CC BY
159
УДК 636.082.12/636.32/.38/577.21
ХАРАКТЕРИСТИКА РОМАНОВСКОЙ ПОРОДЫ ОВЕЦ ПО ГЕНУ ПРИОНОВОГО ПРОТЕИНА*
Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, академик РАСХН, директор ВИЖ Россельхозакадемии А.В. ГУСЕВА, научный сотрудник А.В. КОНОВАЛОВ, кандидат сельскохозяйственных наук, директор
ЯНИИЖК Россельхозакадемии Г. БРЕМ, доктор биологических наук, иностранный член РАСХН
Ветеринарно-медицинский университет (Австрия) \Л.К. ЭРНСТ|, доктор сельскохозяйственных наук, академик РАСХН
Резюме. С использованием разработанной тест-системы генодиагностики устойчивости овец к скрепи изучен полиморфизм гена прионового протеина у овец романовской породы 7 региональных групп: племрассадник «Колос» (РОМ1, п=98) и ООО «Тутаево (РОМ2, п=90) - Ярославская обл., фермерское хозяйство, (РОМ3, п=211) - Рязанская обл., ГПЗ «Русь» (РОМ4, п=45) - Московская обл., фермерское хозяйство, (РОМ5, п=23) -Смоленская обл., СПК «Ленинский путь», (РОМ6) - Ивановская обл., ФГУП «Камчатское» (РОМ7, п=38) - Камчатский край. Результаты генотипирования показали, что из 8-и аллелей гена прионового протеина, выявленных вдругихпородах овец России, в романовской породе диагностировано 4 - АЯЯ, ARQ, AHQ и VRQ. «Желательный» аллель ARR обнаружен во всех региональных группах с частотой встречаемости от 1,32 до 28,06 % у животных РОМ7 и РОМ1 соответственно. Нежелательный аллель VRQ, наиболее чувствительный к действию патогенного PrPSc, идентифицирован в пяти из семи популяций, при этом максимальная частота его встречаемости (11,84 %) отмечена в РОМ7. Расчет информационного индекса Шеннона (I) показал большее генетическое разнообразие SNP по гену PRNP свойственное овцам ге-нофондныххозяйств РОМ1 и РОМ2(1=0,383±0,156 и 0,350±0,176), в сравнении с другими изученными популяциями. Генетическое равновесие по гену PRNp сохраняется во всех исследованных популяциях, кроме РОМ1 по кодону 154 (р<0,01). Расчет индекса фиксации Fst показал, что 93,2 % всего разнообразия обусловлено внутрипопуляционными различиями и только 6,8 % приходится на межпопуляционные. В изучаемой выборке овец романовской породы идентифицировано девять разных генотипов, отнесенных к пяти классам генетической устойчивости к скрепи. Включение в селекционные программы по работе со стадами овец в качестве дополнительного критерия отбора учет полиморфизма по гену PRNP позволит значительно повысить генетическую устойчивость новых поколении животных к этому заболеванию. Ключевые слова: ген прионового протеина (PRNP), ДНК-диагностика, генетические маркеры, романовская порода овец, генетическая устойчивость, скрепи.
Аборигенные породы домашних животных и птиц, обитающие на территории России не одно столетие, глубоко интегрированные в культуру народов и сельское хозяйство регионов, - потенциальный резерв генофонда и несомненное национальное достояние страны [1].
Романовская порода овец - единственная культурная порода, выведенная народной селекцией в крестьянских хозяйствах приволжских районов Ярославской губернии посредством отбора лучших по шубным качествам местных северныхкороткохвостых овец. Свое название она получила по месту первоначального распространения — Романово-Борисоглебскому уезду Ярославской губернии [2].
*Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, шифр 2012-1.4-12-000-1001010. В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.
В советское время порода была распространена в северных и северо-восточных областях европейской части РСФСР и в Белорусской ССР. На 1 января 1985 г. ее поголовье в государственных предприятиях составляло 456тыс. овец [3], из которых около трети разводили в историческом регионе возникновения породы [4].
В современной России овцеводство, несмотря на большое разнообразие производимой продукции, не самая ведущая отрасль животноводства. По данным консалтинговой компании Intesco Research Group поголовье овец к концу 2011 г. увеличилось на 5,1 % и составило около 20,7 млн гол. [5].
В то же время племенное поголовье животных аборигенных пород, к числу которых относится и романовская, остается на довольно низком уровне. По сведениям ЯНИИЖК Россельхозакадемии (2012 г.) его численность в Ярославской области составляет 6 тыс. гол., что в 23,3 раза меньше, чем в 80-х годах XX века, когда оно достигало 140 тыс. особей [4].
Государство, в лице Министерства сельского хозяйства РФ, активно участвует в совершенствовании племенного дела, сохранении генофонда ценных, высокопродуктивных, редких и исчезающих пород животных, повышении конкурентоспособности и эффективности использования племенных ресурсов страны [6]. В соответствии с Федеральным законом №123-Ф3 «О племенном животноводстве» проверка достоверности происхождения и наличия наследственных аномалий - обязательное условие ведения селекционно-племенной работы в Российской Федерации. Для выполнения этих мероприятий в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ Россельхозакадемии проводится широкий спектр исследований по разработке и совершенствованию систем ДНК экспертизы происхождения животных, объектов сельскохозяйственного назначения [7...17], выявлению наследственных дефектов [18.20] и генетической устойчивости к ряду заболеваний [21.24].
Генетики мира при поддержке FAO [25] осуществляют мониторинг пород и популяций овец с использованием технологий молекулярного анализа для составления их генетических профилей по устойчивости к скрепи с целью разработки мероприятий по повышению частоты встречаемости устойчивых к патогенномуприону генотипов. Скрепи - медленно прогрессирующая болезнь овец и коз, протекающая с симптомами поражения центральной нервной системы и развитием в головном мозге изменений, характерных для губкообразной энцефалопатии (TSE). Возбудитель болезни - инфекционный белок «прион» (PrPSc) специфический сиалогликопротеин, образующий в головном мозге бляшки скрепиассоциированных фибрилл, который отличается чрезвычайно высокой устойчивостью к действию физических и химических факторов [26]. В качестве ДНК-маркера устойчивости овец к скрепи используется ген прионового протеина (PRNP). Он расположен на 13 хромосоме овец (EU870890), имеет белоккодирующую область в 3 экзоне, состоящую из 768 нуклеотидов, что соответствует 256 аминокислотам [27.29]. Методика выявления генетической резистентности овец к скрепи основана на определении мутаций в различных кодонах гена прионового протеина и их ассоциации с устойчивостью или, наоборот, чувствительностью к развитию скрепи в лабораторных условиях [30]. Генетическая чувствительность к скрепи сильно меняется
аллельными вариантами трех различных кодонов в PRNP гене овец [31].
По решению Комиссии Европейского Союза 2002/100/ EG от 14.02.2003 все государства - члены ЕС обязаны разработать программы по искоренению TSE в разводимых породах овец, которые одновременно должны обеспечивать сохранение высокой внутрипородной вариабельности и исключить возможные проблемы инбридинга и генетического дрейфа. С 01.01.2004 г. все государства ЕС участвуют в выполнении национальных программ по увеличению доли животных с ARR аллелем и разведению ARR/ARR генетически резистентных к скрепи овец. Таким образом, селекция может быть достаточно успешным методом контроля над этим заболеванием [32...33].
Мы разработали тест-систему идентификации генотипа овец на устойчивость к скрепи, основанную на методе пиросеквенирования, позволяющую выявлять аллели гена прионового протеина овец в позициях аминнокислот 136/154/171 [34].
Цель наших исследований - изучение полиморфизма гена прионового протеина у овец романовской породы.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на базе Центра коллективного пользования научным оборудованием «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ Россельхозакадемии. Материалом для исследований служили образцы (ушной выщип, кровь) 553 гол. овец романовской породы из 7 популяций, в том числе племрассадника «Колос» (РОМ1, n=98) и ООО «Тутаево (РОМ2, n=90), расположенных в Ярославской области, фермерского хозяйства из Рязанской области (РОМ3, n=211), ГПЗ «Русь» Московской области (РОМ4, n=45), фермерского хозяйства Смоленской область (РОМ5, n=23), СПК «Ленинский путь» Ивановской области (РОМ6), ФГУП «Камчатское» Камчатского края (РОМ7, n=38), хранящиеся в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ Россельхозакадемии.
Выделение ДНК проводили с использованием колонок Nexttec GmbH (Германия), анализ ДНК и постановку ПЦР осуществляли согласно «Методическим рекомендациям [35]. Идентификацию в генотипе овец аллелей в кодонах 136 (A/V/Т), 154 (R/H) и 171 (R/H/Q/К) гена PRNP проводили с использованием тест-системы, разработанной ранее [36]. «Желательные» аллеи гена PRNP в кодонах 136, 154 и 171 - А, R, R, что соответствует аминокислотам Ala (A), Arg (R), Arg (R), кодированными тремя нуклеотид-ными триплетами gcc, cgt и cgg, обозначаемыми «ARR». Желательный, с точки зрения генетической устойчивости к скрепи, совокупный генотип - гаплотип ARR/ARR, который относится по международной классификации к первому классу генетической устойчивости к скрепи и обозначается G1. Все остальные совокупные генотипы относятся к классам G2...G5. Для разведения рекомендуется оставлять животных генетическим классом не ниже G3.
Статистическую обработку данных лабораторных исследований проводили с использованием программного обеспечения PSQ96MA SNP software v.2.0, MS Excel, GenAlEx 6.0, PAST.
Результаты и обсуждение. Из 8-и аллелей гена прионового протеина [36], выявленных в других породах овец России, в романовской породе диагностировано 4 - ARR, ARQ, AHQ и VRQ (рис. 1).
Изученные группы животных романовской породы значительно различались по
Рис. 1. Частоты встречаемости аллелей гена PRNP у овец романовской породы: ось Х - изучаемые группы овец; ось Y -распределение по частотам встречаемости аллелей гена РЯЫР овец (%): а -АЯО\ □ -АНО; М - \/ЯО; -О- -АЯЯ.
частотам встречаемости аллелей гена РЯЫР между собой. Частота «желательного» аллеля АЯЯ варьировала в диапазоне от 1,32 % уживотных РОМ7 до 28,06 % в популяции РОМ1. Наибольшая величина этого показателя была выявлена в генофондных хозяйствах Ярославской области - «Колос» и «Тутаево». Она составила 28,06 и 24,22 % соответственно. Нежелательный аллель VRQ, наиболее чувствительный к действию патогенного РгРЭо [37], и в зависимости от второго аллеля формирующий генотип, который относится к 4 или 5 группе риска (С!4 или G5), был идентифицирован в пяти из семи популяций. При этом самая высокая частота его встречаемости (11,84 %) отмечена в РОМ7, где ранее в процессе разведения животных проводили гибридизацию романовских овец с камчатским снежным бараном и их помесями [38]. В региональных группах овец РОМ4, РОМ1 и РОМ6 частота встречаемости чувствительного к скрепи аллеля VRQ не поднималась выше 3 % и составляла 1,11; 2,04 и 2,08 % соответственно, что указывает на несомненные скрытые резервы популяций. Анализ частот встречаемости аллелей гена прионового протеина в трех информативных кодонах показал, что среднее число эффективных аллелей (Ые) в изученных группах овец находилось в диапазоне от 1,057 (РОМ6) до 1,379 (РОМ1). Наибольшее число Ые аллелей диагностировано в генофондных стадах Ярославской области РОМ1 и РОМ2. Оно составило 1,379±0,188 и 1,347±0,178, соответственно.
Расчет информационного индекса Шеннона (I), характеризующего разнообразие случайных выборок, показал, что большее генетическое разнообразие ЭЫР по гену PRNP свойственно романовским овцам генофондных хозяйств РОМ1 и РОМ2 (1=0,383±0,156 и 0,350±0,176), по сравнению с животными Смоленской (РОМ5) и Ивановской (РОМ6) областей (1=0,125±0,024 и 0,115±0,070 соответственно). Полученные значения на порядок отличаются от показателей, детектируемых при анализе микросателлитных профилей овец, что указывает на предпочтительность анализа по микросателлитам для оценки разнообразия случайных вы-
Таблица 1. Фактическая и ожидаемая степени гетерозиготности у исследованных групп овец
Группа
Степень гетерозиготности
РОМ1 РОМ2 РОМ3 РОМ4 РОМ5 РОМ6 РОМ7
фактическая, Hol ожидаемая, He
Разница Ho-He
Fis
0,218±0,112 0,241±0,122 0,156±0,044 0,089±0,056 0,058±0,038 0,056±0,014 0,114±0,063
0,245±0,111 0,228±0,115 0,161±0,049 0,082±0,049 0,055±0,036 0,054±0,013 0,104±0,055
-0,027 0,013 -0,005 0,007 0,003 0,002 0,01
0,089±0,115 -0,056±0,022 0,015±0,030 -0,048±0,032 -0,046±0,019 -0,029±0,007 -0,063±0,037
Рис. 2. Дендрограмма генетических расстояний различных популяций романовской породы овец.
борок. Доля полиморфных локусов варьировала от 66,67 % в РОМ2 и РОМ5 до 100 % во всех остальных группах и в среднем по породе составила 90,48±6,15 %.
Наименьшей степенью гетерозиготности среди изученных популяций характеризовались романовские овцы Ивановской, Смоленской и Московской областей (табл. 1), что вероятно связано с ограниченным числом производителей и особенностями разведения животных в хозяйствах.
Таблица 2. Генетический профиль овец романовской породы по устойчи вости к скрепи по гену PRNP
Группа Классы генетической устойчивости к скрепи, %
G1 G2 G3 G4 G5
ARR/ARR ARR/ARQ, ARR/AHQ ARQ/ARQ, AHQ/ ARQ, AHQ/AHQ ARR/VRQ ARQ/VRQ, AHQ/VRQ
РОМ1 7,14 40,82 47,96 1,02 3,06
РОМ2 4,44 40,00 55,56 0 0
РОМ3 2,84 20,85 65,88 1,42 9,01
РОМ4 0 20,00 77,80 0 2,20
РОМ7 0 20,00 77,80 0 2,20
РОМ5 0 4,35 95,65 0 0
РОМ6 0 4,17 91,66 0 4,17
В среднем
по породе 3,08 24,05 66,00 0,72 6,15
В целом при общем низком уровне гетерозиготности в группах РОМ1 и РОМ3 отмечен некоторый дефицит гете-розигот (2,7 % у овец госплемрассадника «Колос» и 0,05 % у животных фермерского хозяйства Рязанской области), о чем так же свидетельствует положительное значение индекса фиксации Fis. Анализ распределения генотипов PRNP показал, что во всех исследованных популяциях, кроме РОМ1 по кодону 154 (р<0,01), сохранялось генетическое равновесие по Харди-Вайнбергу.
На основании расчета индекса фиксации Fst, установлено, что 93,2 % всего генетического разнообразия анализируемых групп обусловлено внутрипопуляци-онными различиями (внутри региональных популяций
овец) и только 6,8 % приходится на межпопуляционные. Это, возможно, указывает на начавшиеся процессы генетической дивергенции изучаемых региональных типов. Для сравнения межгрупповые различия между типами крупного рогатого скота, которые мы исследовали ранее, составляли 3,3.3,7 %, а межпородные различия в микросателлитных профилях между животными разных видов оцениваются на уровне 8.15 %.
Анализ генетических дистанций, рассчитанных по Ые1 М. [39], между изучаемыми группами выявил интересную закономерность в кластеризации региональных групп романовской породы. Овцы из генофондных хозяйств Ярославской области «Колос» и «Тутаево» образовали общий кластер, к которому примыкают остальные пять популяций (рис. 2). При этом овцы РОМ7, которых ранее завозили на Камчатку из Ярославской области наиболее генетически близки к животным региона-родоначальника породы.
В результате анализа частот встречаемости совокупных генотипов в изучаемой выборке романовской породы идентифицировано девять различных генотипов, отнесенных к пяти классам генетической устойчивости к скрепи (табл. 2). В разных региональных популяциях овец частоты встречаемости желательных генотипов варьировали в широком диапазоне. Стоит отметить, что только в трех из семи групп идентифицирован желательный генотип АРЯ/АРЯ - от 2,84 в РОМ3 до 7,14 в РОМ1. Тутаевские овцы занимали промежуточное положение (4,44 %). Эти группы животных можно назвать «генетическим резервом» в повышении резистентности овец романовской породы к скрепи.
Генетический класс устойчивости 02, представленный двумя генотипами АРЯ/А1ЭД и ARR/AHQ, содержащими в гетерозиготном состоянии желательный аллель
ARR, - желательный участник программ разведения овец, который позволяет накапливать в популяциях устойчивый к скрепи аллель, встречался в изучаемом массиве животных с частотами от 4,17.4,35 (РОМ6, РОМ5) до 40,00. 40,82 % (РОМ2 И РОМ1).
Выводы. Самое благоприятное состояние по генетической устойчивости к скрепи отмечено в группе РОМ2, где отсутствуют животные с чувствительным аллелем VRQ. Вместе с тем, при некоторой сложности текущего положения в группах овец РОМ5, РОМ6 и РОМ3 в случае целенаправленной работы в сторону накопления устойчивых к скрепи аллелей и повышения их частот встречаемости, тестирования племенного поголовья молекулярно-генетическими методами по гену PRNP и грамотного подбора родительских пар возможно быстрое оздоровление генотипа романовской породы овец и повышение ее резистентности к прионным инфекциям, в частности к скрепи. Включение в селекционные программы по работе со стадами овец в качестве дополнительного критерия отбора учет полиморфизма по гену PRNP позволит существенно повысить генетическую устойчивость новых поколении животных к скрепи.
Литература.
1. ЭрнстЛ.К., Зиновьева Н.А. Биологические проблемы животноводства в XXI веке. - М.: РАСХН, 2008. - 501 с.
2. Романовская порода // Большая Советская Энциклопедия: В 30-ти томах/ Гл.ред.: А. М. Прохоров и др. Том 22: Ремень - Сафи: справочное издание. - М.: Советская энциклопедия, 1975. - 628 с.: 33 л. ил., 4 л. карт.
3. Романовская порода // Сельскохозяйственный энциклопедический словарь. — М., 1989.
4. Интернет ресурс. Режим доступа: http://www.rg.ru/2012/08/11/reg-cfo/yaragro.html/(Дата обращения 12.08.2012).
5. Интернет ресурс. Режим доступа:http://www.tuvaonline.ru/2012/08/13/pogolove-ovec-i-koz-v-2011-godu-v-rossii-uvelichilos-na-51. html/(Дата обращения 13.08.2012).
6. Правила определения видов организаций по племенному животноводству//Утверждены приказом МСХРФ от 19 октября 2006г. № 402 «Об утверждении Правил определения видов организаций по племенному животноводству».
7. ЭрнстЛ.К., Зиновьева Н.А., Коновалова Е.Н., Гладырь Е.А., Бабаян О.В. Изучение влияния прилития крови голштинского скота на изменение генофонда крупного рогатого скота отечественных пород с использованием ДНК-микросателлитов //Зоотехния. - 2007. -№ 12. - С. 2-4.
8. Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И., Гладырь Е.А., Проскурина Н.В., Шавырина К.М. Некоторые аспекты использования микросателлитов в свиноводстве //Достижения науки и техники АПК. - 2009. - № 8. - с. 38-41.
9. ФисининВ.И., Гладырь Е.А., Волкова В.В., Севастьянова А.А., Зиновьева Н.А. Анализ генетической структуры породдомашнихкур с использованием микросателлитныхмаркеров// Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - N1. - С. 68-72.
10. Зиновьева Н.А., Кривцов Н.И., Форнара М.С., Гладырь Е.А., Бородачев А.В., Лебедев В.И. Микросателлиты как инструмент оценки динамики аллелофонда при создании типа «Приокский» среднерусской породы медоносной пчелы // Сельскохозяйственная биология. - 2011. - № 6.
11. Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А. Генетическая экспертиза сельскохозяйственных животных: применение тест-систем на основе микросателлитов//Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 9. - C. 19-20.
12. Гладырь Е.А., Горелов П.В., Маурчева В.Н., Шахин А.В., Чинаров Ю.И., Зиновьева Н.А. Оценка результативности тест-системы на основе микросателлитов в проведении ДНК-экспертизы крупного рогатого скота //Достижения науки и техники АПК. - 2011. -№ 8. - С. 51-54.
13. Гладырь Е.А., Зайцев А.М., Кудина Е.П., Калашников В.В., Зиновьева Н.А. Моделирование тест-системы анализа микросателлитов верблюдов //Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 11. - С. 63-65.
14. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Брем Г. Характеристика генофонда и выявление генеалогических связей между породами овец России с использованием ДНК-микросателлитов //Доклады российской академии сельскохозяйственных наук. - 2004. - № 2. - с. 26.
15. Новгородова И.П., Волкова В.В., Гладырь Е.И., Селионова М.И., Растоваров Е.И.,, Фисинин В.И., Зиновьева Н.А. Изучение информативности микросателлитов кур G. Gallus для характеристики аллелофонда индеек M. Gallopavo //Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 10. - С. 66-67.
16. Траспов А.А., Зиновьева Н.А., Долматова И.Ю., Гладырь Е.А. Аллелофонд башкирской популяции черно-пестрого скота по микросателлитам в связи с показателями молочной продуктивности коров // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. -Т. 1. - С. 65-68.
17. Гладырь Е.А., Селионова М.И., Зиновьева Н.А. Характеристика генофонда и выявление генеалогических связей междупородами овец с использованием групп крови и ДНК-микросателлитов // Овцы, козы, шерстяное дело. - 2007. - № 4. - С. 19-25.
18. ЭрнстЛ.К., Гладырь Е.А., Горелов П.В., Демидова Е.Н., Шайдуллин Р.Р., Зиновьева Н.А. Характеристика региональных популяций быков-производителей по генам наследственных заболеваний // Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 10. - С. 28-30.
19. Гладырь, Е.А., Зиновьева Н.А., ЭрнстЛ.К., Костюнина О.В., БыковаА.С., Банникова А.Д., Кудина Е.П., Брем Г. Молекулярные методы в диагностике заболеваний и наследственных дефектов сельскохозяйственных животных// Зоотехния. - № 8. - 2009. - С. 26-28.
20. Костюнина О.В., Харзинова В.Р., Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И. Генетические аномалии в свиноводстве//Сборник XVIIIМеждународной научно-производственной конференции «Современное состояние, проблемы и пути интенсификации производства высококачественной свинины», 2011.
21. Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А., ЭрнстЛ.К. Некоторые аспекты генодиагностики генетической устойчивости кур квирусу птичьего гриппа // Сборник материалов 5 международной школы-конференции «Новые методы генодиагностики и генотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных». - Дубровицы, 2005. - с. 79-81.
22. Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А., ЭрнстЛ.К., Брем Г. Введение в молекулярную геннуюдиагностикусельскохозяйственныхживотных // РУЦ ЭБТЖ. - Дубровицы. - 2002. - 112 с.
23. БыковаА.С., Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А. Экспресс-диагностика аллелей BoLA-DRB3, ассоциированных с устойчивостью крупного рогатого скота к лейкозу// Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - № 1. - С. 12-15.
24. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., ЭрнстЛ.К., Брем Г. Генотипирование российских пород овец по микросателлитным маркерам и PrP(гену прионового белка)//Ветеринарная патология. - 2005. - № 1. - С. 26-32.
25. FAO: «Состояние всемирных генетических ресурсов животных в сфере продовольствия и сельского хозяйства»: - Отчет. - Рим, 2007/.ВИЖРАСХН2010.-526 с.
26. Методические указания по патогистологической диагностике прионных инфекций животных, 1997. - № 13-17-2/939.
27. Basler K., Oesch B., Scott M., Westaway D., Walchli M., Groth D. F., McKinley M. P., Prusiner S. B., and Weismann C. Scrapie and cellular PrP isoforms are encoded by the same chromosomal gene // Cell. - 1986. - V. 46. - P. 417-428.
28. Westaway D., Zuliani V., Cooper C.M., Dacosta M., Neuman S., Jenny A.L., Detwiler L., Prusiner S.B. Homozygosity for prion protein alleles encoding glutamine-171 renders sheep susceptible to natural scrapie// Genes and development. - 1994. - V. 8(8). - P. 959-969.
29. Lee I.Y., Westaway D., SmitA. F.A., Wang K., Seto J., Chen L., Acharya C., AnkenerM., Baskin D., Cooper C., Yao H., PrusinerS. B., Hood L. E. Complete genomic sequence and analysis of the prion protein gene region from three mammalian species// Genome Res. - 1998. -V. 8. - I. 10. - P. 1022-1037.
30. Hunter, N. Molecular biology and genetics of scrapie in sheep. In L. Piper & A. Ruvinsky, eds. The genetics of sheep, Oxon, UK. CAB International, 1997, Р. 225-240.
31. Goldmann W., Hunter N., Smith G., Foster J., Hope J. Prp genotype and agent effects in scrapie - change in allelic interaction with different isolates of agent in sheep, a natural host of scrapie. //Journal of General Virology. - 1994. - V. 75. - № 5. - P. 989-995.
32. Dawson, M., Hoinville, L., Hosie, B.D. & Hunter, N. Guidance on the use of PrP genotyping as an aid to the control of clinical scrapie. Scrapie InformationGroup. Veterinary Record, 1998. - V. 142. - Р. 623-625.
33. Smits, M.A., Barillet, F., Harders, F., Boscher, M.Y., Vellema, P., Aguerre,X., Hellinga, M., McLean, A.R., Baylis, M. & Elsen, J.M. Genetics of scrapie susceptibility and selection forresistance. In Proceedings of the 51st Meeting of the European Association for Animal Production (EAAP). 21-24 August, The Hague, Paper S.4.4. EAAP. Rome. 2000.
34. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Брем Г. Способ генодиагностики устойчивости овец к скрепи // Патент RU2303067C2, Дата начала отсчета срока действия патента: 16.09.2005, дата публикации заявки: 27.03.2007.
35. Зиновьева Н.А., Попов А.Н., ЭрнстЛ.К., Марзанов Н.С., Бочкарев В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. -Дубровицы: ВИЖ 1998. - 47с.
36. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., ЭрнстЛ.К., Брем Г. Методические рекомендации по генодиагностике устойчивости овец различных пород к скрепи. - Москва, 2006. - 26 с.
37. Hunter N., Foster, J. D., Goldmann, W., Stear, M. J. & Bostock, C. Natural scrapie in a closed ock of Cheviot sheep occurs only in specific PrP genotypes//Archives of Virology. - 1996. - V. 141. - P. 809-824.
38. Шайдуллин И.Н. Биологические особенности акклиматизации овец и гибридизации их со снежным бараном Ovis nivicola nivicola в условиях Камчатки: Дис.... д-ра биол. наук: 03.00.13 - пос. Дубровицы, Моск. обл., 1994.
39. Nei M., Tajima F., Tateno, Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data //J.Mol. Evol. - 1983. - 19. - Р. 153-170.
CHARACTERISTICS OF ROMANOV BREED SHEEP ON THE GENE OF PRION PROTEIN E.A. Gladyr, N.A. Zinovieva, A.V. Guseva, A.V. Konovalov, G. Brem, IL.K. Ernstl
Summary. Polymorphism of the gene of prion protein was studied in Romanov breed sheep from 7 regional groups using developed test-system for gene-diagnostics of resistance of sheep to prurigo. The seven regional group were: the pedigree nursery "Kolos" (ROM 1, n=98), LLC "Tutaevo"
(ROM 2, n=90),Yaroslavl region; a farm (ROM 3, n=211), Ryazan region; SPP "Rus" (ROM 4, n=45), Moscow region; a farm (ROM 5, n=23), Smolensk region; APC "Leninsky put"(ROM 6), Ivanovo region; FSUE "Kamchatskoe" (ROM 7, n=38), Kamchatka Krai. Genotyping results showed, that four alleles of prion protein: ARR, ARQ, AHQ and VRQ, were diagnosed in Romanov breed among eight alleles of this gene, detected in other sheep breeds in Russia. Desirable allele ARR was found in all regional groups with the frequency of occurrence from 1.32 to 28.06 % in animals from ROM 7 and ROM 1, correspondingly. Undesirable allele VRQ, the most sensitive to the action of pathological PrPRc, was identified in five of the seven populations, with a maximal frequency of its occurrence (11.84 %) noted in ROM 7. Calculation of the Shannon information index (I) showed greater genetic diversity of SNP on gene PRNP typical for sheep of gene-pool enterprises ROM 1 and ROM 2 (I=0.383±0.156 and 0.350±0.176, respectively) in comparison with other studied populations. Genetic equilibrium on gene PRNP doesn't change in all studied populations, except of ROM 1 on codon 154 (p<0.01). Calculation of fixation index Fst showed that 93.2 % of all diversity is due to intrapopulation differences, and only 6.8 % of variety fall at interpopulation ones. In the study sample of Romanov sheep nine different genotypes were identified, which were attributed to five classes of genetic resistance to prurigo. Registration of polymorphism on gene PRNP will significantly improve genetic resistance of new animal generations to this disease, being included in breeding programs for sheep as an additional selection criterion.
Key words: gene of prion protein (PRNP), DNA-diagnostics, gene markers, Romanov breed of sheep, genetic resistance, prurigo
УДК 636.2:575.174:577.212
ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЛЕЛОФОНДА СЫЧЕВСКОЙ ПОРОДЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО ДНК МИКРОСАТЕЛЛИТАМ*
Д.Н. КОЛЬЦОВ, кандидат сельскохозяйственных наук, зам. директора
Смоленский НИИСХ Россельхозакадемии В.В. ВОЛКОВА, научный сотрудник Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, академик РАСХН, директор ВИЖ Россельхозакадемии А.А. ПУЗИК, научный сотрудник Смоленский НИИСХ Россельхозакадемии
Резюме. Изучены генетические варианты десяти ДНК-микросателлитных локусов TGLA126, ILST005, ETH185, TGLA122, ILST006, ETH10, ETH225, TGLA227, BM1818, BM2113 сычевской породы (n=88) крупного рогатого скота и внутрипородного типа «Вазузский» (n=45). Среднее число аллелей в сычевской породе составило 8,0±0,86налокус, во внутрипородном типе - 7,2±0,80, что указывает на незначительное снижение генетического разнообразия. Обе исследуемые популяции характеризуются наличием приватных аллелей, свидетельствующем об их генетическом своеобразии. Анализ генетического равновесия в соответствии с распределением Харди-Вайнберга показал достоверные отклонения частот некоторых генотипов 6 локусов микросателлитов в популяции сычевской породы и 5 локусов в популяции внутрипородного типа. Отмечена тенденция к снижению степени гетерозиготности в изученных популяциях, по сравнению с ожидаемой, на 7,2 и 12,7% соответственно. Отрицательные величины коэффициента инбридинга Fis свидетельствуют о некотором преобладании в популяциях гомозиготных аллелей. Доля внутри-популяционной изменчивости (Rst AMOVA) в общей изменчивости составляет 99,87 %, а межпопуляционной - 0,13 %. Ключевые слова: крупный рогатый скот, микросателлиты, аллелофонд, локус, сычевская порода, внутрипородный тип «Вазузский»
Внутривидовое биологическое разнообразие пород крупного рогатого скота представляет интерес с точки
*Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, шифр 2012-1.4-12000-1001-010. В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.
зрения популяционной генетики и сохранения генофонда, а также служит источником ценных генотипов для практической селекции [1, 2]. В этом аспекте особый интерес представляют доместифицированные локальные породы, которые сегодня повсеместно вытесняются не только коммерческими породами, но и в результате создания на их базе новых внутрипородных типов, приспособленных к промышленной технологии производства молока [1]. Одна из локальных отечественных пород - сычевская, разводимая в Смоленской области. Для увеличения молочной продуктивности этих животных в 1985 г. была начата планомерная селекционная работа с привлечением лучших мировых генетических ресурсов, завершившаяся в 2008 г. созданием типа «Вазузский». Ее проводили при постоянном контроле селекционного процесса с использованием иммуногенетических маркеров групп крови, позволяющих оценивать генотипы животных с учетом расщепления в потомстве, и тем самым выявлять наследственные факторы, оказывающие наибольшее воздействие на продуктивные качества потомства [3].
Следует отметить, что, с генетической точки зрения, при создании новых типов существует вероятность утраты ценных качеств исходных пород. Такие изменения на уровне фенотипа можно выявить только в процессе дальнейшего разведения и использования скота, а на уровне генотипа - на любом из этапов селекции [2, 4]. Для этого наряду с эритроцитарными антигенными факторами групп крови в последние годы все шире используются микросателлиты (МС) [5...7].
Цель нашей работы заключалась в изучении аллело-фонда сычевской породы и внутрипородного молочного типа Вазузский крупного рогатого скота по ДНК микросателлитам.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на образцах ДНК, выделенной из крови 133 животных, в том числе 88 гол. сычевской породы и 45 гол. молочного типа «Вазузский», принадлежащих ОАО племзавод «Рассвет» Новодугинского района Смоленской области, на базе НОЦ по молекулярной генетике и биотехнологии животных ВИЖ Россельхозакадемии.
