0002-5210-8932 Bagirov V.A. orcid.org/0000-0001-8385-2433 Makarova N.N. orcid.org/0000-0002-4742-9985 Zinovieva N.A. orcid.org/0000-0003-4017-6863 The authors declare no conflict of interests Acknowledgements:
The equipment of the Center for Bioresources and Bioengineering of Agricultural Animals was used in the study. Supported financially by Russian Science Foundation, project № 14-36-00039, and Federal Agency of Scientific Organizations, theme № 0600-2014-0004.3
Received October 4, 2017 doi: 10.15389/agrobiology.2017.6.1157eng
Abstract
The Romanov is a unique indigenous sheep breed of Russia, belonging to the group of Northern short-tailed sheep. The breed is known all over the world, due to out-of-season breeding ability, phenomenal fecundity (up to 10 lambs) and unsurpassed quality of sheepskins. Presently the gene pool of the breed is actively involved in creation of new types of modern prolific sheep and it is considered as an important genetic reserve for the sheep breeding of the future. Diseases resistance is
Deniskova T.E. orcid.org/0000-0002-5809-1262 Kostyunina O.V. orcid.org/0000 0001 8206 3221 Brem G. orcid.org/0000-0002-7522-0708
the most important selection trait in sheep. One of the diseases which can cause serious economic loses is spongiform encephalopathy of sheep, also known as scrapie. Scrapie is a fatal neurodegenerative disease of sheep and goats, belonging to the class of transmissible spongiform encephalopathies (TSE), which also includes bovine spongiform encephalopathy (BSE). Three polymorphisms in amino acid codons 136 (A/V), 154 (R/H), and 171 (R/Q/H) of the PRPN gene are associated with resistance or susceptibility of sheep to classical scrapie. Depending on the PRNP genotype, there are five classes of genetic sustainability to Scrapie (G1-G5). The ARR allele is desirable regarding the resistance to scrapie. However, discovery of atypical scrapie (Nor98) showed a possibility of transmitting BSE to animals of different sustainability classes, including G1 (ARR/ARR genotype). It is shown, that L/F amino acid substitution at position 141 provides resistance to atypical scrapie. The aim of our work was to study the allele pool of the Romanov sheep by the PRNP gene, associated with sustainability to both classical and atypical forms of scrapie. The material for the work was tissue samples of 364 clinically healthy Romanov animals including three modern populations of the Yaroslavl region and one population introduced for breeding in the Kamchatka. Genomic DNA was isolated using the Nexttec columns (Nexttec Biotechnologie GmbH, Germany). Identification of the alleles in the codons 136 (A/T/V), 141 (L/F), 154 (R/H) and 171 (Q/R/H/K) was performed by pyrosequencing on the PSQ96MA device (Quiagen, USA). We found four alleles, 136/154/171 — ARR, ARQ, AHQ and VRQ, and nine haplotypes of PRNP as ARR/ARR, ARR/ARQ, ARR/AHQ, ARQ/ARQ, AHQ/ARQ, AHQ/AHQ, ARR/VRQ, VRQ/AHQ and ARQ/VRQ, relating to all five classes of genetic sustainability to the classical Scrapie. The allele of wild type ARQ (the frequency from 0.704 to 0.933) and the genotype ARQ/ARQ (sustainability class G3) were the prevalent. In all the studied groups, a desirable ARR allele was identified with frequencies varied from 0.022 to 0.089 and averaged 0.066. The undesirable VRQ allele was found in three of the four groups, while its frequency was relatively low — from 0.011 to 0.022. The study of the PRNP polymorphism by four codons 136/141/154/171 revealed the presence of five different alleles — ALRR, ALRQ, ALHQ, VLRQ, AFRQ and ten genotypes. We detected an animal carrying a sensitive to the atypical scrapie allele F at position 141 of PRNP (genotype VLRQ/AFRQ) with the allele frequency of 0.001. The results will be applied in the development of breeding programs for Romanovs, as well as in strategic planning of conservation of the genetic diversity of this unique Russian Northern short-tailed sheep.
Keywords: prion protein gene (PRNP), allele pool, the Romanov sheep, genetic sustainability,
scrapie.
Научные конференции
С 27 по 29 сентября 2017 года в Санкт-Петербурге прошло крупнейшее отраслевое мероприятие Северо-Запада России — «Балтийский форум ветеринарной медицины и продовольственной безопасности». Россия, Китай, ОAЭ, Иран, СШA, Великобритания, Германия, Aвстрия, Швейцария, Чехия, Греция, Польша, Дания, Швеция, Финляндия, Эстония, Латвия, Молдова, Беларусь — такова география специалистов, проводивших и участвовавших в мастер-классах по основным направлениям профилактики и лечения птиц, рыб и животных, проблемам птицеводства и животноводства. Особое внимание было уделено инновационным решениям в сельском хозяйстве и пищевой безопасности.
В рамках Балтийского Форума прошел Международный форум птицеводов «Экспорт 2017», на котором выступали руководители птицефабрик России, мировые экспортеры мяса птицы и яиц, а также известные эксперты по ветеринарии и кормлению птиц. Представители 15 птицефабрик и Э0 животноводческих хозяйств посетили секции, мастер-классы и выездные сессии форума. О возможностях поставки российской продукции птицеводства в различные регионы мира говорили советник Евразийской ассоциации птицеводов Jiangway Joe (Китай), директор компании «Caravan First General Trade L.L.C.» (ОAЭ) Ibrahim Halaibeh, руководитель международной торговли «I.S.F.» (Великобритания) Richard Price.
Доклады на секции «Животноводство» представили Jorgen Katholm (DNA Diagnostic A/S, Дания), доктор аграрных наук Jan Riha (Bentley Instruments Inc., Чехия), Тони Эванжело (World Wide Sires Ltd., СШA), Глеб Юрьевич Косовский, Людмила Ивановна Редкозубова (Москва), Марина Лантух (Санкт-Петербург). Серию докладов представили резиденты «Сколково»: Aлександр Евгеньевич Урсов (Москва), Aïïrn Рудольфовна Жвакина (Москва), Людмила Ивановна Редкозубова (Москва), Владимир Константинович Беляков (Москва), Aлександр Борисович Кузнецов (Россия), Вениамин Юрьевич Ситнов (Москва).
Впервые в рамках Балтийского форума ООО «Центр биологии развития» совместно с Фондом «Сколково» подвели итоги Конкурса инновационных проектов в области сельского хозяйства и пищевой безопасности, итоги которого были подведены на секции.
Итоги прошедшего Балтийского Форума еще подводятся, но оргкомитет уже приступил к работе по организации следующего: Балтийский форум ветеринарной медицины и продовольственной безопасности-2018 состоится 19-21 сентября 2018 года.
Валерий Шарпило
