CC BY
117
УДК 575.113.2+575.17:636.225.1+636.237.21
уникальность костромской породы
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С ПОЗИЦИИ
молекулярной генетики*
Г.Е. СУЛИМОВА, доктор биологических наук, зав. лабораторией
И.В. ЛАЗЕБНАЯ, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
A.В. ПЕРЧУН, аспирант Костромская ГСХА
B.Н. ВОРОНКОВА, ведущий специалист М.Н.РУЗИНА, научный сотрудник
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Г.А. БАДИН, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. селекционным центром Костромская ГСХА E-mail: [email protected]
Резюме. Исследования по оценке генетического потенциала костромской породы по генам, ответственным за молочную и мясную продуктивность - каппа-казеина (CSN3), пролактина (bPRL), гормона роста (bGH) и диацилглицерол-ацилтранс-феразы-1 (DGAT1), а также аллелям гена BoLA-DRB3, определяющего генетическую устойчивость КРС к лейкозу и маститу проводили на выборках коров из ГКПЗ «Лужки», СПК «Гридино» и ОАО «Минское» и быков из ОАО «Костромское». Тестирование А- и В-аллелей гена CSN3 проводили с помощью аллель-специфичной ПЦР. ДНК-полиморфизм генов bPRL, bGH, DGAT1 и BoLA-DRB3 определяли методом ПЦР-ПДРФ. Частота встречаемости В-аллеля гена CSN3, определяющего сыродельческие качества молока, в изученных выборках составляет до 59,5 %; генотипа L/L гена bGH, ассоциированного с высоким содержанием жира и белка в молоке и большим приростом массы тела, -до 86 %; генотипа АА гена bPRL, ассоциированного с высоким содержанием белка в молоке, - до 58,1 %; генотипа АК гена DGAT1, ассоциированного с высокой жирностью молока, а также с низким содержанием стеариновой кислоты, что предпочтительнее для получения высококачественного мяса, - до 35,4 %, аллелей гена BoLA-DRB3, определяющих устойчивость к лейкозу, - до 35,9 % и клиническому маститу - до 24,1 %. Полученные результаты свидетельствуют об уникальном сочетании в генотипе костромской породы ценных генетических комплексов, одновременно обеспечивающих высокое качество молока и мяса, а также устойчивость к заболеваниям. Генетический потенциал костромской породы не исчерпан. Она относится к числу лучших отечественных пород и нуждается в бережном отношении и дальнейшем усовершенствовании. Ключевые слова: крупный рогатый скот, костромская порода, молочная продуктивность, мясная продуктивность, ДНК-маркеры, ПЦР-ПДРФ, BoLA-DRB3, гены каппа-казеина, пролактина, гормона роста, диацилглицерол-ацилтрансфе-разы-1, частоты аллелей и генотипов.
Костромская порода крупного рогатого скота (КРС), относится к одной из трех пород бурого скота, разводимых в России. Она считается одной из наиболее продуктивных пород молочно-мясного направления. Животные костромской породы хорошо приспособлены к местным условиям кормления и содержания, обладают крепкой конституцией, хорошим здоровьем, высокой устойчивостью к заболеванию лейкозом, высокими удоями в течение длительного срока хозяйственного использования [1]. Генетический потенциал молочной продуктивности коров этой породы превышает 6000 кг в год, а от рекордисток получают 10...16 тыс. кг
* Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Генофонды и генетическое разнообразие» и Госконтрактов 16.512.11.2074 и 14.740.
с высоким содержанием жира (3,9...4,0 %) и белка (3,49...3,64 %) [2].
Один из основных белков молока - каппа-казеин, на долю которого приходится около 13 % всех белков молока. Он участвует в стабилизации мицелл при свертывании молока. Тестирование A- и B-аллелей гена представляет практический интерес, поскольку молоко, содержащее B-аллель каппа-казеина, предпочтительнее для производства сыров. Гормон роста (bGH) и пролактин (bPRL) - полипептидные гормоны, играющие важную роль в регуляции лактации и других процессах. Аллели их генов могут быть связаны с положительным или отрицательным воздействием на молочную продуктивность. У ряда пород КРС LL генотип гена bGH ассоциирован с высокими удоями, содержанием жира и белка в молоке, а АА генотип гена bRPL - с высоким содержанием жира и белка [4, 7, 8] .
Ген DGAT1 участвует в обмене жирных кислот, его А-аллель ассоциирован с более низким содержанием стеариновой кислоты и предпочтительнее для получения высококачественного мяса. Ранее было показано, что основная роль в иммунном ответе организма на вирусные и бактериальные инфекции принадлежит гену BoLA-DRB3. Методом ПЦР-ПДРФ тестировано 54 аллеля этого гена, часть из которых определяет устойчивость и восприимчивость КРС к лейкозу [6, 9].
Костромскую породу изучали многие авторы с использованием различных типов маркеров, среди которых маркеры белков крови, маркеры генов белков молока - лактальбумина и казеинов и др. [3]. Однако исследования генофонда костромской породы на молекулярно-генетическом уровне крайне ограничены.
Цель нашей работы - оценка генетического потенциала костромской породы по генам, участвующим в формировании хозяйственно полезных признаков с использованием молекулярно-генетических методов (ДНК-маркеров). Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
определение частоты встречаемости аллелей по таким генам, ответственным за молочную и мясную продуктивность, как гены каппа-казеина (CSN3), пролактина (bPRL), гормона роста (bGH) и диацилглице-рол-ацилтрансферазы-1 (DGAT1);
оценка генетической устойчивости или предрасположенности животных костромской породы к лейкозу и маститу на основе анализа ДНК-полиморфизма гена BoLA-DRB3.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на выборках коров костромской породы из ГКПЗ «Лужки» (n=62), СПК «Гридино» (n = 42) и ОАО «Минское» (n = 20), а также быков костромской породы -чистопородных (n = 24) и помесных (n = 23) с прилитием швицкой крови от 1/8 до 1/2 из ОАО «Костромское» по племенной работе.
ДНК коров выделяли из 200 мкл цельной крови с помощью набора реагентов DIAtom™ DNA Prep согласно прописи, представленной изготовителем. ДНК из спермы быков выделяли с использованием того же набора, но для улучшения лизиса спермы добавляли дитиотреитол (ДТТ) из расчета 8 мкл ДТТ на пробу (100 мкл спермы и 800 мкл лизирующего буфера).
Тестирование А- и В-алле-лей гена CSN3 проводили с помощью аллель-специфичной ПЦР с использованием набора «GenePak k-Casein A/B PCR test» согласно прописи изготовителя с последующим электрофоретическим разделением продуктов амплификации в 2 %-ном геле агарозы в присутствии этидий бромида. Полиморфизм генов bPRL и bGH определяли методом ПЦР-ПДРФ с использованием рестриктазы Rsal для гена bPRL, ре-стриктаз MspI и AluI для гена bGH. Состав праймеров и условия амплификации приведены в работе [4]. Полиморфизм гена DGAT1 изучали методом ПЦР-ПДРФ с использованием рестриктазы AcoI [5]. Амплификацию осуществляли в термоциклере PTC-100.
Тестирование аллелей гена BoLA-DRB3 проводили методом ПЦР-ПДРФ с использованием рестриктаз Rsal, HaeIII и XhoII, согласно [6]. Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в 4 %-ном агарозном геле (TopVision™ LE GQ agarose) в присутствии бромистого этидия (5мМ/мл). B качестве маркеров молекулярных масс использовали Mspl-рестриктные фрагменты плазмиды pBR322 и маркер М50. Фрагменты ДНК регистрировали с помощью системы Vitran.
Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерного пакета программ STATISTICA 6.0.
Результаты и обсуждение. В изучаемых выборках костромской породы КРС количество животных, в генотипе которых содержался B-аллель гена CSN3 (генотипы АВ и ВВ), в целом составляет 62,4 %, причём в СПК «Г ридино» эта величина достигает 76,2 % (табл. 1). Кроме того, КРС из СПК «Г ридино» достоверно отличается от других хозяйств по частоте генотипа ВВ (td = 3,614...4,069, р<0,001).
Частота В-аллеля гена CSN3 в этом стаде превышает таковую у других отечественных пород КРС, включая исследованную ранее ярославскую породу, где она составила в среднем по двум хозяйствам 0,475 (n=120).
Использование критерия X2 в популяциях исследованных животных позволило выявить достоверную разницу между наблюдаемыми и ожидаемыми генотипами (в среднем по хозяйствам X2 = 0,42, P>0,05), что указывает на сохранение генного равновесия по локусу гена каппа-казеина.
Суммарная частота генотипов АА и АВ гена bPRL у костромской породы в целом составляет 58,96 %, причём в СПК «Гридино» она достигает 88,1 %.
В изученных выборках по AluI-маркеру гена bGH доминирует генотип L/L - от 73,8 до 95,0 %. Это самое высокое содержание среди отечественных пород КРС.
Следует отметить, что LL генотип гена bGH ассоциирован не только с высокими удоями коров и более вы-
соким содержанием жира и белка в молоке, но и с большим приростом массы тела, по сравнению с VL генотипом. Следовательно, большая частота его встречаемости в исследованных стадах указывает на возможность использования костромской породы для селекции в направлении мясной продуктивности.
По трём исследованным генам в костромской породе достоверных отличий, по величинам наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности не установлено. Однако для отдельныххозяйств распределение генотипов достоверно отличалось от ожидаемого. ОАО «Минское» и СПК «Гридино» по уровню гетерозиготности по генам CSN3 и bPRL резко отличались одно от другого. Так, в ОАО «Минское» отмечен избыток гетерозигот (по гену CSN3 D = 0,128, а по гену bPRL D = 0,148), а в СПС «Гридино» наблюдается их недостаток (по гену CSN3 D = -0,307, а по гену bPRL D = -0,034). При этом в целом в костромской породе уровень гетерозиготности соответствует ожидаемому.
У костромской породы КРС преобладает аллель А гена DGAT1 (61,2 %). Кроме того, она характеризуется высокой частотой генотипа АК по гену DGAT1 (35,4 %), ассоциированному с высокой жирностью молока, а также с более низким содержанием стеариновой кислоты, что предпочтительнее для получения высококачественного мяса.
Тестирование животных изучаемых выборок показало, что суммарная частота аллелей гена BoLA-DRB3, определяющих устойчивость к лейкозу, составила в целом по породе 35,9 %; ассоциированных с восприим-
Таблица 1. Частоты аллелей и генотипов генов cSN3, bPRl и bGH у ко-
Плем- предприятие Частоты аллелей (± s.e.*) Частоты генотипов (± s.e.) nexp D х2
CSN3
А В АА АВ (Hobs) ВВ
ОАО «Минское» 0,725 0,275 0,5± 0,45± 0,05 3 CD CD 0,128 0,652
± 0,102 ± 0,102 0,115 0,114 ± 0,05
СПК «Гридино» 0,405 0,595 0,238 0,334 0,428 0,482 -0,307 4,544
± 0,076 ± 0,076 ± 0,066 ± 0,073 ± 0,076
ГКПЗ «Лужки» 0,694 0,306 0,484 0,419 0,097 0,425 -0,014 0,008
± 0,059 ± 0,059 ± 0,063 ± 0,063 ± 0,038
ОАО 0,554 0,446 0,283 0,543 0,174 0,494 0,099 0,486
«Костромское» ± 0,073 ± 0,073 ± 0,066 ± 0,073 ± 0,055
В среднем 0,595 0,405 0,376 0,437 0,187 0,482 -0,093 0,420
± 0,078 ± 0,078 ± 0,078 bPRL ± 0,081 ± 0,055
А В АА АВ (Hobs) ВВ
ОАО «Минское» 0,868 ± 0,078 0,132 ± 0,078 0,737 ± 0,101 0,263 ± 0,101 0,0 0,229 0,148 0,505
СПК «Гридино» 0,667 0,333 0,452 0,429 0,119 0,444 -0,034 0,051
± 0,073 ± 0,073 ± 0,077 ± 0,076 ± 0,05
ГКПЗ «Лужки» 0,774 0,226± 0,581 0,387 0,032 0,35 0,106 0,391
± 0,053 0,053 ± 0,063 ± 0,062 ± 0,022
ОАО 0,755 0,245 0,574 0,362 0,064 0,37 -0,022 0,017
«Костромское» ± 0,063 ± 0,063 ± 0,072 ± 0,07 ± 0,036
В среднем 0,766 0,234 0,586 0,36 0,054 0,358 0,006 0,001
± 0,067 ± 0,067 1+ b 0, 0 7 00 ± 0,077 ± 0,036
V L VV VL (Hobs) LL
ОАО «Минское» 0,025 ± 0,036 0,975 ± 0,036 0,0 0,05 ± 0,05 0,95 ± 0,05 0,049 0,02 0,002
СПК «Гридино» 0,131 0,869 0,0 0,262 0,738 0,228 0,149 0,507
± 0,052 ± 0,052 ± 0,068 ± 0,068
ГКПЗ «Лужки» 0,081 0,919 0,0 0,161 0,839 0,149 0,081 0,097
± 0,035 ± 0,035 ± 0,047 ± 0,047
ОАО 0,043 0,957 0,0 0,085 0,915 0,082 0,037 0,011
«Костромское» ± 0,03 ± 0,03 ± 0,041 ± 0,041
В среднем 0,07 0,93 0,0 0,14 0,86 0,13 0,077 0,077
± 0,038 ± 0,038 ±0,052 ± 0,052
* s.e. - стандартная ошибка; Н - наблюдаемая гетерозиготность; Hep - ожидаемая гетерозиготность; D - коэффициент Селендера; х2 - критерий соответствия.
чивостью к лейкозу - 4,0 % (табл. 2). По сведениям ряда авторов [10], аллели BoLA-DRB3.2*7 и *11 оказывают положительный эффект на устойчивость КРС к клиническому маститу. Их суммарная частота у костромской породы также достаточно высока - 24,1 %.
Выводы. Таким образом, костромская порода характеризуется высоким содержанием следующих хозяйственно-ценных аллелей и генотипов:
В-аллеля каппа-казеина (до 40,5 %), определяющего сыродельческие качества молока;
генотипа L/L по гену гормона роста (86 %) , ассоциированного с высоким содержанием жира и белка в молоке и большим приростом массы тела;
генотипа АА по гену пролактина (58,6 %), ассоциированного с высоким содержанием белка в молоке;
генотипа АК по гену диацилглицирол-ацилтрансфера-зы-1 (35,4 %), ассоциированного с высокой жирностью молока, а также с низким содержанием стеариновой кислоты, что предпочтительнее для получения высококачественного мяса;
аллелей гена BoLA-DRB3, определяющих устойчивость к лейкозу (35,9 %) и клиническому маститу (24,1 %).
Уникальность костромской породы заключается в редком сочетании ценных генетических комплексов, одновременно обеспечивающих высокое качество продукции и высокий уровень устойчивости к заболеваниям. Ее генетический потенциал не исчерпан. Это одна из лучших отечественных пород, которая нуждается в бережном отношении к сохранению и дальнейшему усовершенствованию.
Литература.
1. Сидоренко В.А., Баранова Н.С. Костромичи и «Костромичка»: к 60-летию создания костромской породы крупного рогатого скота (1944-2004). - Кострома: ООО ”Костромаиздат”, 2004. - 160 с.
2. Лягин Ф.Ф., Бадин Г.А. Костромская порода крупного рогатого скота - наша марка. //В сб.: 60 лет костромской породе крупного рогатого скота: материалы юбилейной научно-практич. конф. Кострома, 2004. С. 58 - 67.
3. Баранов А.В. Генетическое маркирование и его использование при совершенствовании системы разведения молочного скота/Автореф. дис. д-ра с.-х. наук. М., 1997. 343с.
4. Хатами С.Р., Лазебный О.Е., Максименко В.Ф., Сулимова Г.Е. ДНК-полиморфизм генов гормона роста и пролактина у ярославского и черно-пестрого скота в связи с молочной продуктивностью//Генетика. - 2005. - Т. 41. - С. 229-236.
5. Thaller G., Кгдтег W., Winter A., Kaupe B., Erhardt G., Fries R. Effects of DGAT1 variants on milk production traits in German cattle breeds// JAnim Sci. - 2003. - V.81. - P.1911-1918
6. Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Шайхаев Г.О., Захаров И.А. ДНК-полиморфизм гена BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу // Генетика. - 1995. - Т. 31. - C. 1294-1299.
7. Chung E.R., Rhim T.J., Han SK. Associations between PCR-RFLP markers of growth hormone and prolactin genes and production traits in dairy cattle // Korean J. //Anim. Sci. - 1996. - V. 38. - P. 321-336.
8. Alipanah M., Kalashnikova L., Rodionov G. Association of prolactin gene variants with milk production traits in Russian Red Pied cattle // Iranian Journal of Biotechnology. - 2007. - V. 5. - N. 3. - P. 158-161.
9. Xu A., van Eijk M.J.T., Park C., and Lewin H.A. Polymorphism in BoLA-DRB3 Exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by Bovine Leukemia virus// J. Immunol. - 1993. - V. 151. - № 12. - P. 6977-6985.
10. Kulberg S., Heringstad B., Guttersrud O.A., Olsaker I. Study on the association of BoLA-DRB3.2 alleles with clinical mastiitis in Norvegian Red cows // J. Anim. Breed. Genet. - 2007. - V.124. - P. 201-207.
uniqueness of kostroma breed of cattle from a position of molecular genetics
Sulimova G.E., Lazebnaja I.V., Perchun A.V., Voronkova V.N., Ruzina M.N., Badin G.A.
Summary. Objective of this research - an estimation of genetic potential of Kostroma breed on the genes responsible for dairy and meat efficiency - kappa-casein genes (CSN3), prolactin (bPRL), a growth hormone (bGH) and diatsilglitserol-atsiltransferazy-1 (DGAT1), and alleles gene BoLA-DRB3 defining genetic stability cattle to leucosis and a mastitis
Researches spent on samples of cows of Kostroma breed of economy of "Luzhki", "Gridino", "Minsk" and bulls from "Kostroma" on breeding work. Testing A- and B-allele’s gene CSN3 spent by means of allele-specific PCR. DNA-polymorphism of genes bPRL, bGH, DGAT1 and BoLA-DRB3 investigated method PCR-PDRF.
Frequencies alleles and genotypes on investigated genes are defined. The high maintenance valuable alleles and genotypes of the investigated genes in the studied samples are shown:
- B-allele CSN3 (to 40,5%), determining the syrodelcheskie quality of milk;
- Genotype LL of a gene bGH (86,0%), associated with the high maintenance of fat and fiber in milk and a large increase of weight of a body;
- Genotype АА of a gene bPRL (58,1%), associated with the high maintenance of fiber in milk;
- Genotype АК of gene DGAT1 (35,4%), associated with a milk high fat content, and also with the low maintenance of stearic acid that is more preferable to reception of high-quality meat;
- alleles gene BoLA-DRB3, defining stability to leucosis (35,9%) and to a clinical mastitis (24,1%).
On the basis of the received results following conclusions are drawn:
1. Uniqueness of Kostroma breed consists in a rare combination of the valuable genetic complexes simultaneously providing high quality of milk and meat, and also high level of stability to diseases.
2. The genetic potential of Kostroma breed is not settled. It is one of the best domestic breeds and requires a solicitous attitude to preservation of its uniqueness and the further improvement.
Key words: cattle, Kostromskaya breed, milk productivity, meat productivity, DNA-markers, PCR-RFLP, BoLA-DRB3, kappa kasein, prolactin hormone, growth hormone, diacylglycerol-acyltransferase-1 genes, frequency of alleles and genotypes.
Таблица 2. Спектр частот аллелей гена BoLA-DRB3 в выборках коров костромской породы из ГКПЗ «лужки», СПК «Гридино», оАо «минское» и в
целом по породе
Частота аллеля
Аллель ГКПЗ «Лужки» СПК «Гридино» ОАО «Минское» Костромской КРС
Аллели, ассоциированные с устойчивостью к лейкозу
*7 0,146 0,063 0,132 0,114
*11 0,118 0,1 0,211 0,128
*28 0,064 0,2 0,105 0,118
Аллели, ассоциированные с восприимчивостью к лейкозу
*8 0,009 0,037 - 0,018
*22 - 0,037 0,053 0,022
Аллели, нейтральные по отношению к лейкозу
*1 - 0,088 0,158 0,057
*10 0,264 0,212 0,078 0,215
*12 0,018 0,013 0,105 0,031
*13 - 0,013 - 0,004
*15 0,045 - - 0,022
*17 0,009 - - 0,004
*18 0,009 - - 0,004
*20 0,055 - 0,026 0,031
*25 0,009 - - 0,004
*31 0,018 - - 0,009
*36 0,209 0,037 0,026 0,118
*37 0,018 - 0,053 0,018
*41 - 0,05 0,053 0,026
*43 0,009 - - 0,004
*48 - 0,037 - 0,013
*49 - 0,05 - 0,018
*51 - 0,063 - 0,022
