CC BY
13DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-33-83-94 УДК 579.841.11+579.253.4
А. А. Муратова1, О. В. Евдокимова1, М. Н. Мандрик-Литвинкович1, Л. Н. Валентовичи,
М. А. Титок2
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА СИНТЕЗ ПИОВЕРДИНА БАКТЕРИЯМИ PSEUDOMONAS BRASSICACEARUM S-1
Государственное научное учреждение «Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220084, г. Минск, ул. Купревича, 2 e-mail: anya.muratova.93@mail.ru 2Белорусский государственный университет Республика Беларусь, 220030, г. Минск, пр. Независимости, 4
В результате молекулярно-генетического и функционального анализа выявлен и охарактеризован ряд новых генетических детерминант, влияющих на синтез пиовердина бактериями P. brassicacearum S-1. Установлено, что инактивация генов, кодирующих Zn-зависимую пептидазу (mtfA), пептидазу семейства С39 (GFU70 09550), трансмембранный сенсорный белок (bvgS), транспортер гема (ccmC) и белок с неизвестной функцией (ydgA), приводила к изменению флуоресценции, эффективности синтеза пиовердина и антимикробной активности у штамма P. brassicacearum S-1. В хромосоме исследуемых бактерий обнаружен ранее неописанный генетический локус, определяющий синтез пиовердина. Показано, что направленная инактивация данного локуса приводила к полному отсутствию флуоресценции и продукции пиовердина бактериями P brassicacearum S-1, а также к утрате способности подавлять рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum БИМ F-798.
Ключевые слова: Pseudomonas brassicacearum, сидерофоры, флуоресценция, мутагенез, антагонистическая активность.
Введение
В настоящее время в растениеводстве востребованы биопрепараты на основе живых культур микроорганизмов, имеющие ряд значимых преимуществ по сравнению с традиционными синтетическими пестицидами. В частности, они не накапливаются в почве, не обладают фитотоксичными свойствами и не влияют на биоразнообразие природных экосистем [1]. Основу биопрепаратов для защиты растений обычно составляют штаммы с известной генетической организацией, обладающие комплексной антимикробной и фитостимулирующей активностью. К таким микроорганизмам относятся представители почвенных бактерий рода Pseudomonas, которые способны синтезировать широкий спектр практически значимых метаболитов (фитогор-монов, сидерофоров, витаминов, ферментов и др.) [2]. На основе бактерий Pseudomonas brassicacearum S-1 в Институте микробиологии НАН Беларуси разработан биопестицид
«Экогрин» для защиты овощных и зеленных культур от фитопатогенов [3]. Для генетической характеристики данного штамма было проведено полногеномное секвенирование (код доступа нуклеотидной последовательности штамма S-1 в базе данных GenBank — СР045701). Анализ полученных данных позволил выявить целый ряд генетических детерминант, определяющих синтез метаболитов и ферментов, предположительно обеспечивающих антимикробные и ростостиму-лирующие свойства штамма Р. brassicaсearum S-1 [4]. В частности, была установлена локализация pvd, рМ и Мсп-оперонов, определяющих синтез пиовердина, 2,4-диацетил-флороглюцинола и цианида соответственно. Данные соединения активны в отношении бактериальных и грибных патогенов хозяйственно ценных культур. Ранее был проведен молекулярно-генетический и функциональный анализ рМ [5] и Мсп-оперонов [6], определена роль 2,4-диацетилфлороглюцинола и циани-
да в антагонистической активности штамма P. brassicacearum S-1. Помимо вышеуказанных метаболитов, научный и практический интерес представляют пиовердины (или псев-добактины) — флуоресцирующие пигменты, продукция которых в основном характерна для бактерий рода Pseudomonas. Данные пигменты относятся к группе сидерофоров, обладающих высоким сродством к ионам трехвалентного железа (Fe3+) [7]. Секретируемые бактериями во внешнюю среду сидерофоры связывают ионы Fe3+ и транспортируют его в составе комплексов обратно в бактериальную клетку, где трехвалентное железо высвобождается, восстанавливается до двухвалентного состояния и включается в процессы клеточного метаболизма [8]. Поскольку во внешней среде чаще всего наблюдается дефицит данного элемента, являющегося жизненно важным для почвенных микроорганизмов, они конкурируют между собой за его связывание. Штаммы почвенных псевдомонад, способные снижать доступность железа для фитопатогенов, инги-бируют их рост [9-11]. Помимо антагонистической активности, пиовердины способствуют росту растений за счет способности переводить железо в доступную для них форму [12].
Знание механизмов синтеза пиовердина необходимо для детального изучения и направленного использования биотехнологически важных штаммов микроорганизмов [13]. В соответствии с вышесказанным, целью настоящей работы являлся молекулярно-генетиче-ский и функциональный анализ генетических детерминант, определяющих синтез пиоверди-на бактериями P. brassicacearum S-1 и определение роли данного сидерофора в антагонистической активности исследуемого штамма.
Материалы и методы
Использованные в работе штаммы микроорганизмов и плазмиды перечислены в таблице 1. Глубинное культивирование бактерий осуществляли в полноценной среде LB [14] или минимальной среде Мейнелла [15] с аэрацией (200 об/мин) при температуре 28-30 °С в течение 24-48 ч. Бактерии Escherichia coli выращивали при 37 °С в среде LB в течение 12-14 ч, с перемешиванием 120-160 об/мин. Грибные патогены выращивали в картофель-но-глюкозном бульоне [16] с перемешиванием 120-160 об/мин при температуре 22 °С.
В работе использовали коммерческие препараты в конечных концентрациях: канами-
Таблица 1
Характеристика штаммов микроорганизмов и плазмид, использованных в работе
Штаммы, плазмиды Характеристика Источник
Alternaria alternata БИМ F-462 возбудитель альтернариоза огурца Белорусская коллекция непатогенных микроорганизмов
Colletotrichum lupini БИМ F-397 возбудитель антракноза люпина
Pseudomonas syringae БИМ B-280 возбудитель бактериального ожога сои
Fusarium oxysporum БИМ F-798 возбудитель корневой гнили томата
Xanthomonas campestris БИМ B-634 возбудитель сосудистого бактериоза капусты, моркови
Escherichia coli
XL1-Blue F'proAB lacIq lacZAM15 Tn10(TetR)/recA1 endAl gyrA96(NalR) thi-1 hsdR17(rk m+k) supE44 relAl lac [17]
BW19851 RP4-2(Km::Tn7,Tc::Mu-1) AuidA3::pir+ recAl, endAl thiEl hsdR17 creC510 zbfl5 [18]
S17-1 thi rspL (StrR) endA sbcB15 sbcC hsdR (rk-mk-) A(lac-proAB) [F' traD36 lacF A(lacZ)M15 proA+B+] l pir+ [19]
Окончание таблицы 1
Штаммы, плазмиды Характеристика Источник
Pseudomonas brassicacearum
S-1 (БИМ В-446 Д) EryR, содержит спонтанную хромосомную мутацию, определяющую устойчивость к эритромицину, получен из штамма P. brassicacearum S Белорусская коллекция непатогенных микроорганизмов
S-1-pvdX EryR, KmR, в хромосоме P brassicacearum S-1 имеется инсерция плазмиды pK18mob::pvdX
18 EryR, KmR, в хромосоме P brassicacearum S-1 инак-тивирован ген mtfA путем встраивания транспозо-на mini-Tn5xy/£, детерминирующего устойчивость к канамицину
20 EryR, KmR, в хромосоме P. brassicacearum S-1 инактивирован ген GFU70 09550 путем встраивания транспозона mini-Tn5xy/£, детерминирующего устойчивость к канамицину
26 EryR, KmR, в хромосоме P. brassicacearum S-1 инактивирован ген ydgA путем встраивания транспозона mini-Tn5xylE, детерминирующего устойчивость к канамицину получены в данной работе
36 EryR, KmR, в хромосоме P. brassicacearum S-1 инактивирован ген bvgS путем встраивания транспозона mini-Tn5xylE, детерминирующего устойчивость к канамицину
63 EryR, KmR, в хромосоме P. brassicacearum S-1 инактивирован ген ccmC путем встраивания транспозона mini-Tn5xylE, детерминирующего устойчивость к канамицину
Плазмиды
pJET1.2 APR pbc^ eco47IR oriVcolE1 [20]
pUC19 APR, oriVColE1 [21]
pUT::mini-Tn5xylE ApR; KmR, oriR6K, mob RP4, полилинкер от M13tg131, tnp, xylE [22]
pK18mob KmR, pMB1, mob, pLac oriRp4 [23]
pK18mob::pvdX pK18mob со вставкой гена GFU70 19300 по сайту Smal получена в данной работе
цин и эритромицин — 50 мкг/мл; ампициллин — 100 мкг/мл; для бело-голубой селекции использовали изопропил^-О-1-тиогалакто-пиранозид — 0,5 ммоль/л, 5 бром-4-хлор-3-ин-долил-бета-О-галактопиранозид — 50 мкг/мл.
Тотальную и плазмидную ДНК выделяли с использованием наборов реактивов «Bacteria DNA Preparation Kit» (PP-214L, Jena
Bioscience) и «GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit» (K0503, Thermo Fisher Scientific).
Для проведения полимеразной цепной реакции использовали реактивы фирм АртБиоТех или Праймтех (Республика Беларусь). Реакционная смесь (50 мкл) содержала ~ 100 нг ДНК матрицы, 0,2 ммоль/л каждого дНТФ, 0,2 мкмоль/л каждого праймера, Flash ДНК-поли-
меразу (1,25 ед.) и АМ-буфер (1*). Проверка на наличие шпилечных структур в пределах праймеров и определение температуры отжига проводилась с помощью программы Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/primer-blast/) и онлайн-олигокалькулято-ра Олиго Кальк (http://www.bio.bsu.by/molbiol/ oligocalc.html).
Для амплификации фрагмента гена GFU70 19300 (обозначенного далее по тексту как ген pvdX) использовали праймеры pvd-F (5 '-GACCAACTGATCCGGATGC-3') и pvd-R (5'-GCTGTATTCCTTGAGCAG-3') при режиме: 98 °С — 3 мин (1 цикл); 98 °С — 15 сек, 52 °С — 15 сек, 72 °С — 1 мин (30 циклов); 72 °С — 3 мин (1 цикл).
Электрофоретический анализ осуществляли в 0,8% агарозном геле с бромистым этидием (в конечной концентрации 0,1%) при напряженности электрического поля 8-10 В/см. В качестве загрузочного буфера использовали 6* DNA Gel Loading Dye (R0611, Thermo Fisher Scientific), в качестве маркера молекулярного веса ДНК — GeneRuler 1 kb DNA Ladder (SM0311, Thermo Fisher Scientific). Результаты визуализировали с помощью системы цифровой фотодокументации производства Bio-Rad.
Выделение фрагмента ДНК нужного размера после электрофоретического разделения в агарозном геле проводили с помощью наборов «GeneJET Gel Extraction Kit» (K0691, Thermo Fisher Scientific) или «Monarch® DNA Gel Extraction Kit» (T1020S, New England Biolabs) в соответствии с протоколами производителей. Рестрикцию плазмидной и тотальной ДНК, лигирование осуществляли в условиях, рекомендуемых фирмой-изготовителем (Thermo Fisher Scientific). Трансформацию бактерий E. coli осуществляли согласно методическим рекомендациям, изложенным в руководстве Дж. Сэмбрука с соавт. [24].
Перенос транспозона mini-Tn5xy/E в бактерии P brassicacearum S-1 и направленную инактивацию генов осуществляли методом конъюгации [25]. В качестве штаммов-доноров использовали бактерии штамма E. coli S17-1 [pUT::mini-Tn5xylE] для транспо-зонного мутагенеза и E. coli BW19851 [pK18mob::pvdX] для направленного мутагенеза. Клетки донора и реципиента в стационарной фазе роста сгущали в 5 раз, сме-
шивали в соотношении 1:1 и наносили на стерильные мембранные фильтры (Synpor 6, размер пор 0,45 мкм), помещенные на поверхность полноценной агаризованной среды в чашках Петри. Скрещиваемые бактерии инкубировали в течение 48 ч при 30 °С, после чего клетки смывали физиологическим раствором и из соответствующих разведений высевали на селективные среды.
Определение антимикробной активности проводили в трех биологических повторно-стях с помощью метода отсроченного антагонизма [26], расчеты проводили с учетом стандартного отклонения. Достоверность различия средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента. За уровень статистической значимости принимался порог р < 0,05 [27].
Наличие флуоресценции регистрировали на агаризованной среде Кинг В [28]. Детекцию пи-овердина проводили с помощью хроматографа «HPLC Shimadzu LC-30 Nexera» (Shimadzu). Разделение компонентов осуществляли с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке Luna 5 мкм C18 150 мм х 4,6 мм (Phenomenex). Анализ проводили в режиме градиентного элюирования, в качестве подвижной фазы использовали 17 мМ NaOH-ацетатный буфер (рН 5,3, раствор А) и 100% ацетонитрил (раствор Б). Программа ВЭЖХ была следующей: 100% раствора А, 1 мин; от 100% раствора А до 97% раствора А, 2 мин; 97% раствор А, 9 мин; от 97% раствора А до 30% раствора А, 25 мин при скорости потока 1 мл/мин. Объем инъекции 5 мкл, регистрация сигнала осуществлялась с помощью детектора диодной матрицы в УФ диапазоне 190-450 нм.
Визуализацию генов осуществляли с помощью программы SnapGene Viewer 5.2. Сравнение аминокислотных и нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi) и баз данных NCBI (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/). Поиск генов, предположительно ответственных за синтез вторичных метаболитов, проводили с помощью веб-сервера antiSMASH v5.2.0 [29].
Для определения последовательностей отдельных генетических детерминант по Сенгеру [30] использовали набор
DNA Cycle Sequencing Kit Jena Bioscience GmbH (Германия) и праймеры Tn5-OE-seq (5'-GCCGCACTTGTGTATAAG-3'), Tn5-IE-seq (5'-TAGGCGGCCAGATCTGATC-3') (Прайм-тех, Республика Беларусь). Продукты секве-нирующей реакции детектировали с помощью автоматического секвенатора 4300 DNA Analyzer, Li-COR (США). Полученные результаты расшифровывали с помощью программы eSeq Version 3.1 Li-COR (США).
Результаты и обсуждение
В результате автоматической аннотации генома бактерий P. brassicacearum S-1 были выявлены гены (pvdSL, pvdPMNOEIJD, pvdH, pvdA и fpvI), способные определять синтез пиовердина у исследуемого штамма. Данные детерминанты являлись достаточно консервативными и присутствовали в хромосомах ряда бактерий рода Pseudomonas (табл. 2).
Для поиска дополнительных генетических
Таблица 2
Гены, определяющие продукцию пиовердина у штамма P brassicacearum S-1
Номер локуса (ген) Размер, п. н. Продукт гена Штаммы со схожими генами Идентичность, %
GFU70_08745 (pvdS) 549 сигма фактор РНК-полимеразы P brassicacearum 3Re2-7 (CP034725.1) P. brassicacearum LBUM300 (CP012680.1) 98,36 98,18
GFU70_08750 (pvdL) 12 987 нерибосомная пептидсинтетаза P. brassicacearum LBUM300 (CP012680.1) P. brassicacearum 3Re2-7 (CP034725.1) 94,38 94,36
GFU70_19275 (pvdP) 1 617 PvdJ/PvdD/PvdP-подобный белок Pseudomonas sp. St386 (AP021900.1) P. brassicacearum 3Re2-7 (CP034725.1) 94,36 94,30
GFU70_19280 (pvdM) 1 371 пиовердин-производящий дипептидазоподобный белок PvdM P. brassicacearum 3Re2-7 (CP034725.1) P fluorescens FW300-N2C3 (CP012831.1) 96,28 95,33
GFU70_19285 (pvdN) 1 281 аминотрансфераза класса У-кратных PLP-зависимых ферментов P. brassicacearum 3Re2-7 (CP034725.1) P. brassicacearum LBUM300 (CP012680.1) 95,09 94,85
GFU70_19290 (pvdO) 876 белок семейства формилглицин-генерирующих ферментов P. brassicacearum 3Re2-7 (CP034725.1) Pseudomonas sp. St290 (AP014703.1) 95,66 90,99
GFU70_19295 (pvdE) 1 659 АВС-транспортер для переноса циклических пептидов P. brassicacearum 3Re2-7 (CP034725.1) P. brassicacearum L13-6-12 (CP014693.1) 95,96 90,90
GFU70_19315 (pvdl) 3 225 белок, содержащий домен аденилирования аминокислот P. brassicacearum L13-6-12 (CP014693.1) P. brassicacearum 3Re2-7 (CP034725.1) 95,42 95,32
GFU70_19320 (pvdJ 13 701 нерибосомная поликетидсинтаза Pseudomonas sp. St386 (AP021900.1) P. brassicacearum L13-6-12 (CP014693.1) 95,49 95,38
Окончание таблицы 2
Номер локуса (ген) Размер, п. н. Продукт гена Штаммы со схожими генами Идентичность, %
GFU70_19325 (pvdD) 12 915 нерибосомная поликетидсинтаза Pseudomonas sp. St386 (AP021900.1) P brassicacearum WCS365 (CP089973.1) 94,97 94,90
GFU70_08785 (pvdH) 1 413 аспартат-аминотрансфераза P brassicacearum 3Re2-7 (CP034725.1) P brassicacearum L13-6-12 (CP014693.1) 94,83 94,76
GFU70_19235 (pvdA) 1 335 L-орнитин-N5-оксигеназа P brassicacearum 3Re2-7 (CP034725.1) P. brassicacearum NFM421 (CP002585.1) 95,06 94,83
GFU70 19240 (fpvI) 483 сигма фактор РНК-полимеразы P brassicacearum 3Re2-7 (CP034725.1) P fluorescens FW300-N2E2 (CP015225.1) 97,31 96,89
детерминант, способных определять синтез пиовердина использовали два подхода. Первый заключался в анализе ранее отобранных в результате транспозонного мутагенеза вариантов бактерий Р. brassicacearum S-1, не способных синтезировать флуоресцирующий пигмент [31]. Второй подход базировался на данных информативного анализа.
На первом этапе для транспозонных мутантов (обозначены как 18, 20, 26, 36, 63) определяли место локализации транспозона ттьТп5ху/Е. Для этого из клеток мутантных бактерий выделяли тотальную ДНК, обрабатывали эндонуклеазой PstI (сайт узнавания отсутствует в пределах транспозона тть Тп5ху1Е) и лигировали с плазмидой риС19,
предварительно обработанной этим же ферментом. Гибридные конструкции, содержащие фрагмент(ы) хромосомы, окаймляющий(е) транспозон, использовали в качестве матриц для секвенирующей реакции с праймерами, отжигающимися на концах транспозона.
В результате было определено, что инсер-ция транспозона произошла в генетические детерминанты mtfA, GFU70_09550,ydgA, bvgS и сстС, определяющие синтез белков с разной функциональной активностью, роль которых в синтезе пиовердина ранее для бактерий вида Р brassicacearum не изучалась (табл. 3). Тем не менее снижение синтеза данного сидерофора регистрировали для всех исследованных мутантных штаммов (табл. 4).
Таблица 3
Характеристика генетических детерминант, определяющих синтез флуоресцирующего
пигмента у бактерий Р brassicacearum S-1
№ штамма Номер локуса (кодируемый белок) Предполагаемая функция белка Известные белки бактерий (код доступа), сходные с белком штамма S-1 Идентичность, %
18 GFU70_25165 (MtfA) Регуляция работы глюкозо-фосфотрансферазной системы бактерий Цинк-зависимая пептидаза (МВ01540474.1) Pseudomonas sp. OA65 Цинк-зависимая пептидаза (WP_207280677.1) Pseudomonas sp. FW300-N2F2 98,89 98,52
Примечание. * - белок не обозначен
Таблица 4
Содержание пиовердина в культуральных жидкостях мутантных бактерий
P. brassicacearum S-1
Окончание таблицы 3
№ штамма Номер локуса (кодируемый белок) Предполагаемая функция белка Известные белки бактерий (код доступа), сходные с белком штамма S-1 Идентичность, %
20 GFU70_09550* Расщепление лидерных пептидов Пептидаза семейства С39 (NUT83865.1) P. brassicacearum C2F7 Белок с неизвестной функцией (AEA68025.1) P brassicacearum NFM421 100,00 96,50
26 GFU70 00985 (YdgA) Функция неизвестна YdgA (NUT84431.1) P. brassicacearum C2F7 Белок с неизвестной функцией (KIR14961.1) P fluorescens DSM 8569 99,80 98,20
36 GFU70 05180 (BvgS) Реакция клеток в условиях дефицита ионов железа Гистидинкиназа (OOG87969.1) Pseudomonas sp. A25 Сенсорный белок (EPJ81229.1) Pseudomonas sp. CFII68 94,08 94,08
63 GFU70 07935 (CcmC) Экспортер гема для цитохрома С CcmC (EIK64745.1) P fluorescens Q8r1-96 CcmC (AEA67708.1) P brassicacearum NFM421 100,00 100,00
Штамм Площадь пика Относительное содержание пиовердина, %
P brassicacearum S-1 664 022 100,0
18 69 285 10,4
20 5 288 0,8
26 137 365 20,7
36 179 074 26,9
63 43 229 6,5
Для поиска локусов, предположительно связанных с синтезом вторичных метаболитов с антимикробной активностью, использовали программу antiSMASH.
В результате в хромосоме бактерий P brassicacearum S-1 был обнаружен генетический локус, предположительно связанный с синтезом пиовердина (рис. 1). В составе
локуса выявлен ряд генов, в том числе pvdX (GFU70_19300), функция которого ранее никем не изучалась. Было установлено, что ген pvdX предположительно кодирует белок (1 387 а. о., р1 5,66), содержащий функционально значимый домен (507-994 а. о.), определяющий аденилирование аминокислот A_NRPS_Cytc1-like ^17643). Данный полипептид наиболее сходен с белками, кодируемыми хромосомными генами бактерий
P. brassicacearum C2F7 (NUT83944.1, идентичность 98,32%) и P brassicacearum Delaware (ROM94814.1, идентичность 94,53%). Следует отметить, что подобный функциональный домен входит в состав пиовердинсинтетазы D (PvdD) и сирингопептинсинтетазы патогенных бактерий P aeruginosa и P syringae [32].
Для определения роли нерибосомной пептидсинтетазы PvdX в синтезе пиовердина бактериями P. brassicacearum S-1 использо-
- регулятор в ые гены
Рис. 1. Генетическая карта локуса, определяющего синтез пиовердина у бактерий P. brassicacearum S-1
вали метод направленного мутагенеза. Для этого был амплифицирован фрагмент гена pvdX размером 4 132 п. н., который лигирова-ли с плазмидой pK18mob, лианизированной рестриктазой SmaI. Полученной гибридной конструкцией трансформировали бактерии штамма E. coli BW19851, содержащего в хромосоме ira-область плазмиды группы IncP-1. Направленный мутагенез осуществляли путем передачи плазмиды pK18mob::pvdX из клеток E. coli BW19851 в бактерии P. brassicacearum S-1 методом конъюгации. Поскольку плазмида pK18mob::pvdX не поддерживается в клетках
псевдомонад, появление канамицинрезистент-ных трансконъюгантов возможно только при встраивании гибридной конструкции в состав хромосомы за счет гомологичной рекомбинации по идентичным нуклеотидным последовательностям генаpvdX. В результате были отобраны мутантные варианты Р. brassicacearum S-1-pvdX не способные синтезировать флуоресцирующий пигмент и продуцировать пио-вердин (рис. 2).
Для всех отобранных мутантных вариантов бактерий Р brassicacearum S-1 определяли антимикробную активность (табл. 5). Для
Рис. 2. Колонии мутантных бактерий Р. brassicacearum S-1-pvdX (клоны 1-7). Исходный штамм Р. brassicacearum 8-1
соответствует обозначению 8-1
этого у выбранных транспозонных мутантов и у штамма Р. brassicacearum S-1-pvdX была проверена способность подавлять рост грибных и бактериальных фитопатогенов. В результате было установлено, что транспозон-ные мутанты с нарушенными генами mtfA (мутант № 18), ydgA (мутант № 26), bvgS (мутант № 36) и сстС (мутант № 63) проявляли в сравнении с исходным штаммом повышенную в 1,2-1,6 раз антимикробную активность по отношению к патогенам X. campestris,
Таким образом, в хромосоме бактерий Р brassicacearum S-1 выявлен ряд новых генетических детерминант, продукты которых влияли не только на синтез пиовердина, но и играли роль в синтезе антимикробных метаболитов, активных в отношении определенных видов фитопатогенов.
Заключение
В результате проведенных исследований методом транспозонного мутагенеза выявлен ряд генов (mtfA, GЕU70_09550, у^^А, bvgS, сстС), продукты которых влияли на синтез пиовер-дина и антимикробную активность бактерий Р. brassicacearum S-1. Связь данных генетиче-
А. alternata, С. ¡ирш. У мутанта с нарушенным геном GЕU70_09550 (мутант № 20) антимикробная активность сохранилась на уровне дикого типа по отношению к патогенам X. campestris, Р. syringae и А. alternata, но пропадала по отношению к грибам С. lupini и Е oxysporum. У штамма Р. brassicacearum S-1-pvdX снижалась активность по отношению ко всем исследованным патогенам (за исключением Р. syringae) и полностью отсутствовала по отношению к Е oxysporum.
ских детерминат с продукцией пиовердина для бактерий вида P. brassicacearum установлена впервые. Показано, что направленная инактивация оперона генов синтеза нерибосомной пептидсинтетазы PvdX приводила к неспособности штамма P brassicacearum S-1-pvdX продуцировать пиовердин и подавлять рост фито-патогенного штамма F. oxysporum БИМ F-798.
Список использованных источников
1. Pylak, M. Review report on the role of bioproducts, biopreparations, biostimulants and microbial inoculants in organic production of fruit / M. Pylak, K. Oszust, M. Fr^c // Rev. Environ. Sci. Biotechnol. - 2019. - Vol. 18, № 3. - P. 597-616.
Таблица 5
Антагонистическая активность мутантных бактерий
Штамм Зоны задержки роста фитопатогенов, мм
X. campestris P syringae A. alternata C. lupini F. oxysporum
18 27,0 ± 0,5* 27,0 ± 0,6* 24,0 ± 0,7* 32,0 ± 0,4* 23,0 ± 0,5*
20 22,0 ± 0,4* 21,0 ± 0,5 17,3 ± 0,4 — —
26 31,0 ± 0,5* 24,0 ± 0,7* 22,0 ± 0,5* 34,0 ± 0,5* 22,0 ± 0,4
36 29,0 ± 0,7* 19,0 ± 0,4 28,0 ± 0,4* 30,0 ± 0,7* 23,0 ± 0,7*
63 28,0 ± 0,7* 20,0 ± 0,5 24,0 ± 0,6* 29,0 ± 0,7* 22,3 ± 0,4
P. brassicacearum S-1-pvdX 13,5 ± 0,5* 18,0 ± 0,5 15,0 ± 0,5* 18,0 ± 0,6* —
P brassicacearum S-1 20,0 ± 0,4 19,0 ± 0,7 19,0 ± 0,4 22,0 ± 0,6 20,0 ± 0,7
Примечание. * — статистически значимые по t-критерию Стьюдента различия с контролем
2. Genetic Potential of the Biocontrol Agent Pseudomonas brassicacearum (Formerly P. trivialis) 3Re2-7 Unraveled by Genome Sequencing and Mining, Comparative Genomics and Transcriptomics / J. Nelkner [et al.] // Genes. - 2019. - Vol. 10, № 8. - Art. № 601.
3. Бактерии Pseudomonas aurantiaca БИМ В-446 — основа биопрепарата Экогрин для защиты овощных и зеленных культур от болезней в условиях малообъемной гидропоники / Э. И. Коломиец [и др.] // Микробные биотехнологии: функциональные и прикладные аспекты: сб. науч. тр. / Нац. акад. наук Беларуси [и др.]. - Минск. - 2012. - Т. 4 - С. 98-107.
4. Muratova, A. A. Genome analysis of Pseudomonas brassicacearum S-1 — an antagonist of crop pathogens / A. A. Muratova, A. E. Akhremchuk, L. N. Valentovich // Biotechnol. Acta. - 2021. - Vol. 14, № 2. - P. 47-58.
5. Molecular genetic analysis of determinants defining synthesis of 2,4-diacetylphloroglucinol by Pseudomonas brassicacearum BIM B-446 bacteria / M. N. Mandryk-Litvinkovich [et al.] // Appl. Biochemistry a. Microbiol. - 2017. -Vol. 53, №. 1. - P. 31-39.
6. Муратова, А. А. Анализ влияния hcn-кла-стера генов на антибактериальную и антифун-гальную активность бактерий Pseudomonas brassicacearum БИМ В-446 / А. А. Муратова, Л. Н. Валентович // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты : материалы XI междунар. науч. конф., Минск, 3-6 июня 2019 г. / Нац. акад. наук Беларуси [и др.]. - Минск. - 2019. - С. 103-104.
7. Bacterial Iron Transport: Coordination Properties of Pyoverdin PaA, a Peptidic Siderophore of Pseudomonas aeruginosa / A.-M. Albrecht-Gary [et al.] // Inorg. Chem. -1994. - Vol. 33, № 26. - P. 6 391-6 402.
8. Siderophore uptake in bacteria and the battle for iron with the host; a bird's eye view / B.C. Chu [et al.] // Biometals Int. J. Role Met. Ions Biol. Biochem. Med. - 2010. - Vol. 23, № 4. - P. 601-611.
9. The Pseudomonas fluorescens Siderophore Pyoverdine Weakens Arabidopsis thaliana Defense in Favor of Growth in Iron-Deficient Conditions1 / P. Trapet [et al.] // Plant Physiol. -2016. - Vol. 171, № 1. - P. 675-693.
10. Ahmed, E. Siderophores in environmental research: roles and applications / E. Ahmed, S.J.M. Holmström // Microb. Biotechnol. - 2014.
- Vol. 7, № 3. - С. 196-208.
11. Microbial Antagonism at the Root Level Is Involved in the Suppression of Fusarium Wilt by the Combination of Nonpathogenic Fusarium oxysporum Fo47 and Pseudomonas putida WCS358 / B. J. Duijff [et al.] // Phytopathology.
- 1999. - Vol. 89, № 11. - P. 1 073-1 079.
12. Microbial siderophores: a mini review / R. Saha [et al.] // J. Basic Microbiol. - 2013. -Vol. 53, № 4. - P. 303-317.
13. Молекулярно-генетический анализ генома бактерий Pseudomonas brassicacearum БИМ В-446, стимулирующих рост и развитие сельскохозяйственных растений / А. А. Муратова, М Н. Мандрик-Литвинкович, Л. Н. Валентович, Э. И. Коломиец // Биологическая защита растений - основа стабилизации агро-экосистем : материалы междунар. науч.-практ. конф. «Биологическая защита растений — основа стабилизации агроэкосистем. Становление и перспективы развития органического земледелия в Российской Федерации», 11-13 сент. 2018 г. / Рос. акад. наук [и др.]. - Краснодар, 2018. - Вып. 10. - С. 56-59.
14. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli / G. Bertani // J. Bacteriol. -1951. - Vol. 62, № 3. - P. 293-300.
15. Мейнелл, Д. Экспериментальная микробиология / Д. Мейнелл, Э. Мейнелл. - М.: Мир, 1967. - 320 с.
16. Wongjiratthiti, A. Utilisation of local crops as alternative media for fungal growth / A. Wongjiratthiti, S. Yottakot // Pertanika J. Trop. Agric. Sci. - 2017. - Vol. 40. - P. 295-304.
17. Bullock, W. O. XL1-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection / W. O. Bullock, J. M. Fernandez, J. M. Short // BioTechniques. -1987. - Vol. 5, №. 3. - P. 376-379.
18. Metcalf, W. W. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K gamma origin plasmids at different copy numbers / W. W. Metcalf, W. Jiang, B. L. Wanner // Gene. - 1994.
- Vol. 138, № 1/2. - P. 1-7.
19. Lorenzo, V. de. Analysis and construction of stable phenotypes in gram-negative bacteria with Tn5- and Tn10-derived minitransposons / V. de Lorenzo, K. N. Timmis // Methods Enzymol. - 1994. - Vol. 235. - P. 386-405.
20. CloneJET PCR Cloning Kit [Electronic resource]. - Mode of access: https://www. thermofisher.com/order/catalog/product/K1231.
- Date of access: 18.02.2021.
21. Yanisch-Perron, C. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors / C. Yanisch-Perron, J. Vieira, J. Messing // Gene.
- 1985. - Vol. 33, № 1. - P. 103-119.
22. Herrero, M. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria / M. Herrero, V. de Lorenzo, K.N. Timmis // J. Bacteriol. - 1990. -Vol. 172, № 11. - P. 6 557-6 567.
23. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum / A. Schäfer [et al.] // Gene. - 1994.
- Vol. 145, № 1. - P. 69-73.
24. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / J. Sambrook, D. Russell.
- Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000. -2 344 p.
25. Mini-Tn5 transposon derivatives for insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal insertion of cloned DNA in gramnegative eubacteria. / V. de Lorenzo [et al.] // J. Bacteriol. - 1990. - Vol. 172, № 11. - P. 6 5686 572.
26. Сэги, И. Методы почвенной микробио-
логии / Й. Сэги. - М. Колос, 1983. - 296 с.
27. Расчет t-критерия Стьюдента при сравнении средних величин [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://medstatistic.ru/ calculators/averagestudent.html. - Дата доступа: 30.06.2022.
28. King, E. O. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin / E. O. King, M. K. Ward, D. E. Raney // J. Lab. Clin. Med. - 1954. - Vol. 44, № 2. - P. 301-307.
29. antiSMASH 5.0: updates to the secondary metabolite genome mining pipeline / K. Blin [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2019. - Vol. 47, № W1. - P. W81-W87.
30. Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1977.
- Vol. 74, № 12. - P. 5 463-5 467.
31. Молекулярно-генетический анализ детерминант, определяющих антимикробные свойства бактерий Pseudomonas brassicacearum БИМ Б-446 / А. А. Муратова, М. Н. Мандрик-Литвинкович, Т. Л. Носонова, Л. Н. Валентович, Э. И. Коломиец, М. А. Ти-ток // Вес. Нац. акад. навук Беларусь Сер. бiял. навук. - 2016. - № 3.- С. 81-84.
32. Ackerley, D.F. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase PvdD from Pseudomonas aeruginosa / D. F. Ackerley, T. T. Caradoc-Davies, I. L. Lamont // J. Bacteriol.
- 2003. - Vol. 185, № 9. - P. 2 848-2 855.
A. A. Muratova1, O. V. Evdokimova1, M. N. Mandryk-Litvinkovich1, L. N. Valentovich12, M. A. Titok2
MOLECULAR GENETIC AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF GENES INFLUENCING PYOVERDINE SYNTHESIS IN PSEUDOMONAS
BRASSICACEARUM S-1
^tate Scientific Institution "Institute of Microbiology of the National Academy of Sciences of Belarus" 2 Kuprevica St., 220084 Minsk, Republic of Belarus e-mail: anya.muratova.93@mail.ru 2Belarusian State University 4 Niezalieznasci Ave., 220030 Minsk, Republic of Belarus
Molecular genetic and functional analysis allowed the identification and characterization of a number of new genetic determinants affecting the synthesis of pyoverdine by P. brassicacearum strain S-1. It was established that inactivation of genes encoding Zn-dependent peptidase (mtfA), peptidase of the C39 (GFU70 09550) family, transmembrane sensor protein (bvgS), heme transporter (ccmC), and protein with unknown function (ydgA) led to changes in fluorescence, efficacy of pyoverdine synthesis and antimicrobial activity in P brassicacearum strain S-1. A previously undescribed genetic locus that determines the synthesis of pyoverdin was found in the chromosome of the studied bacteria. It was shown that the directed inactivation of this locus led to the complete absence of fluorescence and the production of pyoverdine by P. brassicacearum strain S-1, as well as to the loss of the ability to suppress the growth of the phytopathogenic strain Fusarium oxysporum BIM F-798.
Keywords: Pseudomonas brassicacearum, siderophores, fluorescence, mutagenesis, antagonistic activity.
Дата поступления в редакцию: 05 сентября 2022 г.
