CC BY
88
УДК 619:616.98:578.833.27
Несколько слов о трансмиссивных губкообразных
энцефалопатиях
Б.Ф. Шуляк, РВЖ. Сельскохозяйственные животные
Ключевые слова: губкообразная энцефалопатия, крупный рогатый скот, овцы, прион, ретровирусы
Сокращения: ГЭ — губкообразная энцефалопатия (ед. и мн.); ЦНС — центральная нервная система_
Трансмиссивные ГЭ — одна из наиболее актуальных проблем современной биологии, изучение которой позволяет получить ответы на многие вопросы, волнующие ветеринарных и медицинских специалистов уже несколько столетий. Существует целый ряд болезней животных и человека, сопровождающихся накоплением в ЦНС прионного белка, что ведет к прогрессирующей вакуолизации, которая придает мозгу сходство с губкой. Дискуссия об этиологии этих болезней не утихает и по сей день. Согласно прионной теории, предложенной С.Б. Прузинером и в последующем развитой его последователями в различных лабораториях мира, возбудителем ГЭ является прион — конформационно измененный прионный белок. Этот белок в норме синтезируется у всех позвоночных и многих беспозвоночных представителей фауны нашей планеты. Изменение структуры делает РгРс устойчивым к протеазам (РгРк<я), которые служат средством избавления организма от его чрезмерного образования. Модифицированный прионный белок РгРк<я аккумулируется в лимфоидной и нервной тканях. Изменение структуры и функций последней ведет к развитию неврологической симптоматики.
Прионная теория нашла очень много последователей. Она позволила понять патогенез ГЭ и открыла возможность разработки специфических методов диагностики этих болезней. Однако далеко не все исследователи считают прион этиологическим агентом ГЭ, отводя ему место не причины, а следствия, не возбудителя, а фактора патогенеза и диагностического маркера. С формальной точки зрения гипотетический возбудитель ГЭ ведет себя как все обычные вирусы — он ин-фекционен, не растет на искусственных питательных средах, проходит через фильтры, задерживающие бактерии, способен персистировать и размножаться в органах и тканях восприимчивых хозяев, а также в культурах клеток, проявляет тропизм к лимфоидной и нервной тканям. По словам В.А. Зуева, «возбудители ГЭ ведут себя как классические нейротропные вирусы, но очень медленно реализующие свое болезнетворное действие». Вирусы, которых выдвигали на роль кандидатов возбудителей ГЭ, находили у естественно больных животных и людей, а также экспериментально зараженных взятым от них патологическим материалом лабораторных животных. Например, в 1968 г. Дж.Ф. Девид-Феррейра и соавт. обнаружили в нейронах коры головного мозга мышей, экспериментально зараженных гомогенатом мозга больных скрепи овец, вирусные частицы диаметром 32...36 нм. Два типа вирусных частиц выявил в нейронах больных скрепи овец Х.К. На-ранг в 1974 г. Пропустив еще целый ряд подобных сообщений, упомянем лишь о недавно сделанном Л. Мануэлидисом [11] открытии: он обнаружил во фракции патологического материала, взятого от больных ГЭ животных, сферические частицы диаметром 25.35 нм. В них может уместиться геном
размером в 1.4 тыс. пар оснований, что вполне достаточно для кодирования информации о нуклеокапсиде или ферменте, обеспечивающем репликацию агента.
Вероятно, в недалеком будущем в диспуте об этиологии ГЭ будет поставлена окончательная точка. Возможно, обнаруживаемые вирусные частицы окажутся случайными находками, однако не исключено, что будет найден агент, способный индуцировать образование конформационно измененных прионных белков или использовать их в качестве катализаторов своей репликации в клетках животных и людей. Но это может произойти в будущем, а пока оно не наступило кратко проанализируем достижения прионологии за четверть века своего существования.
Согласно прионной теории в организме животных и людей экспрессия патологической формы прионного белка может возникать спонтанно в результате мутаций гена PRNP или после заражения этим полипептидом. Частота мутаций гена PRNP не слишком высока, поэтому форму прионных болезней, возникающую на почве таких генетических изменений, называют спорадической.
Примерами спорадической формы ГЭ являются случаи данной патологии, описанные у КРС во Франции [3] и Италии [4]. Во Франции у скота обнаружили прион с большей (тип Н), а в Италии — с меньшей (тип LУмоле-кулярной массой по сравнению с классическим РгРБ5Е. Прионы типов Н и L значительно отличаются от РгРБ5Е и по биологическим свойствам: они вызывают заболевание после более длительного инкубационного периода, индуцируемые ими поражения ЦНС имеют другую топографию и т.д. Предполагается, что эти агенты периодически спонтанно возникают у небольшой части КРС.
Стоит упомянуть еще об одном прионном заболевании КРС — идиопатическом хроматолизе нейронов ствола головного мозга. Его впервые диагностировал М. Джеффри в Шотландии в 1988 г. Встречается оно и в других районах Великобритании. Инцидентность низка — около 7 случаев на 100 000 гол. Симптомы болезни сходны с теми, которые описаны при ГЭ КРС. Они проявляются у животных в возрасте от 4 до 16 лет. Однако гистологические изменения при данной патологии иные: дегенерация нейронов и аксонов ствола головного мозга, ядер и корешков черепных нервов, негнойное воспаление, вакуолизация серого вещества медиального и латерального коленчатых ядер, таламуса, гиппокампа, полосатого тела и коры головного мозга, дегенерация и склероз гиппокампа. Первоначально обнаружить прион в ЦНС больных животных с помощью наборов диагностикумов, применяемых для выявления инфицированного РгРБ5Е скота, не удавалось. С помощью более чувствительных иммуногистохимических тестов подтвердили, что это еще одна спорадическая форма ГЭ КРС [8].
Значительно чаще прионные болезни развиваются у животных и людей в результате попадания в их организм экзогенного этиологического агента. Изучая куру1 у аборигенов Новой Гвинеи, Д.К. Гайдушек установил, что заражение возбудителем этой болезни, которую в последующим отнесли к
1 Одна из трансмиссивных ГЭ; в переводе слово «куру» озна-
чает «дрожащая смерть».
прионным, происходит в результате ритуального каннибализма. Описано свыше 200 случаев болезни Крейтцфельда —Якоба, развившейся у людей спустя многие годы после лечения контаминированными прионом гормональными препаратами или имплантации тканей (роговицы, твердой мозговой оболочки), взятых от больных ГЭ доноров. В 1930-е годы массовая иммунизация овец против лупинг ила стала причиной широкого распространения скрепи в Великобритании, поскольку использованная вакцина оказалась контаминированной возбудителем скрепи. Вполне обосновано предположение о том, что скармливание продуктов убоя овец, больных скрепи, привело к преодолению возбудителем этой болезни видового барьера и возникновению трансмиссивной энцефалопатии норок и ГЭ КРС.
Ключ к пониманию того, почему скрепи стала эндемичной во многих странах мира, нужно искать в свойствах ее возбудителя. Все больше накапливается информации, позволяющей делить млекопитающих, у которых регистрируют ГЭ, на 2 группы: способных выделять возбудителя во внешнюю среду с секретами/экскретами и являющихся тупиковыми хозяевами приона. К числу первых относятся овцы, олени и мыши (полагаю, что этот список в будущем станет значительно длиннее) [14]. Типичным примером тупиковых хозяев приона является КРС, который не способен, как считают в настоящее время многие исследователи, распространять возбудителя горизонтально (с секретами и экскретами) или вертикально (от матери потомству) [15]. Инфицированный КРС становится источником инфекции лишь постмортально, если трупы умерших или убитых животных будут переработаны в корма или захоронены в земле.
Проявляя чрезвычайно высокую резистентность к физическим и химическим факторам, прионный белок способен сохраняться в окружающей среде очень долго. В Исландии в 1978 г. была предпринята очередная попытка искоренить риду2 посредством уничтожения всего поголовья овец в неблагополучных хозяйствах, проведения тщательной дезинфекции помещений и запрета на разведение в них мелкого рогатого скота на протяжении 3 лет. В последующие 25 лет вспышки болезни зарегистрировали на 33 «оздоровленных» этим способом фермах, причем на 9 из них разводить овец, полученных из свободных от скрепи хозяйств, стали после 14...21-летнего перерыва [7]. Заражение животных могло произойти только на пастбищах, контаминированных прионом за 1,5.2 десятка лет до этого! Говоря о земле, как уникальном резервуаре, способном длительно сохранять прионы, нельзя не упомянуть о работе К.Дж. Джонсона и соавт. [9], которые установили, что минерал монтмориллонит, являющийся распространенным компонентом различных типов почв нашей планеты, способен повышать инфекционность возбудителя скрепи.
2 Так в Исландии называют скрепи.
Прионы очень устойчивы к воздействию высокой температуры, ионизирующей радиации, ультрафиолетового света, ультразвука и дезинфицирующих средств, эффективных в отношении других инфекционных агентов. Однако и прионы уязвимы. Их удается инактивировать гидроксидом натрия, гипохлоритом натрия, жидким этиленоксидом, гли-цидолом, соляной кислотой и рядом других химических веществ, а также автоклавированием при 134 °С.
Основными воротами инфекции служат миндалины и пейеровы бляшки: в них отмечают репликацию штаммов приона3. Отсюда прион проникает в автономную нервную систему пищеварительного тракта [14], по которой достигает энтерального сплетения. Из него возбудитель направляется в ЦНС (по эфферентным парасимпатическим путям в область заслонки продолговатого мозга, а по симпатическим нервам — в грудной отдел спинного мозга), где аккумулируется. Не исключена возможность его диссеминации по организму гематогенным и лим-фогенным путями. По интенсивности экспрессии при-онного белка ткани можно расположить в следующей последовательности (в порядке убывания): задвижка продолговатого мозга — мезентериальные лимфатические узлы — подвздошная кишка — лимфоидные ткани — селезенка - мозжечок - другие отделы и ткани нервной системы [6].
Исход заражения животного или человека зависит от их генотипа и свойств штамма приона. Прионные болезни протекают по типу медленных инфекций, для которых характерен длительный (часто многолетний) инкубационный период, после которого медленно возникают и прогрессируют симптомы, ассоциированные с преимущественным поражением ЦНС, что неизбежно ведет к летальному исходу. При определенных сочетаниях генотипа хозяина и свойств штамма приона инкубационный период может настолько удлиняться, что зараженное животное остается клинически здоровым на протяжении всей жизни. Данные по чувствительности овец с разным генотипом к прионам классической и атипичной скрепи, полученные в 20 странах Европы при обследовании 1 764 056 животных [5]), приведены в таблице.
Генотип овец, инфицированных классическим и атипичным вариантами прионов (по [5])
Частота Классическая Атипичная
регистрации скрепи скрепи
Высокая АРО/УЯО АРО/АЯО
АРО/АЯО АЯЯ/АРО
УЯО/УЯО АНО/АЯО
Средняя АЯЯ/УРО АНО/АЯН
АРН/УЯО АЯЯ/АНО
АРЯ/АЯЯ
АНО/АНО
Низкая АНО/АЯО АЯЯ/АЯН
АЯЯ/АРО АНО/АЯН
АРН/АЯО АРО/УЯО
АНО/УЯО АЯО/АЮ
АЯН/АЯН ДНО/ДНО
3 Мы высказываем точку зрения сторонников прионной этиологии ГЭ. Если бы те же процессы описывали оппоненты, то, наверное, они говорили бы о вирусном агенте, который размножается в воротах инфекции, а затем мигрирует, оставляя за собой в виде шлейфа скопления прионного белка в органах и тканях.
Предположение об этиологической связи скрепи и трансмиссивной энцефалопатии норок подкрепляется сходством топографии поражений ЦНС у овец и норок при этих ГЭ. Хотя воспроизвести трансмиссивную энцефалопатию норок посредством перорального заражения возбудителем прионного белка РгР^с не удалось [1], но исследователи не исключают того, что норки проявляют неодинаковую чувствительность к разным штаммам этого агента. В звероводческих хозяйствах США описаны вспышки болезни, возникшие после скармливания норкам продуктов убоя КРС [12]. Однако экспериментальное заражение норок РгРВж приводит к развитию поражений головного мозга, отличающихся от тех, которые возникают при естественном течении этой болезни. Т. Ъэрон и соавт. [2] на основании результатов экспериментов, проведенных на трансгенных мышах, высказали предположение о том, что трансмиссивную энцефалопатию норок вызывает при-он типа К
В конце 1970-х годов в овцекомплексе «Марий Эл» (Марийская АССР4) зарегистрировали вспышку ранее неизвестного в нашей стране заболевания, сопровождавшегося неврологической симптоматикой. Обследование более мелких хозяйств, из которых овец романовской породы завозили в овцекомплекс, показало, что многие из них на протяжении целого ряда лет были неблагополучны по той же неврологической болезни. Она поражала только взрослых овец (обычно в возрасте 1,5.2 лет). Симптоматика прогрессировала в течение 1.3 мес, приводя к парезам и параличам тазовых конечностей и летальному исходу (в большинстве случаев его не допускали, проводя вынужденный убой). Возникло 2 гипотезы относительно этиологии заболевания: прионная и ретровирусная. Основанием для первой из них послужило обнаружение у части больных животных вакуолизации нейронов в головном мозге. Однако предположение о прионной этиологии болезни не могло объяснить:
1. Почему так высока была инцидентность болезни у 1, 5.2-летних овец, в то время как в других странах скрепи болеют более взрослые животные?
2. Почему вакуолизацию нейронов обнаруживали лишь у части больных овец?
3. Почему болезнь лишь спородически сопровождалась тремором и скрежетанием зубов, а проба на наличие кожного зуда обычно не давала положительный результат?
4. Почему у овец на терминальной стадии болезни развивались парезы и параличи тазовых конечностей, что не характерно для скрепи?
5. Почему больные овцы адекватно реагировали на внешние раздражители (звук, свет, появление посторонних лиц и т.д.)?
6. Почему в неблагополучных по этому заболеванию отарах преципитирующие антитела к вирусу висны-мэди выявляли в крови 20.57 % овец, а среди клинически больных животных уровень серопозитивности достигал 70.85 %?
Чем же были больны остальные животные? Мы полагаем, что неврологическая болезнь овец романовской породы в тот период имела ретровирусную этиологию, что не исключает циркуляции в тех же хозяйствах возбудителя скрепи.
В заключение нелишне будет вспомнить о том, что у жвачных описано довольно много заболеваний, при которых в ЦНС обнаруживают вакуолизацию и спонгиозность, но их
прионная этиология сомнительна или не установлена. К их числу относятся сегментная аксонопатия (болезнь Мурурун-ди) овец [16], наследственная некротическая энцефаломиело-патия телят ангусской породы [13], врожденная губкообраз-ная энцефалопатия телят [10].
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Barlow R.M., Rennie J.C. Transmission experiments with a scrapie-like encephalopathy of mink. J Comp Pathol, 1970, 80, 75—79.
2. Baron T., Bencsik A., Biacabe A.-G. et al. Phenotypic similarity of transmissible mink encephalopathy in cattle and L-type bovine spongiform encephalopathy in mouse model. Emerg Infect Dis, 2007, Dec.
3. Biacabe A.G., Laplanche J.L., Ryder S. et al. Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases. EMBO Rep, 2004, 5, 110—115.
4. Casalone C., Zanusso G., Acutis P. et al. Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy: molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. PNAS USA, 2004, 101, 3065—3070.
5. Fediaevsky A., Tongue S.C., Nqremark M., Calavas D., Ru G., Hopp P. A descriptive study of the prevalence of atypical and classical scrapie in sheep in 20 European countries. BMC Vet Res, 2008, 4, 19.
6. Garcia-Crespo D., Juste R.A., Hurtado A. Selection of ovine housekeeping genes for normalisation by real-time RT-PCR; analysis of PrP gene expression and genetic susceptibility to scrapie. BMC Vet Res, 2005, 1:3.
7. Georgsson G., Sigurdarson S., Brown P. Infectious agent of sheep scrapie may persist in the environment for at least 16 years. J Gen Virol, 2006, 87, 3737—3740.
8. Jeffrey M., Perez B.B., Martin S. et al. Idiopathic Brainstem Neuronal Chrom-atolysis (IBNC): a novel prion protein related disorder of cattle? BMC Vet Res, 2008, 4:38
9. Johnson C.J., Pedersen J.A., Chappell R.J. et al. Oral Transmissibility of Prion Disease Is Enhanced by Binding to Soil Particles. PLoS Pathog, 2007, 3, 7: e93.
10. Hindmarsh M., Harper P.A.W. Congenital spongiform myelopathy of Simme-ntal calves. Aust Vet J, 1995, 72, 5, 193— 194.
11. Manuelidis L. A 25 nm virion is the likely cause of transmissible spongiform encephalopathies. J Cell Biochem, 2007, 100, 4, 897—915
12. Marsh R.F., Bessen R.A. Epidemiologic and experimental studies on transmissible mink encephalopathy. Dev Biol Stand, 1993, 80, 111—118.
13. Philbey A.W., Martel K.S. A multifocal symmetrical necrotising encephalom-yelopathy in Angus calves. Aust Vet J, 2003, 81, 4, 226—229.
14. Van Keulen L.J.M., Schreuder B.E., Vromans M.E., Langeveld J.P., Smits M.A., Pathogenesis of natural scrapie in sheep. Arch. Virol. Suppl, 2000, 16, 57—71.
15. Van Keulen L.J.M., Bossers A., van Zijderveld F. TSE pathogenesis in cattle and sheep.Vet Res, 2008, 39, 24.
16. Windsor P.A. Ultrastructural findings in ovine segmental axonopathy of Merino sheep. Aust Vet J, 2006, 84, 169—171.
B.F. Shuljak. Some words about transmissible spongiform encephalopathies.
С°О™Й Терминология
и аббревиатуры, применяемые в ветеринарной прионологии
Губкообразные энцефалопатии (ГЭ) — энцефалопатии животных и человека, сопровождающиеся вакуолизацией центральной нервной системы. Могут иметь различную этиологию.
Трансмиссивные губкообразные энцефалопатии — ГЭ,
возбудители которых передаются от одних восприимчивых особей другим (по крайней мере в рамках одного вида). Основной путь естественного заражения — алиментарный. В основе их патогенеза лежит накопление приона (см. ниже) в ЦНС, приводящее к дегенеративным повреждениям последней и развитию неврологической симптоматики. Связь
4 В настоящее время — Республика Марий Эл.
трансмиссивных ГЭ с прионом выражают термины «прион-ные болезни» и «прионные инфекции».
Скрепи — трансмиссивная ГЭ овец и коз, спонтанно распространяющаяся среди восприимчивых животных. Предполагается, что использование продуктов убоя больных скрепи овец в качестве компонентов рациона стало причиной появления трансмиссивной энцефалопатии норок и ГЭ КРС.
Трансмиссивная энцефалопатия норок — ГЭ норок, вспышки которой регистрировали в Европе и США. Нет оснований предполагать, что инфекция передается горизонтальным или вертикальным путями. Случаев этого заболевания среди норок, живущих на воле, не зарегистрировано.
Губкообразная энцефалопатия КРС — неврологическая болезнь, эпизоотия которой началась в Великобритании в 1980-х годах. Относится к группе трансмиссивных ГЭ, однако пораженный ею КРС, по всей видимости, не передает возбудителя горизонтальным или вертикальным путями (опасность представляет использование в пищу, для приготовления лечебно-профилактических препаратов и в других подобных целях органов и тканей инфицированных животных, в которых возбудитель может накапливаться в высоких титрах).
Хроническая изнуряющая болезнь — единственная известная естественная трансмиссивная ГЭ диких жвачных (оленей и лосей). Инфекция распространяется горизонтальным путем. Ареал распространения — Северная Америка.
Нормальный прионный белок ^^^ — мембранный белок, синтезируемый во многих органах и тканях разнообраз-
ных представителей фауны планеты. Его синтез кодирует ген РИОТ.
Прион — изоформы нормального прионного белка, обнаруживаемые при ГЭ животных и человека. Эти модификации, выявленные у людей и животных разных видов при типичных и атипичных формах трансмиссивных ГЭ, принято считать штаммами приона. Поскольку все они в той или иной степени проявляют резистентность к протеиназе К, то в тех случаях, когда нет необходимости конкретизировать штам-мовую принадлежность, прион обозначают аббревиатурой РгРк<ж (т. е. прионный белок, резистентный к протеиназе К). Другие индексы используют для обозначения прионов, обнаруживаемых при:
классической (типичной) ГЭ КРС — PrPBSE; амилоидной ГЭ КРС — PrPBASE; скрепи овец и коз — PrPSc.
УДК™15-0226 Вспышка скрепи в динамике
К.М. МакИнтир1, С. Габбинс1, В. Голдманн2, Э. Стевенсон1, М. Бейлис1, 3
1 Pirbright Laboratory (г. Пирбрайт, Великобритания)
2 Institute for Animal Health (г. Эдинбург, Великобритания)
3 Veterinary Teaching Hospitals (г. Ньюстон, Великобритания)
Ключевые слова: овца, скрепи, эпизоотология
Сокращения: ГТ — РЯРЫ генотип(ы) Введение
Скрепи — инфекционная болезнь, инкубационный период которой в основном зависит от генетических особенностей животного [8] и дозы возбудителя [12]. Взаимодействие этих факторов определяет особенности вспышек скрепи. Овцы с ГТ, обеспечивающим короткий инкубационный период, заболевают в первую очередь, затем к ним присоединяются другие животные отары с ГТ, соответствующим более длительному инкубационному периоду. Гипотетически по мере увеличения количества инфицированных животных возрастает частота контактов с прионом остальных животных стада и получаемая ими заражающая доза, что может вести к сокращению инкубационного периода болезни. С течением времени это может повлечь за собой изменение симптоматики болезни. Действительно, проведенный Институтом здоровья животных опрос фермеров показал, что в процессе развития эпизоотии в 24 % неблагополучных по скрепи британских стад овец отмечали изменение клинических проявлений болезни, а в 35 хозяйствах — возраста овец, в котором у них начиналась болезнь. Однако низкий уровень заболеваемости при большинстве вспышек и неодинаковый ГТ овец разных стад затруднили выявление определенных закономерностей.
В связи с этим мы детально обследовали одно из немногих неблагополучных по скрепи стад, в которых на протяжении длительного периода (1997.2004 гг.) тщательно регистрировали все случаи болезни. Стадо состояло приблизительно из 850 овец уэльской горной породы. Изучавшаяся в нем вспышка скрепи, по всей видимости, была самой крупной из когда-либо зарегистрированных в Великобритании.
Результаты
Стадо. В 2001 г. в стаде идентифицировали 10 из 15 известных ГТ (таблица). Четверть поголовья (25,2 %) обладала аллелью УИЦ, но только 0,5 % овец имели самый предрасположенный к скрепи ГТ УИЦ/УИЦ. Частота других ГТ составляла: АИИ — 39,9 %, АНЦ — 14,7 %, АИЦ — 32,2 %, УИЦ — 13,2 %.
Аллель АИН у овец этого стада отсутствовала. Частота распространения гаплотипов АКЦ-Б141 и АИЦ-8241 равнялась 21,5 и 14,2 % соответственно, но ни один из них не ассоциировался с заболеванием овец скрепи.
Анализ ГТ овец в племенном стаде (829 гол.) в августе 2001 г. и у животных, заболевших скрепи в 1997...2004 гг.
ГТ Количество овец в стаде в 2001 г. Число случаев скрепи в 1997...2004 гг.
голов % голов %
ARR/ARR 124 15,0 - -
ARR/AHQ 80 9,7 - -
ARR/ARQ 220 26,5 - -
AHQ/AHQ 17 2,1 - -
AHQ/ARQ 77 9,4 - -
ARQ/ARQ 80 9,5 - -
VRQ/ARR 96 11,6 3 2,3
VRQ/AHQ 46 5,5 - -
VRQ/ARQ 63 7,6 75 57,3
VRQ/VRQ 4 0,5 37 28,0
Неизвестный 22 2,7 16 12,2
Вспышка. Фермер считал, что первый оставшийся недиаг-ностированным случай клинического проявления скрепи произошел в его хозяйстве в 1982 г. Больше эта болезнь не возникала вплоть до сентября 1997 г. У пораженных овец отмечали атаксию, они проявляли нервозность/повышенную возбудимость, грызли и расчесывали зудящие участки кожи. В общей сложности в период с сентября 1997 г. по февраль 2004 г. в стаде зарегистрировали 131 случай скрепи у овец трех ГТ (таблица). Инцидентность болезни постепенно повышалась, достигнув максимального значения в 2000 г., а затем стала снижаться (рис. 1). В 2001 г. заболело очень мало овец.
Ежегодно в первые 6 мес регистрировали больше случаев скрепи, чем во второй половине года, но различия не были статистически значимыми (р = 0,59).
