CC BY
23УДК 633.63:631.52
doi.org/10.24412/2413-5518-2022-4-46-49
Молекулярно-генетическая оценка нового исходного материала Beta vulgaris L.
А.С. ХУССЕЙН, канд. биолог. наук
Е.Н. ВАСИЛЬЧЕНКО, ст. научн. сотрудник(е-mail: vasilchenko@inbox.ru)
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова»
Введение
В настоящее время основным направлением в селекции большинства сельскохозяйственных растений является создание гетерозисных Fl-гибридов на основе подбора и скрещивания гомозиготных родительских линий. Традиционный метод создания гомозиготных линий для двулетней культуры B. vulgaris L. — самоопыление и отбор на протяжении минимум 4—6 поколений, что требует 8—12 лет [1]. Длительное время, необходимое для выведения родительских линий, — один из существенных недостатков в селекции Fl-гибридов. Технологии производства удвоенных гаплоидов позволяют сократить процесс формирования чистых линий свёклы до 3—5 лет [2]. В числе значительных преимуществ данных технологий — возможность добиться полной гомози-готности в одном поколении, а также проявление рецессивных аллелей у гаплоидных растений, замаскированных в гетерозиготном состоянии у диплоидных растений, что облегчает выявление, оценку и отбор растений с полезными признаками. Удвоенные гаплоиды сельскохозяйственных растений производят in vitro в культуре изолированных микроспор, пыльников, неоплодотворённых семязачатков и др.
Среди технологий создания удвоенных гаплоидов B. vulgaris наиболее распространённой является технология культивирования неоплодотворённых семязачатков (гиногенез) [3]. Этот приём позволяет получить гомозиготные генетически стабильные линии (DH-линии) по таким селекционно-значимым признакам, как раздельноплодность, стерильность, фертильность и др. Полученные дигаплоидные DH-линии нуждаются в молекулярно-генетической оценке на ранних этапах развития. Поэтому цель данной работы заключалась в разработке технологии создания дигаплоидых (DH) линий сахарной свёклы в культуре in vitro, их молекулярно-генетическое изучение и отбор по признакам стерильности и фер-тильности.
Материалы и методы
Исследования проведены на базе ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» (ВНИИСС).
Объектом исследований являлись родительские компоненты диплоидного гибрида сахарной свёклы РМС 129: МС-линия и закрепитель стерильности О-типа РФ8 (Рамонская фертильная), предоставленные лабораторией селекции на основе ЦМС.
Для получения гаплоидов в качестве эксплантов использовали неоплодотворённые семязачатки, изолированные из семенных растений с высокой степенью раздельноплодности (99 %) в период бутонизации и начала цветения. В качестве стерилизующего агента использовали 10%-ный раствор Жавелиона, время экспозиции 35 мин. Семязачатки, изолированные в стерильных условиях под микроскопом, помещали в жидкую питательную среду. Затем экспланты, прошедшие дифференциацию, культивировали на твёрдой агаризованной среде (агар 7 г/л) с добавлением ауксинов и цитокининов в разных сочетаниях (6-бен-зиламинопурин, кинетин, гиббереллин, нафтилук-сусная кислота) [4].
Удвоение набора хромосом проводилось путём субкультивирования in vitro развитых гаплоидных микроклонов на питательной среде с добавлением стерильного 0,01%-ного раствора колхицина.
Корневая система формировалась при культивировании микроклонов на среде с содержанием нафтил-уксусной кислоты (1 мг/л). Регенеранты культивировали при температуре 24—26 °С в течение 16-часового фотопериода с освещённостью 5000 люкс и относительной влажностью воздуха 70 %. Плоид-ность образцов определяли на проточном цитометре (Partec, Германия) согласно рекомендуемому протоколу [5].
ДНК выделяли из растений-микроклонов, полученных путём прямой регенерации, с использованием наборов для выделения геномной ДНК (ЗАО «Син-тол»). Качество образцов ДНК оценивали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле, концентрацию определяли с использованием набора HS QubitR (ThermoFisherScientific, США). ПЦР осуществляли на приборе SimpliAmp (ThermoFisherScientific, США).
Протокол ПЦР:
1) предварительная денатурация 94 °C в течение 4 мин;
2) далее 35 циклов: денатурация 94 °C — 40 сек; отжиг — 40 сек; элонгация при 72 °C — 40 сек;
46 САХАР № 4 • 2022
ж
ГС
УЖгЖи
www.nt-prom.ru
СПОНСОР ВЫПУСКА
3) заключительная элонгация при 72 °C — 10 мин.
Состав ПЦР-смеси: 1хПЦР - буфер, 2,5 мМ MgCl2, по 0,2 мМ смеси dНТФ, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы, ДНК 500 нг, праймеры 0,5мкМ. Список использованных праймеров приведён в таблице.
Секвенирование полученных продуктов амплификации осуществляли по методу Сэнгера на генетическом анализаторе ABI PRISM 310 (Life technologies, США). Результаты прочтения нуклеотидных последовательностей анализировали в программе Mafft, версия 7 [6].
Результаты и обсуждение
Результаты экспериментальных исследований позволили разработать технологию создания DH-линий сахарной свёклы, которая включает в себя трёхлетний цикл проведения биотехнологических и селекционных мероприятий [7].
На первом этапе в период бутонизации и начала цветения растения отбирали по признакам раз-дельно-сростноцветковости, габитусу куста (хорошо обсеменённые, многостебельчатые растения). В качестве доноров эксплантов использовали преимущественно побеги центрального колоса кистевидной части плейохазия. Цитологические исследования позволили отобрать генотипы с высокой степенью фер-тильности и стерильности пыльцевых зёрен. Оценка растений с использованием проточной цитофотоме-трии позволила определить степень плоидности донорского материала. Индуцирование регенерантов из неоплодотворённых семязачатков осуществляли в жидкой питательной среде. Процесс стабилизации отобранных нормально развитых гаплоидных регене-рантов проводили с использованием микроразмножения на агаризованных средах в культуре in vitro.
Следующий этап включал в себя диплоидизацию гаплоидного материала путём колхицинирования, стабилизацию колхицинированных растений-реге-нерантов, отбор по биохимическим и молекулярно-генетическим признакам и формирование DH-линии в культуре in vitro.
Заключительным этапом технологии явилось укоренение дигаплоидных линий в культуре in vitro, выращивание штеклингов и семенных растений в закрытом грунте и получение семян DH-линий.
Применимая технология дала возможность получить генетически и морфологически выровненный материал в два-три раза быстрее, минуя многократное самоопыление растений.
Для создания гомозиготных линий сахарной свёклы на основе гаплоидов большое значение имел отбор генотипов с ценными селекционными признаками. Известно, что в популяциях сахарной свёклы присутствуют растения с нормальной и стерильной цитоплазмой. У ^растений пыльца фертиль-ная и жизнеспособная, у S-растений она может быть как фертильной, так и стерильной в зависимости от взаимодействия стерильной цитоплазмы с рецессивными аллелями (г/1 и г/2) ядерного гена — восстановителя фертильности. ЦМС является результатом сложного взаимодействия определённых ядерных и митохондриальных генов [8]. Одним из наиболее известных и изученных генетических факторов, участвующих в проявлении признака ЦМС, является именно данный мультилокусный ген восстановления фертильности (Я/), супрессор митохондриальных генов, вызывающих стерильность пыльцы [9].
Существуют и другие важные генетические факторы, которые на сегодняшний день недостаточно изучены. Одним из них является митохондриаль-ный ген nad1 (BevupMp038, субъединица 1 НАДН-дегидрогеназы), кодирующий НАДН: субъединицу Н убихинон оксидоредуктазы. Экспрессия данного гена вносит значительный вклад во взаимодействие ядерного и митохондриального геномов. С использованием маркеров для гена nad1 проведён анализ ди-гаплоидных растений-регенерантов сахарной свёклы как фертильных, так и стерильных форм (рис. 1).
Во всех образцах обнаружен фрагмент ДНК размером 400 п. н. Полученные ампликоны были отсекве-нированы, выравнивание последовательностей показало их идентичность, за исключением однонуклео-тидного полиморфизма. В митохондриальном геноме растений гаплоидных линий сахарной свёклы был впервые описан однонуклеотидный полиморфизм (SNP), позволивший классифицировать микроклоны на фертильные и стерильные формы. Показано, что у всех образцов с фертильной пыльцой, т. е. у носителей доминантного аллеля ядерного гена Я/7, произошла замена нуклеотида С (цитозин) на Т (тимин), при
Характеристика использованных в работе праймеров
Праймер Последовательность 5'/3' Т , °С m' ссылка
TR1 F AGAACTTCGATAGGCGAGAGG R GCAATTTTCAGGGCATGAACC 59 Nishizawa et al., 2000
TR3 F AGATCCAAACAGAGGGACTG R CGGATCACCCTATTCATTTG 56 Nishizawa et al., 2000
nadlB F TTTCTCTTTATGGATAACCAATTCA R AGGATTCCTTTTGTAACCCAAT 55 Soranzo et al., 2003
№ 4 • 2022 САХАР 47
VA
СПОНСОР ВЫПУСКА wü
www.m-prom.ru
К1 К1-1 К2 К2—1 К2—2 КЗ К3-1К3-2К3-3
Рис. 1. Электрофореграмма фрагментов ДГ-регенерантов с использованием маркеров к гену nadl. К1 — контрольные фертильныерастения, КЗ — контрольные стерильные растения; К1-1, К2, К2-1, К2-2 — формы с нормальной (N) цитоплазмой; КЗ-1, КЗ-2, КЗ-З — формы со стерильной (S) цитоплазмой. М — маркеры молекулярных масс (ДНК— маркер MassRuler™, 80-1031 п. н. «Thermo Scientific», США). Размер ампликона — 400 п. н.
этом у всех гаплоидных стерильных форм обнаруживался только нуклеотид С. Данный приём исследований позволил в ускоренном режиме создавать гомозиготные линии с ценными признаками (в частности, ЦМС) для включения их в селекционный процесс при создании высокопродуктивных гибридов.
Изучение генетического полиморфизма мито-хондриального генома Beta vulgaris проводили с использованием высоковариабельных тандемных повторов — минисателлитов. В результате ранее проведённых исследований были обнаружены и описаны четыре локуса тандемных повторов (TRI, TR2, TR3 и TR4) в митохондриальном геноме сахарной свёклы. Семейство минисателлитов TR состоит из тандемных повторов длиной 30—32 п. н., количество которых варьировало от 2 до 13 среди исследованных генотипов свёклы [10]. Было показано, что маркеры TR1 и TR3 сцеплены с генами, контролирующими ЦМС. В связи с этим нами был проведён анализ полученных растений-регенерантов с использованием указанных выше праймеров.
Амплификация ДНК-образцов с праймером TR1 выявила фрагменты длиной 700 п. н. у гаплоидных форм О-типа, длиной 400 п. н. — у гаплоидных МС-форм. У образца под № 10 обнаружили оба вышеуказанных ампликона (рис. 2).
У образца под № 10 проявились оба фрагмента, и с определённостью отнести его к МС- или О-типу нельзя. Российскими авторами показано, что как N-, так и Svulg-специфичные маркеры повсеместно присутствуют в цитоплазмах растений как с оуэнов-ским плазмотипом, так и с плазмотипом, обеспечивающим формирование фертильной пыльцы. Данные, полученные авторами, свидетельствуют в пользу сосуществования митохондриальных геномов N-
и Svulg-типов в пределах митохондрий растений одной линии [11].
Амплификация ДНК с праймером TR3 выявила наличие фрагментов длиной 500 п. н. у гаплоидных форм О-типа, длиной 400 п. н. — у гаплоидных МС-форм. У образца № 9 ДНК-фрагментов не обнаружено (рис. 3).
Известно, что минисателлиты широко используются для оценки полиморфизма митохондриального генома. Предположительно, это и объясняет неоднородность паттернов образцов под № 9 и 10, полученных при амплификации с разными минисателлитами семейства TR.
В результате молекулярно-генетических исследований можно констатировать, что данные праймеры позволяют на ранних этапах разделять гаплоидные растения-регенеранты на МС- и О-тип формы, что имеет важную теоретическую и практическую значимость для селекции. Исключение составляют образцы № 10 (два фрагмента при амплификации с маркером TR1) и 9 (нет продукта амплификации с маркером TR3).
Заключение
В итоге научных изысканий создана технологическая схема ускоренного получения удвоенных линий (гомозигот) — компонентов высокопродуктивных гибридов. Из четырёх DH-линий Beta vulgaris получены семена, которые применяются при размножении суперэлиты мужскостерильного компонента гибрида РМС 129. По результатам молекулярного-генетического анализа в геноме гаплоидных растений-реге-
700 пн
1 23 456 789 10 11 12 КМ
\400_пн
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР с использованием праймера TR1. Дорожки: 1—5, 12 — гаплоидныерегенеранты опылителя О-типа; 6—9, 11 — МС-регенеранты (гаплоиды); 10 — гаплоид (микс). М — маркер молекулярных масс ДНК GeneRuler™, 100—3000п. н. (ThermoScientific, США). К— отрицательный контроль (стерильная вода вместо ДНК). Размеры бендов — 700 и 400 п. н.
48 САХАР № 4 • 2022
Ж
ГС
ушши
www.nt-prom.ru
СПОНСОР ВЫПУСКА
500 пн
Рис. 3. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов с использованием маркера ТЯ3. Дорожки: 1—5, 12 — гаплоидныерегенеранты опылителя О-типа; 6—9, 11 — МС-регенеранты (гаплоиды); 10 — гаплоид. М — маркер молекулярных масс ДНК GeneRuler™, 100—3000 п. н. (ThermoScientific, США). К— отрицательный контроль (стерильная вода вместо ДНК). Размеры бендов — 500 и 400 п. н.
нерантов выявлена однонуклеотидная замена (SNP), позволившая разделить их на фертильные и стерильные формы. Установлено, что митохондриальные минисателлитные маркеры (TR1 и TR3) позволяют отнести гаплоидные растения-регенеранты к МС-или О-тип формам.
Сочетание методов биотехнологии и молекулярной генетики с приёмами традиционной селекции даёт возможность получать новый селекционный материал для создания отечественных гибридов сахарной свёклы нового поколения.
6. Katoh, K. A simple method to control over-alignment in the MAFFT multiple sequence alignment program / K. Katoh, D. Standley // Bioinformatics. — 2016. — Vol. 32. - No. 13. - P. 1933-1942. DOI org/10.1093/ bioinformatics/btw108
7. Жужжалова, Т.П. Пути воспроизведения нового организма сахарной свёклы в культуре in vitro / Т.П. Жужжалова, О.А. Подвигина, В.В. Знаменская // Энциклопедия рода Beta. Биология, генетика и селекция свёклы : Сб. науч. тр. Института цитологии и генетики СО РАН. — Новосибирск : Сова, 2010. - С. 403-419.
8. Unusual and Typical Features of a Novel Restorer-of-Fertility Gene of Sugar Beet (Beta vulgaris L.) / H. Matsuhira, H. Kagami, M. Kurata [et al.] // Genetics. - 2012. - Vol. 192. - P. 1347-1358. DOI https://doi. 10.1534/genetics.112.145409
9. A fertility-restoring genotype of beet (Beta vulgaris L.) is composed of a weak restorer-of-fertility gene and a modifier gene tightly linked to the Rf1 locus / T. Arakawa, D. Uchiyama, T. Ohgami [et al.] // PLoS ONE. - 2018. -Vol. 13. - No. 6. - P. 1-20. DOI 10.1371/journal. pone.0198409
10. Nishizawa, S. Variable number of tandem repeat loci in the mitochondrial genomes of beets / S. Nishizawa, T. Kubo, T. Mikami // Current Genetics. - 2000. -Vol. 37. - P. 34-38. DOI 10.1007/s002940050005
11. Анализ гетероплазматического состояния мито-хондриальной ДНК фертильных и мужскостерильных растений сахарной свёклы (Beta vulgaris) / А.Г. Бра-гин, М.К. Иванов, Л.А. Федосеева, Г.М. Дымшиц // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2011. -Т. 15. - № 3. - С. 585-590.
Список литературы
1. De La Fuente, G.N. Accelerating plant breeding / G.N. De La Fuente, U.K. Frei, T. Lübberstedt // Trends Plant Sci. - 2013. - Vol. 18. - P. 667-672. DOI 10.1016/ j.tplants.2013. 09.001.
2. Biotechnological methods as a tool for efficient sugar beet breeding / T.P. Zhuzhzhalova, E.O. Kolesnikova, E.N. Vasilchenko, N.N. Cherkasova // Vavilov Journal of Genetics and Breeding. - 2020. - Vol. 24 (1). - P. 40-47. DOI 10.18699/VJ20.593
3. Klimek-Chodacka, M. Comparison of haploid and doubled haploid sugar beet clones in their ability to micropropagate and regenerate / М. Klimek-Chodacka, R. Baranski // Electron. J. Biotechnol. - 2013. - Vol. 16. -No. 2. - P.1-12. DOI 10.2225/ vol16-issue2-fulltext-3
4. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе / Р.Г. Бутенко. -М. : ФБК-ПРЕСС, 1999.
5. An Efficient High-throughput Flow Cytometric Method for Estimating DNA Ploidy Level in Plants / А. Cousin, K. Heel, W. Cowling, М. Nelson // Cytometry. - 2009. - No. 75 A. - P. 1015-1019.
Аннотация. Цель исследований заключалась в разработке технологии создания дигаплоидых (DH) линий сахарной свёклы в культуре in vitro и их молекулярно-генетическом изучении. Установлено, что ДНК-маркеры митохондриального генома сахарной свёклы, относящиеся к семейству минисателлитов TR (TR1 и TR3), позволяют с высокой эффективностью выявлять гаплоидные микроклональные растения МС-формы и О-типа. При помощи метода культуры in vitro получены дигаплоидные линии (DH) мужскостерильной формы и закрепителя стерильности О-типа гибрида сахарной свёклы РМС 129.
Ключевые слова: сахарная свёкла, гомозиготные гаплоидные линии, цитоплазматическая мужская стерильность, ПЦР-анализ.
Summary. The aim of this work was to create a di-haploid (DH) lines of sugar beet in vitro and their molecular analysis. It has been determined that DNA-markers of mitochondrial genome in sugar beet belonging to the TR mini-satellites family (TR1 and TR3) enable an enough precise classification of haploid micro-clonal plants as MS and O-type forms. By suggested method, di-haploid lines (DH) of the male-sterile form and the О-type sterility maintainer of the RMS 129 sugar beet hybrid have been obtained in vitro.
Keywords: sugar beet, homozygous haploid lines, cytoplasmic male sterility, PCR-analysis.
№ 4 • 2022 САХАР 49
СПОНСОР ВЫПУСКА V^j/j
www.nt-prom.ru
