Аллельный анализ гена BoLA-DRB3 в стадах крупного рогатого скота Брянской области Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК - 575.174.015.3+575.113.2

АЛЛЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНА БоЬА-БЯБЗ В СТАДАХ КРУПНОГО РОГАТОГО

СКОТА БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ

И.А. Смазнова, А.Л. Козлов, В.В. Заякин, И.Я. Нам

Работа выполнена при поддержке грантов ФЦП № 02.740.11.0285, АВЦП № 2.1.1/224 и гранта

администрации Брянской области № 215.

В настоящей работе методом ПЦР-ПДРФ был проведен анализ аллельного полиморфизма гена ВоЬА-БИВЗ у крупного рогатого скота разных пород из нескольких хозяйств Брянской области. Выявлен спектр аллелей, связанных с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу. Полученные результаты будут использованы в хозяйствах в селекционной работе по формированию стада, устойчивого к лейкозу.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, лейкоз, главный комплекс гистосовместимости, ген БоЕЛ-БЕВЗ, аллельный анализ

ВВЕДЕНИЕ

Лейкоз - одно из наиболее опасных заболеваний крупного рогатого скота в нашей стране. Вирус лейкоза КРС наносит большой экономический ущерб в животноводстве из-за снижения продуктивности заболевших животных, уменьшения периода эксплуатации лактирующих больных коров на несколько лет, потерь от ограничений реализации племенного молодняка, утраты генофонда высокопродуктивных животных. Это заболевание по экономическому ущербу превосходит туберкулез и бруцеллез [1,2].

Согласно докладу Департамента ветеринарии удельный вес лейкоза составляет 57% в инфекционной патологии КРС в России, количество больных животных в хозяйствах РФ резко возросло с 1992 года по 2000 год (с 695.9 тыс. голов до 1257.5 тыс.). В 2001 г. на территории РФ зарегистрировано 2863 неблагополучных по лейкозу пункта, в ряде товарных хозяйств заболевание лейкозом КРС составляет до 40%, вирусоносительство - до 70%.

Установлено также что ретровирус типа С, вызывающий лейкозы у крупного рогатого скота, структурно и функционально сходен с вирусами НТЬУ-1, НТЬУ-П, вызывающими Т-клеточную лейкемию у человека, поэтому предполагается возможность заражения человека ВЛ КРС [3].

Для формирования в животноводческих хозяйствах оздоровленного по лейкозу поголовья КРС важнейшее значение имеет генетическая устойчивость к вирусу лейкоза. Результаты генетического анализа основных молочных пород КРС свидетельствуют о том, что животные почти всех пород при определенных условиях могут быть заражены вирусом ВЛКРС, но частота заболевания в значительной степени зависит от породы [4]. При этом инфицированные животные необязательно заболевают лейкозом, наблюдается явление вирусоносительство [5], когда вирус встраивается в геном хозяйской клетки и присутствует в организме в латентной форме [6].

Определяющую роль в устойчивости КРС к лейкозу играет главный комплекс гистосовместимости КРС ВоЬА [7, 8, 9, 10]. Ранее в работах Сулимовой Г.Е. [11,12], Глазко В.И. [13,14] было показано, что ГКГ коров содержит ген ВоЬА-БИВЗ, аллели которого отвечают за восприимчивость или устойчивость животного к вирусу лейкоза. Всего данный ген представлен в популяции черно-пестрых, айширских, голштино-фризских пород России примерно 60 аллелями, из которых 5 определяют устойчивость к вирусу, а 6 связаны с восприимчивостью, и их носители могут заболеть лейкозом. Ранее было показано, что устойчивость - доминантный признак, и если конкретная особь несет хотя бы одну копию аллеля, устойчивого к ВЛКРС, то животное не восприимчиво к лейкозу [5].

Целью данного исследования явилось изучение методом ПЦР-ПДРФ аллельного полиморфизма гена ВоЬА-БИВЗ у крупного рогатого скота разных пород из нескольких хозяйств Брянской области и выявление спектра аллелей, связанных с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Для исследования были использованы животные из пяти хозяйств Брянской области: СПК «Красный рог» Почепского района, СПК агрофирма «Культура», ОАО «Новый путь» и ООО «Снежка-Госома» Брянского района, а также частное стадо из Сельцо. В исследовании были использованы животные айширской, швицкой и черно-пестрой пород. Всего было

проанализировано 242 особи.

Выделение ДНК. ДНК животных выделяли из цельной крови коров с использованием гуанидинового метода [15].

Проведение ПЦР

Аллельные варианты гена ВоЬА-ОКВ3 изучали методом ПЦР-ПДРФ. Условия проведения ПЦР следующие: объем реакционной смеси составляет 50 мкл. В смесь вводятся dNTP - по 5 мкл (по 4 мМ каждого), смесь праймеров (НЬ03° и НЬ032) - 5 мкл (по 20 пМ каждого), ДНК-матрица - 2 мкл (1 мкг), ДНК-полимераза Taq - 0.5 мкл (2.5 ед.), вода - 17.5 мкл согласно [16, 17].

Температурный профиль реакции для анализа полиморфизма гена ВоЬА-БИВЗ:денатурация ДНК -94°С, 3 мин. - первый цикл, денатурация - 94°С, далее по 1 мин. Отжиг праймеров - 55-65°С, 1 мин., элонгация ДНК - 72°С, 60 сек. количество циклов - 30 - 35. Достраивание одноцепочечной формы ДНК -72°С - 5 мин.

Рестрикция и электрофорез

Для проведения рестрикционного анализа фрагмента гена ВоЬА-БЯВ3 длиной 284 п.о., полученного при амплификации, были использованы ферменты эндонуклеазы рестрикции Я8А1, В8ИУ и/или НаеШ. Объем образца для рестрикции составлял 20 - 30 мкл, при этом в пробу носили 5-10 мкл продукта ПЦР. Реакцию проводили в течение 1 часа при 37° С по стандартной методике, для гидролиза ДНК использовали 1-2 ед. активности ферментов. Останавливали реакцию перенесением образцов в морозильник (температура -20°С).

Продукты рестрикции анализировали электрофорезом в 9% полиакриламидном геле, соотношение акриламида и бисакриламида составляет 30:1. В качестве маркера молекулярного веса использовали гидролизат риС19/М8р1. На электрофорез наносили по 10-15 мкл реакционной смеси.

Напряжение электрического поля составляло 100-150 В, сила тока - около 150 мА, длительность электрофореза - 4-5 часов. ДНК визуализировали прокрашиванием геля в растворе этидий бромида.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Для проведения анализа гена ВоЬА-БИВ3 методом ПЦР-ПДРФ были использованы образцы крови, отобранные у животных из 5 хозяйств (табл.1).

Таблица 1.

Распределение проанализированных использованные для анализа животные из разных хозяйств

№ Название хозяйства Порода Кол-во особей

1 ОАО «Новый путь» Черно-пестрая 63

2 СПК «Агрофирма «Культура» Черно-пестрая 61

3 ООО «Снежка - Госома» Черно-пестрая 31

4 Частный скот из п. Сельцо Айрширская 47

5 СПК «Красный Рог» Швицкая 40

Распределение индивидуальных аллелей гена ВоЬА-ОКВ3 различается в стадах изученных

хозяйств (табл. 2).

В целом по проанализированной выборке животных с наибольшей частотой представлены аллели *7, *8, *11, *23, *24, из них аллели *7, *11 и *23 связаны с устойчивостью, а аллели *8 и *24 — с чувствительностью к лейкозу.

При этом в хозяйстве ОАО «Новый путь» (черно-пестрая порода) по частоте выделяются аллели *8, *11, *23, *24, в хозяйстве СПК «Агрофирма «Культура» (черно-пестрая порода) -аллели *11, *23, *24, в хозяйстве ООО «Снежка-Госома» - аллели *11 и *23, среди частного скота из Сельцо (айширская порода) — аллель *7, в СПК «Красный рог» (швицкая порода) — аллели *7 и *8. Частота аллеля *11 составила в ОАО «Новый путь» 14,29%, в ОАО «Культура» - 10,66%, в Сельцо — 20,97%. Частота аллеля *23 составила в ОАО «Новый путь» 15,08%, в СПК «Агрофирма «Культура» - 18,03%. Доля аллеля *23 низка в стаде из Сельцо, а в СПК «Красный рог» (швицкая порода) данный аллель не обнаружен. Доля аллеля *7 составила 39,36% в стаде из Сельцо и 23,75% в СПК «Красный рог». В других стадах доля данного аллеля была низкой.

Что касается аллелей чувствительности, то некоторые из них имели высокую частоту: доля аллеля *8 в ОАО «Новый путь» составила 9,52%, а в СПК «Красный рог» - 13,75%. Аллель *24 не был обнаружен в стаде из хозяйства СПК «Красный рог», тогда как в других хозяйствах его доля была довольно высока: в ОАО «Новый путь» - 13,49%, в СПК «Агрофирма «Культура» - 12,3% в

стаде из Сельцо — 9,68% и в СПК «Красный рог» - 9,57%. Остальные аллели, которые не связаны с устойчивостью или чувствительностью КРС к лейкозу и являющиеся нейтральными, распределены в стадах более-менее равномерно.

В то же время в хозяйствах, в которых разводится одна и та же порода КРС, наблюдается различие в распределении аллелей и их разнообразии. Так в хозяйстве СПК «Агрофирма «Культура» не обнаружены аллели *12, *14, и *30, присутствующие в других двух хозяйствах. В то же время в стаде этого хозяйства найдены аллели *17 и *18, которых не было выявлено в двух других хозяйствах. Стада хозяйств ОАО «Новый путь» и СПК «Агрофирма «Культура» характеризуются наибольшим числом представленных индивидуальных аллелей.

Большое значение имеет гомозиготность или гетерозиготность по аллелям, связанным с устойчивостью к лейкозу. Так, животные, несущие хотя бы один аллель устойчивости (в гетерозиготном состоянии), не заболевают лейкозом.

Анализ распределения аллелей по генотипам представлен на рис. 1. Показана большая доля аллеля устойчивости в гомозиготном состоянии в стаде айширской породы. В стаде швицкой породы из СПК «Крансый Рог» не обнаружены генотипы УЧ.

В хозяйстве ОАО «Новый путь» обнаружено более высокое по сравнению по сравнению с другими хозяйствами количество животных, несущих аллели чувствительности в гомозиготном состоянии. Близкая ситуация сложилась в хозяйствах ООО «Снежка-Госома» и СПК «Красный рог». Так как аллель устойчивости является доминантным, то было проанализировано соотношение генотипов, образованных с участием аллеля устойчивости, с генотипами, не имеющими этот аллель (рис.2).

60 50 40

20 10 о

1 2 3 4 5

Хозяйства

Рис. 1. Распределение аллелей устойчивости и чувствительности гена ВоЬА-БКБЗ по генотипам в изученных стадах

КРС

1 — ОАО «Новый путь», 2 — СПК «Агрофирма «Культура», 3 — ООО «Снежка-Госома»,

4 — частное стадо из Сельцо , 5 — СПК «Красный рог».

В хозяйстве ОАО «Новый путь» обнаружено более высокое по сравнению по сравнению с другими хозяйствами количество животных, несущих аллели чувствительности в гомозиготном состоянии. Близкая ситуация сложилась в хозяйствах ООО «Снежка-Госома» и СПК «Красный рог». Так как аллель устойчивости является доминантным, то было проанализировано соотношение генотипов, образованных с участием аллеля устойчивости, с генотипами, не имеющими этот аллель (рис.2).

В четырех хозяйствах обнаружена высокая доля генотипов с аллелем устойчивости по сравнению с генотипами, не несущими данные аллели. В СПК «Красный рог» соотношение генотипов несколько другое. В этом хозяйстве доля генотипов с аллелем устойчивости низка и незначительно отличается от других генотипов.

■ УУ

□ УЧ

□ УН

□ нн

■ нч

□ чч

■ УХ □нн □нч □чч

1 2 3 4 5

Хозяйства

Рис. 2. Соотношение генотипов устойчивых, нейтральных и чувствительных к вирусу лейкоза животных в

изученных стадах

1 — ОАО «Новый путь», 2 — СПК «Агрофирма «Кульутра», 3 — ООО «Снежка-Госома», 4 — частное

стадо из Сельцо, 5 — СПК «Красный рог».

Полученные данные позволяют сделать вывод о различиях в генетической устойчивости поголовья разных пород и в разных хозяйствах. Устойчивость в изученной выборке черно-пестрой породы формируется преимущественно аллелями *11 и *23 в отличие от айширской и швицкой породы, где устойчивость обеспечивается преимущественно аллелем *7. Схожие результаты были обнаружены ранее на животных хозяйств Московской области в работах лаборатории сравнительной генетики животных Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН [4,5].

Таким образом, проведенное исследование выявило различие в распределении аллелей гена BoLA-DRB3 у особей различных пород крупного рогатого скота и в различных хозяйствах. Результаты генетического анализа переданы специалистам по селекционной работе в хозяйства и будут использованы при формировании поголовья, устойчивого к лейкозу.

Таблица 1.

Частоты аллелей гена BoLA-DRB3 в исследованных стадах некоторых хозяйств Брянской области

№ аллеля Хоз яйства Всего

1 '• 2=> 3* 4* 55

ГЬ [16] По [18] Ч астота, % хг Ч астота, % хг Ч астота, % хг Частота, % X* Частота, % X' Частота, % хг

*1 0,79 2,91 - - - - - - 2,5 1,45 0,62 2.21

*2*> 31463*1301 0,79 2,91 1 ,64 1.53 - - 1,06 4.3 1.25 3,06 1.03 1.59

*3" Э(4ВЗ*1001 0,79 2,91 2,46 0,7 - - - - - - 0,83 1.89

*4 - - 1 ,64 1.53 - - - - - - 0,41 2,56

*6 0,79 2,91 8,2 3,9 - - - - - - 2,27 0,34

3(4834)201 2,38 0,89 4.1 0 4,84 0,5 30.36 1 75,42 23.75 64,94 13.84 33,14

*8- 3(403*1201 9,52 6,16 0.82 2,69 1 ,61 3,83 1,06 4.3 13.75 13,69 5.37 1.25

*1О7- Э(4ВЗ*1е01 5,56 0,34 5,74 0,59 1 ,61 3,83 1 ,06 4.3 6,25 0,19 4,34 0,3

*11* Э(4ВЗ*0901 14.29 22,72 10.66 10,11 20.07 30,68 4,26 0.64 2,5 1,45 10.33 14,69

*1 2 0,79 2,91 - - 1,61 3,83 4,26 0,64 7,5 0,95 2,48 0,22

*13 2,38 0,89 - - - - - 2.5 1.45 1.03 1.59

*1 4 1,59 1,75 - - 1,61 3.83 - - - - 0,62 2.21

*15 6,35 0,92 1,64 1.53 12.9 5,83 3,19 1.5 1,25 3,06 4,55 0,44

*16' Э(4ВЗ*1501 1,59 1.75 3,28 0,19 - - 2,13 2,72 2.5 1.45 2.07 0,48

*1 7 - - 0,82 2,69 - - - - - - 0,21 2,93

*18 - - 2,46 0,7 - - 2.13 2.72 10 4,26 2,69 0.13

*19 0,79 2,91 0,82 2,69 - - 4,26 0.64 - - 1.24 1.32

*20 5,56 0,34 4.1 0 8,06 0,29 2,13 2.72 1.25 3.06 4,13 0.19

*21 - - 0,82 2,69 3,23 1,78 - - 5 0,01 1,45 1.07

«22- Э(4ВЗ*1101 6,35 0,92 5,74 0,59 8,06 0,29 - - 6,25 0.19 5.17 1.01

*23* ^63*2701 15.08 26,49 18.03 46,14 14.52 9,24 8,51 0.82 - - 11.08 22,45

*247, ЭРВЗ’0101 13.40 19,23 12.3 15,86 9,68 1,36 9,57 1.77 - - 9.71 12,2

*25 0,79 2,91 3,28 0,19 - - 6,38 0 1.25 3,06 2.48 0,22

*26 0,79 2,91 4.1 0 - - - - 3,75 и ,44 1,86 0,65

*27 - - - - - - - - 2,5 1 ,45 0,41 2,56

*28* Э (4634)701 3,97 0,03 4.1 0 1,61 3,83 8,51 0.82 1.25 3,06 4,13 0.19

*30 1,59 1.75 - - 3,23 1.78 - - - - 0.83 1.89

*36 3,97 0,03 0,82 2,69 6,45 0,01 2.13 2,72 - - 2,48 0,22

*39 - - 1,64 1.53 - - - - 5 0,01 1.24 1.32

О «с - - 0,82 2.69 - - - - - - 0.21 2.93

Эсего 100 107,4 100 101.2 100 70,9 100 206,0 100 107,2 100 114.2

ОАО «Новый путь» - черно-пестрая, 2) ОАО «Культура» - черно-пестрая, 3) ООО «Снежка» -черно-пестрая, 4) частное подворье Сельцо - айширская, 5) ООО «Красный рог» - швицкая, 6) аллели устойчивости, 7) аллели чувствительности. Для аллелей устойчивости и чувствительности приведена номенклатура по [18].

Allelic polymorphism of BoLA-DRB3 gene in cattle breeds from different farms of the Bryansk region has been carried out by PCR-RFLP. Spectrum of resistance and susceptibility alleles has been determinated. Results obtained will be used to composite cattle leucosis resistance herd.

The key words: cattle, leucosis, major histocompatibility complex, BoLA-DRB3 gene, allelic assay.

Список литературы

1. Гулюкин М.И. Научные основы профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин, Г.А. Симонян, Н.В. Замараева, Л.А.Макарова и др. // Труды ВИЭВ. Т. 72. М.: ВИЭВ, 1999. С.38-47.

2. Коровин Р.Н. Построение обобщенного показателя оценки эпизоотической ситуации / Коровин Р.Н., Богданов А.И., Борисенкова А.Н. //Доклады РАСХН. 2002. Т.2. С.54-55.

3. I. Schwartz, D. Levy. Pathology of bovine leukemia virus // Vet. Res. 1994. V.25. P. 521536.

4. Удина И.Г., Карамышева E.E., Сулимова Г.Е., Павленко С.П., Туркова С.О., Орлова А.Р., Эрнст Л.К. Сравнительный анализ айширской и черно-пестрой пород крупного рогатог скота помаркерам гитсосовместимости // Генетика. 1998. Т.34. №12. С. 1668-1674.

5. Удина И.Г., Карамышева Е.Е., Туркова С.О., Орлова А.Р., Сулимова Г.Е. Генетические механизмы устойчивости и чувствительности к лейкозу у айширской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота, установленные на основе распределения аллелей гена BoLA-DRB3 // Генетика. 2003. Т. 39. №3. С. 383-396.

6. M L Mirsky, C Olmstead, Y Da, H A Lewin. Reduced bovine leukaemia virus proviral load in genetically resistant cattle // Animal Genetics. 1998. V.29 P.245-252

7. Harris A. Lewin, George C, Russell, Elizabeth L Glass. Comparative organization and function ofthe major histocompatibility complex of domesticated cattle. // Immunological reviews. 1999. V. 167. P. 145-158.

8. J. E. Beever, H. A. Lewin, W. Barendse, L. Andersson, S. M. Armitage, C. W. Beattie, B. M. Burns, S. K. Davis, S. M. Kappes, B. W. Kirkpatrick, R. Z. Ma, R. A. McGraw, R. T. Stone, J. F. Taylor. Report of the First Workshop on the Genetic Map of Bovine Chromosome 23. // Animal genetics. 1996 V.27. P. 69-75

9. Xu A., Van Eijk M.J.T., Park Ch., Lewin H.A. Polymorphism in BoLA-DRB3 exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus // J. Immunol. 1993. V. 151. P. 6977-6985

10. M. A. Juliarena, M. Poli, L. Sala, C. Ceriani, S. Gutierrez, G. Dolcini, E. M. Rodriguez, B. Marino, C. Rodri'guez-Dubra and E. N. Esteban. Association of BLV infection profiles with alleles of the BoLADRB3.2 gene. // Animal genetics. 1998. V.39. P.432-438

11. Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Шайхаев Г.О., Захаров И.А. ДНК-полиморфизм гена BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу // Генетика. 1995. Т. 31. №9. С. 1294- 1299.

12. Эрнст Л.К, Сулимова Г.Е., Орлова А.Р., Удина И.Г., Павленко С.П. Особенности распространения антигенов BoLA-A и аллелей гена BoLA-DRB3 у черно-пестрого скота в связи с ассоциацией с лейкозом. // Генетика. 1997. Т.33. №1. С. 87-95.

13. Облап Р.В., Глазко В.И., Созинов А.А. Вирус бычьего лейкоза и диагностика

инфицированных животных. // Цитология и генетика. 1997. Т.31. С. 41 - 43.

14. Глазко, В.И. ДНК - технологии животных. Киев. 1997. 173 с.

15. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M. Rapid and simple method for purification of nucleic

acids // J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. P. 495 - 503.

16. Van Eijk M.J.T., Stewart-Haynes J.A., Lewin H.A. Extensive polymorphism of the BoLA-DRB3 gene distinguished by PCR-RFLP // Anim. Genetics. 1992. V. 23. P. 483-496.,

17. Xu A., Van Eijk M.J.T., Park Ch., Lewin H.A. Polymorphism in BoLA-DRB3 exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus // J. Immunol. 1993. V. 151. P. 6977-6985.

18. C. J. Davies, L. Andersson, S. A. Ellis, E. J. Hensen, H. A. Lewin, S. Mikko, N. E. Muggli-Cockett, J. J. van der Poel, G. C. Russell. Nomenclature for factors of the BoLA system, 1996: report of the ISAG BoLA Nomenclature Committee // Animal Genetics. 1997. V.28. P. 159-168

Об авторах

Смазнова И.А.- Брянский государственный университет имени академика. И.Г. Петровского, ¡уапаш 1 @yandex. ги

Козлов А.Л.- Брянский государственный университет имени академика. И.Г. Петровского, ¡уапаш [email protected]

Заякин В.В.- Брянский государственный университет имени академика. И.Г. Петровского, ¡уапаш [email protected]

Нам И.Я.- Брянский государственный университет имени академика. И.Г. Петровского, ¡уапаш 1 @yandex.гu