CC BY
9@ HILLESHÖG®
ТЕХНОЛОГИЯ ВЫСОКИХ УРОЖАЕВ
УДК 633.63:575.174.015.3 doi.org/10.24412/2413-5518-2021-11-47-49
Вариации гена SE2 Beta vulgaris L.S
Т.П. ФЕДУЛОВА, д-р биолог. наук, вед. научн. сотрудник (e-mail: biotechnologiya@mail.ru) А.С. ФОМИНА, мл. научн. сотрудник
А.А. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук, ст. научн. сотрудник
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»
ь
ф к
«Б
I м го ^ S- S
¡2 <5
Введение
Сахарная свёкла подвергается различным болезням. Загнивание корнеплодов в кагатах происходит под действием не одного какого-либо возбудителя, в этом процессе принимают участие многие виды грибов и бактерий. Преобладание того или иного вида зависит от многих факторов [1]. Микробиологическое разрушение свекловичной ткани приводит к кагатной гнили, основными возбудителями которой являются плесневые грибы рода Fusarium. Фу-зариоз — заболевание, вызываемое представителями этого рода, проявляется образованием на поверхности корня (главным образом в верхней его части) мицелия розового или жёлтого цвета.
Fusarium oxysporum является одним из разрушительных патогенных микроорганизмов, вызывающих значительные потери урожая сахарной свёклы, и поэтому выявление устойчивых форм культуры имеет решающее значение для селекции. Большую проблему для сахарной свёклы представляют такие заболевания, как фузариозное увядание и фузариозная корневая гниль, вызываемые широко распространёнными и вредоносными грибами F. oxysporum и F. solani [2]. Известно, что ключевую роль в иммунных реакциях растений играют гены устойчивости (Л-гены). Подбор молекулярно-генетических маркеров к Л-генам для выявления устойчивых генотипов достаточно сложен, так как устойчивость к данному заболеванию характеризуется полигенным наследованием (QTL) и находится под контролем многих генов, расположенных в разных группах сцепления [3—5]. У растений формируется и опосредованный ответ на воздействие неблагоприятных биотических факторов. Так, для противостояния различным патогенным организмам, продуцирующим хитин, растения экспрес-сируют хитиназу, являющуюся катализатором деградации хитина, что приводит к обезвреживанию патогена. Несмотря на отсутствие генов-кандидатов для этой культуры, опосредованные гены устойчивости, например отвечающие за работу хитиназ, могут быть ключевыми для идентификации генов устойчивости к фузариозу сахарной свёклы [6]. Активность изофер-ментов хитиназы (ЕС 3.2.1.14) коррелирует с патоген-
ной инфекцией и, следовательно, может играть важную роль в механизмах защиты растений в клетках корня или листьев против различных фитопатогенов, включая F. oxysporum. Так, в листьях сахарной свёклы были идентифицированы две изоформы кислой хитиназы — SE1 и SE2, но только одна из них, SE2, проявляет экзохитиназную активность и способна эффективно гидролизовать хитоолигосахариды. Подобно SE2 гликозилированная изоформа хитиназы SP2 также способна участвовать в процессах защиты сахарной свёклы от фитопатогенов [7]. Кислые хити-назы заслужили пристальное внимание в связи с их эффективностью в широком диапазоне применения, в том числе в качестве биоконтролирующего средства против растительных патогенных грибов [8, 9].
Методика
Материалом для выявления генов устойчивости к биотическим стрессорам служили растения сахарной свёклы отечественной и зарубежной селекции. Семена анализируемых образцов Beta vulgaris L. выращивали в горшках диаметром 15 см, заполненных грунтом, при комнатной температуре. Для эксперимента использовали листовой аппарат. Выделение ядерной ДНК из растительной ткани осуществляли при помощи 20 % SDS и 3,5 М ацетата аммония, а также наборов для выделения ДНК (ООО «Синтол») [10]. Качество выделенной ДНК было определено путём электрофореза в 1%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Полученная ДНК растворялась в 10 мМ трис-НС1-буфера, рН 8,0, содержащем 0,1 мМ ЭДТА, и использовалась для ПЦР-анализа. Классическая полимеразно-цепная реакция была проведена на ам-плификаторе «Genius» (Великобритания). Условия проведения ПЦР-реакции оптимизировали в соответствии с характеристиками используемых прайме-ров. В работе был применён специфический праймер FusAl F/R на ген, контролирующий работу кислой хитиназы (F: AGCTACCTTTGGTAACGGGC3- / R: 5GCAGTGCTTAAGCTGGCATC3) [11]. Праймер сконструирован в программе Primer BLAST (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Секвени-рование полученных ПЦР-ампликонов проведено
№ 11 • 2021 САХАР 47
MARI ВО®
your partner in sugar beet-
www. ma ri boseed .com/russia
ГИБРИДЫ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ
@ HILLESHÖG
www.hilleshog.com/ru
ТЕХНОЛОГИЯ ВЫСОКИХ УРОЖАЕВ
MARI ВО
your partner in sugar beet..
на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500 (Thermo Fisher Scientific Inc., США).
Результаты
Для подтверждения связи гена SE2, локализованного на хромосоме 3 и контролирующего стабильную экспрессию кислой хитиназы, с устойчивостью сахарной свёклы к корневой гнили проведено геноти-пирование 10 образцов сахарной свёклы с использованием молекулярного маркера FusAl F/R. Выявлено по 2 ДНК-фрагмента длиной 600 и 400 п. н. во всех исследуемых генотипах, кроме растений дикой свёклы Beta comUiflom Zoss. (рис. 1). Это свидетельствует о гетерозиготности образцов по данному локусу, растения же дикой свёклы являются устойчивыми гомозиготами. Дикие формы культурных растений традиционно вызывают интерес у селекционеров при отборе на устойчивость к болезням, так как являются носителями аутосомной доминанты и при расщеплении будут сохранять её. Гетерозиготы же образуют гаметы, из которых часть будет носителем рецессивных аллелей, часть — доминантных.
Для более детального изучения и выявления новых однонуклеотидных замен (SNPs) некоторые ампли-коны (№ 1, 9, 10) были просеквенированы по методу Сэнгера.
Результаты прочтения нуклеотидных последовательностей обнаруженных ДНК-фрагментов были
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MK-
проанализированы в программе SnapGene. При выравнивании нуклеотидных последовательностей исследуемых генотипов с геном контрольного устойчивого генотипа (GenBank № HQ709091.1 NCBI) в селекционном № 9 (гибрид иностранной селекции, Sh.1) было обнаружено 8 SNPs (3 (T/C, 2 C/G, A/G, G/A, C/T) и 3 однонуклеотидные вставки (ну-клеотид А) в сравнении с растениями дикого вида B. corroliflora Zoss. и образцом № 1 (F:19170), которые позиционируются как селекционные материалы, устойчивые к фузариозной гнили. Примечательно, что данный генотип (Sh.1) и в полевых, и в лабораторных условиях проявлял признаки заражённости. На рис. 2 представлен фрагмент генетического анализа по Сэнгеру, где наглядно продемонстрировано положение вышеописанных однонуклеотидных замен и вставок.
Таким образом, основываясь на результатах моле-кулярно-генетических исследований, можно предположить, что идентифицированные нами однонуклеотидные замены являются nonsynonimus, т. е. кодируют другую аминокислоту, что ведёт к изменениям в аминокислотном составе пептида. Следствием этого является экспрессия функционально иного белка и инактивация исходного.
Выводы
В результате молекулярно-генетических исследований гена SE2 (контролирующего работу кислой хитиназы) идентифицированы 8 однонуклеотидных замен (3 T/C, 2 C/G, A/G, G/A, C/T) и 3 однонуклеотидные вставки (нуклеотид А) в селекционном № 9 (Sh.1). Можно заключить, что данные однонуклеотидные замены могут приводить к преодолению устойчивости (путём замены аминокислотной единицы в полипептиде) и, как следствие, снижению адаптационной способности растений. Таким образом, созданный нами праймер Fus1F/R можно рекомендовать для оценки селекционного материала сахарной свёклы на устойчивость к фузариозной гнили.
Рис. 1. ПЦР-фрагменты, полученные с праймером FusA1 F/R. Обозначения образцов: 1 - F119170, 2 - F119176, 3 - МС10039, 4 - МС11018, 5 - ОП19172, 6 - ОП19179, 7 - Н.1, 8 - М.1, 9 - 10 - дикая свёкла В. согюН/1от Zoss., М - маркер молекулярных масс ДНКGeneRuler™ (7Ъегто5аепК/1с, США), К- (ПЦР-смесь без ДНК)
Список литературы
1. Kagami, H. Sugar beet (Beta vulgaris L.) / H. Kagami, M. Kurata, Н. Matsuhira // Methods Mol. Biol. - 2015. -V. 1223. - P. 335-347.
2. Molecular markers for improving control of soil-borne pathogen Fusarium oxysporum in sugar beet / De C. Lucchi, P. Stevanato, L. Hanson [et al.] // Euphytica. - 2017. -V. 213:71.
3. Francis, S. Exploitation of novel sources of disease resistance in Beta germplasm using molecular markers / S. Francis, M. Asher // J Sugar Beet. - 2000. - V. 37. -P. 89-95.
4. Fank, A. Nucleotide-binding resistance gene signatures in sugar beet, insights from a new reference genome /
- 48 САХАР № 11 • 2021
@ HILLESHOG
www.hilleshog.com/ru
MARI ВО® ГИБРИДЫ
САХАРНОЙ СВЕКЛЫ
your partner in sugar beet.
www.mariboseed.com/russia
@ HILLESHÖG
ТЕХНОЛОГИЯ ВЫСОКИХ УРОЖАЕВ
Identity
1. BvSE2 2F 2R
TGTAACAGTCTGAGCAGTGACATCAAAACATGCCAАСAGGC AGGCATT AAGG TABTHHTHTBTAT AGGA
2. Ген F405;_FusA F;_C5 TGT A^AG TBTG AGI
3. Ген F600;_FusA F;_C4 TGTA^AGTBTGAGI
4. Ген FD;_FusA F;_G4 TGTA^AGTBTGAGI
5. Ген I405;_FusA F;_A5 TGTA^AGTBTGAGI
6. Ген I600;_FusA F;_E4 TGTA^AGTBTGAGI Identity
AGTGA AGTGA IAGTGAI AGTGA
ATCAAAA ATCAAAA ATBAAAGI ATCAAAA
;ATG CCAACAGGCAGGC ATT AAGG TACTC CT IATGCIA.A ACAGGCAGGCAT T A AGG TACT ; ATG C CA ACAAAA AGGlAT T A AGG TGlT ; ATGC CA ACAGGC AGGCATT AAGGTGCT
T C T AT AGG A TCT AT AGG A TCT AT AGG A
ITCT AT AGG A
;AGTGACATCAAAACATGC CA AC AGGC AGGCAT T AAGGTGCT ■TCTCTAT AGG A
1. BvSE2 2F 2R GGTGGTGl
2. Ген F405;_FusA F;_C5 GGT GG TG
3. Ген F600;_FusA F;_C4 GGT GG TG
4. Ген FD;_FusA F;_G4 GGT GG T
5. Ген I405;_FusA F;_A5 GGTGGTGl
6. Ген IH600;_FusA F;_E4 GGTGGTG Identity
GGAGGBTATTC TCT T TBBTCA ACBG A TGA T GCAAACA CAT TT G CT GA TTA GGAGGBTATTC TCT T TBB TCA ACBG A TG A T GCA A ACA CAT TT'G CT G A T T A G GAG GBT A T TBTBT T "TBBTBA ABBG A TG A T GCA A ACA CAT TT G CT G A TT A GGAGGBTATTC TCT T TBB TCA ACBG A TG A T GCA A ACA CAT TT G CTG A TT A
|GGAGGBT ATT^BCT GGAGGCTATT
TCCTCAACCGA TGA T GCAAACA CAT TT G CT GA TTA TBBTBAACCG A TGA T GCAAACA CAT TT G CTG A T T A
TGGAAC TGGAAC TGGAAC GGAAC GGAAC GGAAC
ACTTATCTTGGGGGT ACTTATCTTGGGG ACTTATCTTGGGG
AGTBBAGBABBBGACeBTTGGAGAT GCAGTTTT GGA.TGG T ATT GATT TUG AT
TATTGATT TBIG AT
1. BvSE2 2F 2R
2. Ген F405;_FusA F;_C5 _ _
3 Ген F600 FusA F- C4 AC TTATBTTGGGGGTBAG T С С A G С A С С С G A СС С С T T G G A G A T GCAGTTTT GGA.TGGTATTGATTTBIGAT
4. Ген FD;_FusA F;_G4 AATTATCTAGGGGGTCAG T CCAGBA GCCGACCCCT T GG AG AT GMGTTTT GGA.TGG T ATT GATT TBG AT
5. Ген IH405;_FusA F;_A5 AHT T A THTBG GAG GTl AG T С С AGBA GMG AB—TTGG AG AT GCAGTTTT GGA.TGGTATTGATTTBIGAT
6. Ген I600;_FusA F;_E4 ABT T A THTBG GAG GTl AG TBAGBA GUG A ■■■TTGG AG AT GCAGTTTT GGA.TGGTATTGATT TIG AT
Identity
1. BvSE2 2F 2R АВВСВСВСВССВСИССВВСВВВЩСССДСВВИ АСВИСВСИИВС СВИС С—В—С С ИИС
2. Ген F405;_FusA F;_C5 А ТИС А С А СТ С СТ С А ТССИАС А Т Т Т ТС ССА Т С АСС Т АСВТ АС А СИА Т Т ССВАССТ СА Т А АС ААТ ССТ ВВ С
3. Ген F600;_FusA F;_C4 А ТИСА СА СТ С СТ СА ТССИАСА ТТТТСССАДС АСС Т АСВТ АС А СЩА Т Т ССВАССТ ВА Т ААВААТССТ ВАС
4. Ген FD; FusA F; G4 АТИСАСАСТ ССТ САТССИАСА ТТТТСССА.ТС АССТ АСВТ АС А СИА ТТ ССВАССВИА Т А АИААТ ССТ С А С
5. Ген Ш405;_FusAF;_A5 А ТИС А СА СТ С СТ СА ТССИАСА ТТТТСССАДС АССТ АСВТ АС А СИА Т Т ССВАССТВАВА АТ ААТ ССТ ВАС
6. Ген Ш600;_FusA F;_E4 А ТИС А С А СТ С СТ С А ТССИАС А Т Т Т ТС ССА Т С АСС Т АСВТ АС А СИА Т Т ССВАССТ СА С А АТ ААТ ССТ ВА С
Рис. 2. Фрагмент локализации SNPs в генотипах: Г119170 (на фото № 2, 3), Sh.1 (на фото № 5, 6) и В. соггоЩот Zoss. (на фото № 4)
A. Fank, P. Galewski, M. McGrath // The Plant Journal. -2018. - V. 95. - P. 659-671.
5. Urbach, J. The NBS-LRR architectures of plant R-proteins and metazoan NLRs evolved in independent events / J. Urbach, F. Ausubel // Proc. Nath. Acad. Sci. USA. - 2017. - V. 114. - P. 1063-1068.
6. Sekhwal, M. Disease Resistance Gene Analogs (RGAs) in Plants / M. Sekhwal, L.P. Pingchuan, I. Lam [et al.] // Int. J. Mol. Sci. - 2015. - V. 16. - P. 19248-19290.
7. Yerzhebayeva, R. Two sugar beet chitinase genes, BvSP2 and BvSE2, analysed with SNP Amplifluor-like markers, are highly expressed after Fusarium root rot inoculation and field susceptibility trial / R. Yerzhebayeva, A. Abekova, K. Konysbekov [et al.] // Peer J. - 2018. - V. 6. - P. 2-19.
8. Nagpure, A. Chitinases: in agriculture and human healthcare / A. Nagpure, B. Choudhary, R. Gupta // Critical Reviews in Biotechnology. - 2014. - V. 34. - Is. 3. -P. 215-232.
9. Walker, J.C. Plant Pathology. Third Edition / J.C. Walker. - NY : McGraw-Hill Book, 1969.
10. Efficient and nontoxic DNA isolation method for PCR analysis / A.S. Hussein, A.A. Nalbandyan, T.P. Fedulova, N.N. Bogacheva // Russian Agricultural Sciences. - 2014. -V. 40. - Is. 3. - P. 177-178.
11. Basic local alignment search tool / S. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. Myers // J. Mol. Biol. - 1990. - V. 215(3). -P. 403-410.
Аннотация. Цель работы - конструирование и апробация специфического праймера FusA1F/R для изучения гена SE2, контролирующего экспрессию кислой хитиназы. Материалом для исследования служили растения сахарной свёклы отечественной и зарубежной селекции. Ген SE2 локализован на хромосоме 3, контролирует стабильный уровень работы кислой хитиназы.Генотипировано 10 образцов сахарной свёклы с использованием молекулярно-генетического маркера FusA1F/R. Были выявлены по 2 ДНК-фрагмента длиной 600 и 400 п. н. во всех исследуемых генотипах, кроме растений дикой свёклы (Beta corolliflora Zoss.). Идентифицированы 8 однонуклеотидных замен (3 T/C, 2 C/G, A/G, G/A, C/T) и 3 однонуклеотидные вставки (нуклеотид А) в растениях селекционного № 9 (Sh.1). Ключевые слова: сахарная свёкла, фузариоз, ген устойчивости, однонуклеотидные замены, специфические праймеры.
Summary. The aim of this work is designing and testing a specific primer FusA1F/R for studying the SE2 gene, which controls the expression of acidic chitinase. The material for the study were sugar beet plants of domestic and foreign breeding. The SE2 gene is localized on chromosome 3 and controls a stable level of acidic chitinase activity. 10 sugar beet samples were genotyped using the molecular-genetic marker FusA1F/R. Identified 2 DNA fragments 600 bp and 400 bp in all studied genotypes, except for wild beet plants (Beta corolliflora Zoss.). 8 single nucleotide polymorphism (3 T/C, 2 C/G, A/G, G/A, C/T) and 3 single nucleotide insertions (nucleotide A) were identified in plants of breeding № 9 (Sh.1).
Keywords: sugar beet, fusariosis, resistance gene, single nucleotide substitutes, specific primers.
№ 11 • 2021 САХАР 49
MARI ВО ГИБРИДЫ HILLESHÖG
your partner in sugar beet САХАРНОЙ CRFK/lhl ^^
www.mariboseed.com/russia \»»#»/\#Л I I I V/r I V* U I— IX/ I L/l www.hilleshog.com/ru
