CC BY
0УДК 633.63:575.2
doi.org/10.24412/2413-5518-2024-3-30-33
Молекулярные вариации гена устойчивости к мучнистой росе РМЯ5 у генотипов сахарной свёклы
Т.П. ФЕДУЛОВА, д-р биолог. наук (e-mail: biotechnologiya@mail.ru) Т.С. РУДЕНКО, мл. научн. сотрудник
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»
Введение
Главным направлением селекции сахарной свёклы является создание гетерозисных гибридов, устойчивых к био- и абиотическим стрессорам. В настоящее время во многих регионах наблюдается снижение урожайности культуры, обусловленное развитием различных болезней, что может стать одним из основных факторов, лимитирующих развитие сахарной отрасли.
Мучнистая роса сахарной свёклы — одно из опасных заболеваний, вызываемое облигатным паразитом Erysiphe betae, который поражает надземные органы растений первого и второго года жизни. На поражённых тканях формируется мучнистый налёт белого цвета. Болезнь распространена повсеместно в регионах выращивания. Она усиливает транспирацию растений, нарушает процессы синтеза сахаров и других органических соединений, ухудшает отток пластических веществ в корнеплод. Поражённые листья быстро стареют, снижаются урожайность корнеплодов (на 20—30 %) и семян, сахаристость (на 1—5,3 %), а также всхожесть семян (на 11—38 %). Ухудшаются количественные и качественные показатели урожайности. Возбудитель зимует в виде клейстотециев на остатках поражённых растений, на поверхности почвы. Болезнь интенсивно развивается при резких колебаниях влажности (60—95 %) и температуры воздуха, особенно в условиях сухой и жаркой погоды, когда средняя температура воздуха достигает 25—35°.
Сегодняшние методы селекции основаны на комплексном использовании классических методов и разработанных к настоящему времени молекулярных маркеров, позволяющих выявлять и идентифицировать интересующие селекционеров локусы и гены. В последнее время в зарубежных странах молекулярные маркеры широко интегрированы в селекционные программы по устойчивости. Так, гены устойчивости к мучнистой росе были установлены у устойчи-
вых к этому заболеванию образцов Beta v. ssp. maritima в США. Два генотипа этого вида — WB 90 и WB 242, проявившие высокую устойчивость, были затем использованы в селекционных программах при гибридизации с сахарной свёклой для повышения её устойчивости к этому заболеванию. Устойчивость обоих образцов определялась одним доминантным геном, обозначенным одинаково как Pm [1—3]. Вместе с тем идентичность генов устойчивости у данных образцов не была доказана. У генотипа WB 242 была установлена связь гена Pm с молекулярно-генетическим маркером, и ген Pm был картирован на хромосоме II [4]. С использованием AFLP-маркеров у устойчивых к мучнистой росе растений удалось установить 5 доминантных генов устойчивости Pm2 — Pm6. Ген Pm3 обеспечивал полную устойчивость к мучнистой росе, другие же гены — высокий уровень устойчивости или частичную устойчивость. Доступность этих генов даёт хорошую возможность для достижения долговременной устойчивости к мучнистой росе, уменьшая необходимость химического контроля.
Одним из аспектов специализации хозяина патогена является проникновение через клеточную стенку хозяина, что является основным барьером для инфекции. Мутация в гене PMR5 сделала ара-бидопсис устойчивым к видам мучнистой росы, вызываемой грибами Erysiphe cichoracearum и Erysiphe orontii. PMR5 принадлежит к специфичным для растений генам с функцией устойчивости к данному заболеванию. РМЛ5-опосредованная резистентность не требует передачи сигналов через пути защиты ни салициловой кислоты, ни жасмоновой кислоты (этилена); это позволяет предположить, что устойчивость может быть связана с потерей фактора восприимчивости или с активацией новой формы защиты. На основании инфракрасного анализа с преобразованием Фурье клеточные стенки PMR5 были обогащены пектином и демонстрировали пониженную степень
Ш0М
20 ле
енсивного-
30 САХАР № 3 • 2024
ил
модификации пектина по сравнению с клеточными стенками дикого типа [5, 6].
Цели исследований:
— выявить гены устойчивости к мучнистой росе в современных гибридах сахарной свёклы;
— осуществить поиск однонуклеотидных замен (SNP) в данных генах;
— выделить устойчивые к мучнистой росе генотипы сахарной свёклы.
Материалы и методы исследований
В качестве материалов для исследований были использованы поражённые и не поражённые мучнистой росой растения сахарной свёклы гибридов: Баккара (Sesvanderhave) — позиционирован производителем как устойчивый генотип; Льговский МС 17 (ЛОСС), РМС 137 и РМС 503 (ВНИИСС).
Выделение геномной ДНК из растительной ткани осуществлялось наборами фирмы ООО «Синтол» (г. Москва). Качество выделенной НК определено путём электрофореза в 1%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Полученная ДНК растворялась в 10 мМ трис-НС1-буфера, рН 8,0, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, и использовалась для ПЦР-анализа. Полимеразно-цепная реакция проводилась на амплификаторе «Genius» (Великобритания) [7].
Специфические праймеры на ген устойчивости к мучнистой росе PMR5 сконструированы нами в программе Primer Blast (NCBI). Молекулярно-генетиче-ские экспериментальные исследования выполнены в трёхкратной биологической повторности.
Классическая полимеразно-цепная реакция реализована на амплификаторах Genius (Великобритания) и SimpliAmp (By life technologies, Сингапур). Условия проведения ПЦР оптимизировали в соответствии с характеристиками используемых праймеров:
Pm1 F: 5' CGGACAGCATTCCAGACCAT 3' Tm 58 оС
Pm1 R: 5' TCATCAGCATAAGCCGGGTC 3' Tm 58 °C
Результаты исследований и их анализ
Для выявления устойчивых к мучнистой росе образцов сахарной свёклы и изучения молекулярно-генетического полиморфизма гена устойчивости к мучнистой росе PMR5 было проведено исследование четырёх генотипов с использованием специфического праймера Pm1 F/R. Ген локализован на второй хромосоме, содержит два экзона (Beta vulgaris subsp. vulgaris protein trichome birefringence-like 19 (L0C104905453), NCBI). У всех генотипов сахарной свёклы выявлен ДНК-фрагмент с ожидаемой длиной 280 п.н. (рис. 1), это подтверждает наличие искомой последовательности у изученных гибридов.
M
Рис. 1. Идентификация генотипов сахарной свёклы на наличие гена устойчивости к мучнистой росе Pmr5. Дорожки: 1 — Баккара (не поражён); 2 — Льговский МС 17 (поражён); 3 — Льговский МС 17 (не поражён); 4 — РМС 503 (поражён); 5— РМС 503 (не поражён); 6 — РМС 137 (поражён); 7 — РМС 137 (не поражён). М — маркер молекулярных масс ДНКStep50plus, 50—1500 п.н. (Biolabmix, РФ)
Для выявления молекулярных вариаций изучаемого гена все полученные ампликоны были про-секвенированы. Результаты прочтения нуклеотид-ных последовательностей проанализированы в программе MEGA 11. Исследуемые образцы сравнивались с контрольным номером из базы данных NCBI (Gene ID, XM_010694008.4; LOC104905453), который является устойчивым к данному заболеванию. В результате выравнивания нуклеотидных последовательностей выявлены однонуклеотидная замена (SNP) в позиции 1021 C/T (рис. 2). В частности, однонуклео-тидный полиморфизм обнаружен в гене PMR5 у двух гибридных образцов сахарной свёклы: Льговский МС 17 и РМС 503. Что интересно, в полевых условиях данные растения были поражены мучнистой росой. В гене растений гибрида РМС 137, как поражённых, так и непоражённых, не обнаружены SNP. Можно предположить, что однонуклеотидная замена в позиции 1021 C/T свидетельствует о предрасположенности данных генотипов к заражению мучнистой росой.
Следует отметить, что данные исследования носят поисковый характер и будут продолжены в плане выявления значимых однонуклеотидных замен (SNPs) в гене устойчивости к мучнистой росе PMR5 с включением большего количества исследуемых образцов сахарной свёклы. Использование молекулярно-ге-нетических маркеров позволит отбирать исходные и селекционные материалы, устойчивые к данному заболеванию.
Заключение
Таким образом, в результате молекулярно-генети-ческих экспериментов нами сконструирована специфическая пара праймеров Pm1 F/R для тестирования контрастных генотипов сахарной свёклы на наличие
№ 3 • 2024 САХАР
3l
20 леш интенсивного развития №
4 GGGAGTAGTGTACTTGAGGACTTTTGTTCCAGGCCACTTTGAAGGGGGTGAGTGGGATAA 1020 XM_010694008.4
GGGAGTAGTGTACTTGAGGACTTTTGTTCCAGGCCACTTTGAAGGGGGTGAGTGGGATAA 1020 7 GGGAGTAGTGTACTTGAGGACTTTTGTTCCAGGCCACTTTGAAGGGGGTGAGTGGGATAA 1020
3 GGGAGTAGTGTACTTGAGGACTTTTGTTCCAGGCCACTTTGAAGGGGGTGAGTGGGATAA 1020
2 GGGAGTAGTGTACTTGAGGACTTTTGTTCCAGGCCACTTTGAAGGGGGTGAGTGGGATAA 1020
6 GGGAGTAGTGTACTTGAGGACTTTTGTTCCAGGCCACTTTGAAGGGGGTGAGTGGGATAA 1020
5 GGGAGTAGTGTACTTGAGGACTTTTGTTCCAGGCCACTTTGAAGGGGGTGAGTGGGATAA 1020
1 GGGAGTAGTGTACTTGAGGACTTTTGTTCCAGGCCACTTTGAAGGGGGTGAGTGGGATAA 1020
************************************************************
1021
4 TGGTGGTGATTGTTTGAAGAAAAGCCCCTATAAAAGCAATGAGGTACATTTGGAAGGAGA 1080 XM_010694008.4 CGGTGGTGATTGTTTGAAGAAAAGCCCCTATAAAAGCAATGAGGTACATTTGGAAGGAGA 1080
7 CGGTGGTGATTGTTTGAAGAAAAGCCCCTATAAAAGCAATGAGGTACATTTGGAAGGAGA 1080
3 CGGTGGTGATTGTTTGAAGAAAAGCCCCTATAAAAGCAATGAGGTACATTTGGAAGGAGA 1080
2 TGGTGGTGATTGTTTGAAGAAAAGCCCCTATAAAAGCAATGAGGTACATTTGGAAGGAGA 1080
6 CGGTGGTGATTGTTTGAAGAAAAGCCCCTATAAAAGCAATGAGGTACATTTGGAAGGAGA 1080
5 CGGTGGTGATTGTTTGAAGAAAAGCCCCTATAAAAGCAATGAGGTACATTTGGAAGGAGA 1080
1 CGGTGGTGATTGTTTGAAGAAAAGCCCCTATAAAAGCAATGAGGTACATTTGGAAGGAGA 1080
4 AACTTTGGAACTGTACACAGCCCAAATGCAGGAGTTCAGGGAGGCCCAAGGATTGGCCCA 1128 XM_010694008.4
AACTTTGGAACTGTACACAGCCCAAATGCAGGAGTTCAGGGAGGCCCAAGGATTGGCCCA 1128
7 AACTTTGGAACTGTACACAGCCCAAATGCAGGAGTTCAGGGAGGCCCAAGGATTGGCCCA 1128
3 AACTTTGGAACTGTACACAGCCCAAATGCAGGAGTTCAGGGAGGCCCAAGGATTGGCCCA 1128
2 AACTTTGGAACTGTACACAGCCCAAATGCAGGAGTTCAGGGAGGCCCAAGGATTGGCCCA 1128
6 AACTTTGGAACTGTACACAGCCCAAATGCAGGAGTTCAGGGAGGCCCAAGGATTGGCCCA 1128
5 AACTTTGGAACTGTACACAGCCCAAATGCAGGAGTTCAGGGAGGCCCAAGGATTGGCCCA 1128
1 AACTTTGGAACTGTACACAGCCCAAATGCAGGAGTTCAGGGAGGCCCAAGGATTGGCCCA 1128
************************************************************
4 ACAACGTGGGTTGAGTTTTCGACTCCTTGATATGACCCGGCTTATGCTGATGAA......1200
XM_010694008.4 ACAACGTGGGTTGAGTTTTCGACTCCTTGATATGACCCGGCTTATGCTGATGAGGCCCGA 1200
7 ACAACGTGGGTTGAGTTTTCGACTCCTTGATATGACCCGGCTTATGCTGATGAA---- -- 1200
3 ACAACGTGGGTTGAGTTTTCGACTCCTTGATATGACCCGGCTTATGCTGATGAAA-- -- 1200
2 ACAACGTGGGTTGAGTTTTCGACTCCTTGATATGACCCGGCTTATGCTGATGA..... -- 1200
6 ACAACGTGGGTTGAGTTTTCGACTCCTTGATATGACCCGGCTTATGCTGATGAA---- -- 1200
5 ACAACGTGGGTTGAGTTTTCGACTCCTTGATATGACCCGGCTTATGCTGATGAA---- -- 1200
1 ACAACGTGGGTTGAGTTTTCGACTCCTTGATATGACCCGGCTTATGCTGATGAA---- -- 1200
Рис. 2. Выравнивание нуклеотидных последовательностей семи растений сахарной свёклы, полученных с праймером Pm1 F/R. Дорожки: 1 — Баккара (не поражён); 2 — Льговский МС17 (поражён); 3 — Льговский МС17 (не поражён); 4 — РМС 503 (поражён); 5 — РМС 503 (не поражён); 6 — РМС 137(поражён); 7 — РМС 137 (не поражён). М — маркер молекулярных масс ДНКStep50plus, 50—1500 п.н. (Biolabmix, РФ). Звёздочкой обозначены идентичные участки. Голубым цветом выделены однонуклеотидные замены.
гена устойчивости к мучнистой росе PMR5. Выявлены молекулярные вариации в данном гене у семи генотипов сахарной свёклы.
Список литературы
1. Lewellen, R.T. Inheritance of Powdery Mildew Resistance in Sugar Beet Derived from Beta vulgaris subsp. Maritima / R.T. Lewellen, J. K. Schrandt // Plant Dis. -2001. - № 85. - Р. 627-631.
2. El-Mageed, A. Evaluation of powdery mildew disease resistance of eight sugar beet varieties using agronomic traits and ISSR markers / A. El-Mageed // Env. Biodiv. Soil Security. - 2022. - Vol. 6. - P. 91-101.
3. Bolton, M. First Report of QOI-insensitive Powdery Mildew (Erysiphe polygoni) on Sugar Beet in the United States / M. Bolton, O. Neher // Plant Dis. - 2014. - V. 98 (7):1004. doi: 10.1094/PDIS-12-13-1217-PDN.
4. Janssen, G.J.W. Mapping of resistance genes of powdery mildew (Erysiphe beta) in Sugar Beet / G.J.W. Janssen, M. Nihlgard, T. Kraft // Int. J. - 2003. -105. - P. 448-451.
5. PMR5, an acetylation protein at the intersection of pectin biosynthesis and defense against fungal pathogens / D. Chiniquy, W. Underwood, J. Corwin [et al.] // The Plant Journal. - 2019. - V. 100. -P. 1022-1035.
ИМ
20 ле
енсивного
32 САХАР № 3 • 2024
ил
ISSN 2413-5518
Выходит в свет с 1923 г.
Оформить подписку на журнал «Сахар» в бумажной версии на 2024 г. можно по ссылке: https://podpiska.pochta.ru. Подписная цена с учётом доставки зависит от региона. Минимальный срок подписки — 1 месяц
ВАРИАНТЫ ПОДПИСКИ НА 2024 г. (6 номеров в год): бумажная версия:
3 через электронный каталог «Почта России»
по адресу: https://podpiska.pochta.ru (наш индекс П6305).
Подписная цена зависит от региона доставки; 3 через редакцию (заявка на sahar@saharmag.com)
цена 1000 р. за 1 номер, 6000 р. за год самовывозом; цена с доставкой через «Почту России» 1300 р. за 1 номер, 7800 р. за год
PDF-версия журнала (подписка через редакцию): для России, стран ближнего и дальнего зарубежья — 1200 р. за 1 номер, 7200 р. за 1 год.
Адрес редакции: 121069, Россия, г. Москва, Скатертный пер., д. 8/1, стр. 1. Тел/факс: +7 (495)690-15-68; +7 (985)769-74-01; е-mail: sahar@saharmag.com Бухгалтерия: +7 (495)695-45-67; e-mail: buh@saharmag.com; официальный сайт: www.saharmag.com; страница в «Вконтакте»: www.vk.com/saharmag
6. Whole Genome Re-Sequencing and Characterization of Powdery Mildew Disease-Associated Allelic Variation in Melon / S. Natarajan, H. Kim, S. Thamilarasan [et al.] // PLoS One. - 2016. - № 11 (6): e0157524. doi: 10.1371/ journal.pone.0157524.
7. Efficient and nontoxic DNA isolation method for PCR analysis / A.S. Hussein, A.A. Nalbandyan, T.P. Fedulova, N.N. Bogacheva // Russian Agricultural Sciences. — 2014. — V. 40 (3). — P. 177—178.
Аннотация. В статье рассматриваются результаты тестирования гибридов сахарной свёклы отечественной и зарубежной селекции на наличие гена устойчивости к мучнистой росе PMR5. В результате проведённых исследований выявлены молекулярные вариации в данном
гене у семи генотипов сахарной свёклы. Однонуклеотидная замена (SNP) обнаружена в гене PMR5 у двух гибридных образцов сахарной свёклы: Льговский МС 17 и РМС 503 в позиции 1021.
Ключевые слова: сахарная свёкла, мучнистая роса, гены устойчивости, однонуклеотидные замены, гибриды, специфические праймеры.
Summary. The article contains the results of an analysis of the presence of sugar beet hybrids of domestic and foreign selection for gene resistance to powdery mildew PMR5. As a result of the research, molecular variations in this gene were identified in seven sugar beet genotypes. A single nucleotide substitution (SNP) was found in the PMR5 gene in two hybrid sugar beet samples: Lgovsky MS 17 and RMS 503 at position 1021.
Keywords: sugar beet, powdery mildew, resistance genes, single-nucleotide substitutions, hybrids, specific primers.
№ 3 • 2024 САХАР
33
20 лет интенсивного развития №
Ш0М
