CC BY
91
12. Зиновьева Н.А., Попов А.Н., ЭрнстЛ.К., Марзанов Н.С., Бочкарев В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. - Дубровицы, 1998. - 36 с.
EVALUATION OF SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF PCR FOR SPECIES IDENTIFICATION OF COWS,
PIGS AND CHICKENS E.N. Konovalova, O.V. Vavilova, E.A. Gladyr, N.A. Zinovieva
Summary. Using developed method of PCR analysis of mtDNA cytochrome B gene (cyt b) the universality of PCR method for identification of animal DNA of three species (bovine, Bos Taurus, pig, Sus scrota domestica, chicken, Gallus gallus) was evaluated. The specificity of developed method in dependence of sample type, method of treatment (mechanical, temperature and chemical) was studied. The application of method for analysis of mixed products (two and more animal species) was shown. The analysis were performed on 72 samples of different origin: beef broth, sausage of three kinds, cooked chicken of two kinds, cow milk of two types, mayonnaise, pork, paste from beef liver, pie, cheese of three kinds, products of cottage cheese of two types, minced meat from single and mixed raw meat of four kinds, chicken eggs, ear samples of cattle and pigs, cattle hair samples, chicken feather. Using PCR amplification the species specific amplification of raw products and products after mechanical, temperature, mechanical and temperature, temperature and chemical treatment was achieved in 100 per cent of cases. The successful amplification of target sequences of conserved biological samples was achieved in 82.4 per cent cases. The developed method can be used by molecular genetics laboratories for species identification of products of animal origin.
Key words: animal species identification, Bos Taurus, Sus Scrofa, Gallus Gallus, PCR, cytochrome B, cyt b, mtDNA
УДК 636.064; 573.7
МОЛОЧНАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ КОРОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ИНФИЦИРОВАННОСТИ ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА И ГЕНОТИПА ПО BOLA-DRB3*
Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, академик PACXH, директор A.C. БЫКОВА, кандидат биологических наук, ведущий специалист
И.В. ВИНОГРАДОВА, младший научный сотрудник ВИЖ Россельхозакадемии \Л.К. ЭРН^\академикРACХН E-mail: [email protected]
Резюме. C использованием разработанной тест-системы диагностики провирусной формы вируса лейкоза крупного рогатого скота (BЛKРC) выполнено исследование степени распространения лейкоза среди животных черно-пестрой (n=302) и красной горба-товской пород (n=156) с различными генотипами по BoLA-DRB3.
В группе гомозиготных носителей аллелей BoLA-DRB3, ассоциированных с генетической устойчивостью клейкозу (аллели 11, *23,
*28=*7А) носители вируса, отсутствовали, в то время какв группах гетерозиготных носителей и не носителей степень инфицирован-ности BЛKРC в среднем составила 23,1 и 20,7 %. У голштинизи-рованньх коров черно-пестрой породы (n=267) установлены достоверно более высокие уровни удоя (+588кг, р<0,05), содержания жира (+0,14 % абс., р<0,05), количества молочного жира (+19,3 кг, p<0,01) и количества белка (+9,2 кг, р<0,05). Аналогичные тенденции выявлены укоров красной горбатовской породы (n=133). Перечисленные закономерности сохраняются в группах с различными генотипами по BoLA-DRB3 у животных обеих пород.
Ключевые слова: вирус лейкоза крупного рогатого скота, ДНК-диагностика, BdLA-DrB3, молочная продуктивность
Основные цели селекционной работы в молочном скотоводстве - увеличение удоя и выхода молочного жира и белка. Однако повышенная молочная продуктивность, как правило, сопряжена со снижением устойчивости к
*Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, государственный контракт № 16.М04.11.0018. В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.
различным заболеваниям, что негативно сказывается на процессе производства, значительно увеличивая стоимость выходной продукции [Одно из широко распространенных на территории России заболеваний животных - лейкоз крупного рогатого скота [2]. По данным Россельхознадзора в 2010 г. было выявлено около 10 % животных, инфицированных вирусом лейкоза (ВЛКРС), у которых наблюдались неопластические изменения и изменения лейкоформулы [3]. Одной из причин широкого распространения лейкоза в высокопродуктивных стадах может быть снижение резистентности, о чем свидетельствуют более высокие показатели молочной продуктивности у коров, инфицированных ВЛКРС. Так, установлен более высокий уровень удоя у коров голштинской породы канадской селекции, инфицированных ВЛКРС в латентной стадии, по сравнению с серонегативными животными [4], и более высокий гене-
100 80 60 40 20 0
ЕЫ/ЕЯ ЕЫ/- -/- ЕЛ/ЕЫ ЕЫ/- -/- ЕЫ/ЕЫ ЕЛА -/1-------1--------"---------1--------"---------1--------'
Черно-пестрая Краснаягорбатовская В среднем
порода порода
Рисунок. Инфицированность коров ВЛКРС в зависимости от присутствия в генотипе «желательных» аллелей BoLA-DRB3 ось Х - генотип коров по BoLA-DRB3 по каждой из пород и в среднем по двум породам; ось Y - распределение коров по инфицированности ВЛКРС (%); ц - ВЛКРС «+» - носители провирусной формы ВЛКРС, □ - ВЛКРС «-» - не носители провирусной формы ВЛКРС (по результатам ПЦР анализа). __ Достижения науки и техники АПК, №8-2012
Таблица 1. Показатели молочной продуктивности коров с различным статусом по ВЛКРС
Показатель Порода
черно-пестрая, голштинизи-рованная красная горбатовская
ВЛКРС «+» ВЛКРС «-» ВЛКРС «+» I ВЛКРС «-»
N. голов 78 189 23 110
Удой, кг 6553±113* 5965±72 3362±199 3165±75
Жир, % 3,98±0,04* 3,84±0,03 4,16±0,04 4,19±0,02
Выход жира, кг 249,4±5,6** 230,1±3,6 140,1±8,43 132,1±3,01
Белок, % 3,09±0,02 3,08±0,01 - -
Выход белка, кг 193,2±3,6* 184,0±2,3 - -
* p<0,05, ** p<0,01
тический потенциал коров, инфицированных ВЛКРС, как находящихся в стадии персистентного лимфоцитоза, так и гематологически нормальных, по сравнению с серонегативными животными (+204 и +136 кг соответственно) [5]. В то же время в исследовании, проведенном на 19785 коровах канадской селекции, показано отсутствие влияния статуса по ВЛКРС на уровень молочной продуктивности [6].
Инфицированность стад лейкозом наносит большой экономический ущерб, обусловленный снижением срока продуктивного использования коров из-за выбраковки
как следствие, уменьшением среднего уровня молочной продуктивности по стаду [7, 8].
Развитие молекулярной генетики и совершенствование методов анализа генома привело к внедрению в практику животноводства нового направления селекции, основанного на анализе генетических маркеров - участков ДНК, связанных с проявлением определенных признаков [9, 10]. Использование ДНК-маркеров, обусловливающих устойчивость или наоборот чувствительность к заболеваниям, -один из приемов селекции животных, нацеленной на получение особей, обладающих повышенной резистентностью [11]. Такая стратегия особенно актуальна для инфекционных заболеваний, борьба с которыми только с использованием ветеринарных мероприятий не всегда эффективна.
В качестве потенциальных ДНК-маркеров устойчивости к лейкозу рассматриваются гены главного комплекса гистосовместимости локуса Во1_А, в частности, ген йЯВЗ [12, 13]. С целью выявления животных-носителей «жела-
Достижения науки и техники АПК, №8-2012
тельных» аллелей BoLA-DRB3 (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, мы разработали систему генотипирования в режиме массового скрининга [14], что сделало возможным проведение обследований больших массивов скота. С другой стороны, нами предложена высокочувствительная тест-система выявления носителей вируса лейкоза крупного рогатого скота, основанная на технологии «гнездовой» ПЦР, позволяющая выявлять наличие провируса ВЛКРС в крови с концентрацией 6х10-3 копий/мл.
Цель представленной работы - изучение влияния генотипа коров по BoLA-DRB3 и уровня их молочной продуктивности на степень инфицированности вирусом лейкоза.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на 302 образцах ДНК животных голштинизиро-ванной популяции черно-пестрой породы и 156 образцах ДНК животных красной горбатовской породы (в том числе
267 и 133 коров, имеющих учетные данные о молочной продуктивности, соответственно), хранящихся в банке ДНК Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ Россельхозакадемии. Выделение ДНК проводили с использованием колонок Nexttec GmbH (Германия), набора реагентов DIAtomTM DNA Prep100 (Россия) и «BloodExt» (Россия). Наличие в генотипе коров «желательных» аллелей BoLA-DRB3 (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, определяли с помощью тест-системы, разработанной ранее [14]. Учитывая, что «желательные» аллели BoLA-DRB3 в позициях 70 и 71 в отличие от других (нейтральных и чувствительных) содержат два нуклеотидных триплета gga и gag, соответствующих аминокислотам Glu (Е) и Arg (R), их обозначали «ER». Все остальные аллели обозначали «-». Определение наличия провирусной формы ВЛКРС в образцах ДНК коров проводили методом «гнездовой» ПЦР участка гена env ВЛКРС с использованием разработанной тест-системы для генодиагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Статистическую обработку данных лабораторных исследований и зоотехнического учета проводили методами дисперсионного и корреляционного анализа с использо-
ванием критериев Фишера и Стьюдента по методикам,
Таблица 3. Коэффициенты корреляции между исследованными факторами и показателями молочной продуктивности коров
Показатель Генотип по BoLA-DRB3 Удой, кг Жир, % Молочный жир, кг Носительство ВЛКРС
Генотип по BoLA-DRB3 - -0,03 0,12*** 0,08** -0,12***
Удой, кг -0,04 - 0,24*** 0,89*** 0,13*
Жир, % -0,02 -0,25** - 0,64*** 0,17**
Молочный жир, кг -0,04 0,98*** -0,07 - 0,18**
Носительство ВЛКРС -0,03 0,09 -0,06 0,09 -
В правой верхней части таблицы значения для черно-пестрой, голштинизированной породы; в левой нижней - для красной горбатовской; *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001
47
Таблица 2. Уровень молочной продуктивности коров носителей ВЛКРС с разными генотипами по BoLA-DRB3
носителей и не
Статус по ВЛКРС* Генотип по BoLA-DRB3
Показа- тель черно-пестрая, голштинизированная красная горбатовская
ER/ER 1 ER/-** 1 -/-** ER/ER 1 ER/-** 1 -/-**
N гол. + 0 10 68 0 2 21
- 7 34 148 5 3 102
Удой, кг + 0 6290±355 6248±120 0 3600±1700 3339±183
- 5892±491 6138±172 5930±80 2863±136 3511±12 3170±80
Жир, % + 0 4,02±0,08 3,98±0,05 0 3,97±0,08 4,18±0,04
- 3,98±0,06 3,97±0,06 3,80±0,03 4,27±0,08 3,98±0,14 4,19±0,02
Выход + 0 252,6±15,0 249,0±6,1 0 144,0±70,1 139,7±7,9
жира, кг - 235,1±21,7 245,7±9,7 226,2±3,9 121,9±4,5 139,8±4,5 132,4±3,2
Белок, % + 0 3,11±0,04 3,09±0,02 - - -
- 3,08±0,06 3,07±0,03 3,09±0,01 - - -
Выход + 0 195,6±11,4 193,1±4,5 - - -
белка, кг - 0, ±1 ,9 3, 4 5 188,4±7,4 183,2±3,3 - - -
* - «+» - носители ВЛКРС, «-» - не носители ВЛКРС, ** нейтральные и чувствительные аллели
животных с клиническими проявлениями заболевания, и,
изложенным в [15, 16], с помощью программ Статистика В каждой из исследованных пород носители вируса в
6.0 и Excel. группах с различными генотипами по BoLA-DRB3 превос-
Результаты и обсуждение. Анализ инфицирован- ходили интактных животных по уровню удоя, количеству
ности коров ВЛКРС показал, что ни у одного из животных, молочного жира и белка (табл. 2).
как черно-пестрой, голштинизированной, так и красной По результатам корреляционного анализа (табл. 3)
горбатовской пород, имевших в генотипе «желательные» установлено, что у голштинизированных коров черно-
аллели BoLA-DRB3 в гомозиготном состоянии, про- пестрой породы с различным статусом по ВЛКРС суще-
вирусная форма ВЛКРС не обнаружена (см. рисунок). ствует высоко достоверная отрицательная корреляция
Достоверных различий в степени инфицированности с наличием в генотипе «желательных» аллелей по BoLA-
животных ВЛКРС с генотипами ER/- и -/- по BoLA-DRB3 DRB3 (r=-0,12, p<0,001), положительная корреляция
в обеих изучаемых породах выявлено не было. С исполь- с содержанием жира (+0,12, p<0,001) и количеством
зованием дисперсионного анализа установлено, что молочного жира (+0,08, p<0,01), слабая отрицательная
наличие в генотипе животных «желательных» аллелей по корреляция - со статусом по ВЛКРС, в то время как у коров
BoLA-DRB3 с вероятностью ошибки 5,5 % способствует красной горбатовской породы достоверные корреляции
снижению их инфицированности ВЛКРС. между этими показателями не установлены.
Анализ уровня молочной продуктивности в группах Степень инфицированности голштинизированных
коров с различным статусом по ВЛКРС (табл. 1) сви- коров черно-пестрой породы ВЛКРС положительно кор-
детельствует, что у коров-носителей вируса обеих ис- релировала с уровнем удоя (r=+0,13, p<0,05), процентным
следованных пород он был выше, чем у неносителей. В содержанием и количеством молочного жира (r=+0,17
черно-пестрой голштинизированной породе их превос- и r=+0,18, соответственно, p<0,01). У коров красной
ходство по удою составляло 588 кг (р<0,05), по содер- горбатовской породы достоверные связи между этими
жанию жира - 0,14 % (р<0,05), по выходу белка - 9,2 кг показателями не обнаружены.
(р<0,05), по выходу молочного жира - 19,3 кг (p<0,01). Выводы. Таким образом, для голштинизированных
В красной горбатовской породе наблюдалась анало- коров черно-пестрой и красной горбатовской пород,
гичная тенденция по уровню удоя и выходу молочного инфицированных ВЛКРС характерен более высокий
жира, однако различия между группами были не до- уровень молочной продуктивности, по сравнению с не
стоверны. Полученные данные полностью согласуются носителями, причем такая закономерность сохраняется
с результатами других авторов [4, 5]. По всей видимо- в группах с различными генотипами по BoLA-DRB3. Жи-
сти, селекция на повышение молочной продуктивности вотные с гомозиготным устойчивым к ВЛКРС генотипом
косвенно способствовала увеличению чувствительности по гену BoLA-DRB3 отличаются наименьшим удоем
животных к ВЛКРС. среди изученного поголовья.
Литература.
1. Тараторкин В.М., Петров Е.Б. Ресурсосберегающие технологии в молочном животноводстве и кормопроизводстве. -М.: Колос, 2009. - 376 с.
2. Гулюкин, М.И., Замараева Н.В., Коромыслов Г.Ф. Лейкоз крупного рогатого скота одна из важнейших проблем ветеринарии //Ветеринарная газета. - 2001. - № 5. - С. 1-2.
3. Интернет ресурс. Режим доступа: www.fsvps.ru
4. Pollary F.L., Wangsuphachart V.L., DiGiacomo R.F., Evermann J.F. Effects of bovine leukemia virus infection on production and reproduction in dairy cattle // Can J Vet Res. - 1992. - 56 (4). - 289-295.
5. Wu M.C., Shanks R.D., Lewin H.A. Milk and fat production in dairy cattle influenced by advanced subclinical bovine leukemia virus infection // Proc NatlAcad Sci USA. - 1989. - 86 (3). - 993-996.
6. Sorge U.S., Lissemore K., Kantin R., Kelton D.F. Short communication: Milk ELISA status for bovine leukosis virus infection is not associated with milk production in dairy cows // J Dairy Sci. - 2011. - 94 (10). - 5062-5064.
7. Ott S.L., Johnson R., Wells S.J. Association between bovine-leukosis virus seroprevalence and herd-level productivity on US dairy farms// Preventive Veterinary medicine. - 2003. - 61. - 249-262.
8. Erskine R.J., Bartlett P.C., Byrem T.M., Render C.L., Febvay C., Houseman J.T. Association between bovine leukemia virus, production, and population age in Michigan dairy herds // J Dairy Sci. - 2012. - 95 (2). - 727-734.
9. Гладырь, Е.А., Зиновьева Н.А., ЭрнстЛ.К., Костюнина О.В., Быкова А.С., Банникова А.Д., Кудина Е.П., Брем Г. Молекулярные методы в диагностике заболеваний и наследственных дефектов сельскохозяйственных животных// Зоотехния. - № 8. - 2009. - с. 26-28
10. Столповский Ю.А. Концепция и принципы генетического мониторинга для сохранения in situ пород доместицированных животных// Сельскохозяйственная биология. - 2010. - № 6. - с. 3-8.
11. Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А. Биологические проблемы животноводства в XXI веке. - М.: РАСХН, 2008. - 501 с.
12. ЭрнстЛ.К., Сулимова Г.Е., Орлова А.Р., Удина И.Г., Павленко С.П. Особенности распространения антигенов BoLA-DRB3 у черно-пестрого скота в связи с ассоциацией с лейкозом// Генетика. - 1997. - Т. 33. - № 1. - с. 87-95.
13. Ковалюк Н.В., Шостак В.А., Сацук В.Ф., Фоменко Д.В. Селекционно-генетический способ создания высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу крупного рогатого скота // Вестник РАСХН. - 2005. - № 6. - с. 67-69.
14. Быкова А.С., Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А. Экспресс-диагностика аллелей BOLA-DRB3, ассоциированных с устойчивостью крупного рогатого скота к лейкозу// Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - Т. 1. - с.12-15.
15. ЖивотовскийЛ.А. Популяционная биометрия. - М.: Наука, 1991. - 271 с.
16. Крамаренко С.С. Дисперсионный анализ качественных признаков (ANOQVA) в популяционно-фенетических исследованиях // Интернет ресурс http://www.ievbras.ru/ecostat/Kiril/Articlelist.htm, 2004.
MILK PRODUCTIVITY OF COWS IN DEPENDENCE OF THE INFECTION BY BVL AND GENOTYPE
ON BOLA-DRB3
E.A. Gladyr, N.A. Zinovieva, A.S. Bykova, I.V. Vinogradova, I L.K. ErnsTI
Summary. Among animals of Black-and-White (n=302) and Red Gorbatov (n=156) breeds with different genotypes on BoLA-DRB3 the degree of BVL distribution was investigated using developed test-system for diagnostic of provirus form of the virus. In the group of homozygous carriers of BoLA-DRB 3, associated with genetic resistance to BVL (alleles 11, *23, *28=*7А), carriers of BVL lacked, while in groups of heterozygous carriers and non-carriers the degree of infection by BVL averaged 23.1 and 20.7 %. In Holsteined Black-and-White cows (n=267) reliably higher levels of milk yield (+588 kg, р<0.05), fat content (+0.14 %, р<0.05), milk fat content (+19.3 kg, p<0.01), and protein content (+9.2 kg, р<0.05) were ascertained. Similar trends were revealed in Red Gorbatov cows (n=133). These patterns retain in groups with different genotypes on BoLA-DRB in cows of both breeds.
Key words: bovine leukemia virus, DNA-diagnostics, BоLA-DRB 3, milk productivity.
48 ----------------------------------------- __________ Достижения науки и техники АПК, №8-2012
