CC BY
860
УДК 577.123:579.252.5
Вестник защиты растений, 2, 2001
СВОЙСТВА БЕЛКА, ЭКСПРЕССИРУЕМОГО ТРАНСФОРМАНТОМ E.COLI DH5^ НЕСУЩИМ РЕКОМБИНАНТНУЮ ПЛАЗМИДУ pBLUESCRIPT KS(+) СО ВСТАВКОЙ ECORI - ФРАГМЕНТА ДНК ИЗ БАКТЕРИИ SERRATIA MARCESCENS
Э.В.Попова
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Изучены свойства белка, экспрессируемого генетически модифицированным штаммом
E.coli DH5а p44, содержащим рекомбинантную плазмиду pBluescript KS (+) со вставкой EcoRI фрагмента ДНК из бактерии S.marcescens. Установлено, что белок имеет молекулярную массу 57 кД и обладает хитиназной и антигрибной активностью по отношению к грибу
F.oxysporum f.sp. cucumerinum.
Существуют убедительные доказательства того, что гидролитические ферменты растений типа глюканогидролаз, хитиназ и т.п., способные разрушать ми-целярные гифы фитопатогенных грибов, выполняют определенные защитные функции, повышая устойчивость растений к грибным инфекциям. Поэтому клонирование генов ферментов с антигрибной активностью для генетической модификации растений с целью получения форм, устойчивых к вредным организмам, а также для конструирования микроорганизмов-антагонистов с усиленными антигрибными свойствами - весьма актуальная задача защиты растений. В качестве источника подобных генов был выбран штамм бактерии Serratia marcescens, выраженные антагонистические свойства которого определяются в значительной степени активностью комплекса экстрацеллюлярных хитинолити-ческих ферментов (Соколова, 1995). В ходе изучения антигрибной активности штаммов бактерии рода Serratia выявлена положительная корреляция между уровнями хитиназной активности штаммов и их антагонистическими свойствами по отношению к широкому кругу (18 видов) фитопатогенных грибов - возбудителей болезней сельскохозяйственных растений и, в частности, к грибу Fusarium oxysporum, вызывающему корневые гнили и увядание овощных культур (Соколова, 1995; Тютерев и др., 1995).
В результате был отобран штамм 218 бактерии S.marcescens, обладающий высокой хитиназной и антигрибной актив-
ностью, и проведены эксперименты по клонированию гена хитиназы из этого штамма в клетках Escherichia coli DH 5а с помощью векторной плазмиды pBluescript KS(+). Проанализировано 1500 клонов E.coli DH 5а, содержавших рекомбинантную плазмиду pBluescript KS (+), на предмет их способности продуцировать хитиназу и выделен трансформированный клон E.coli DH 5а p 44, образовывавший устойчивую зону просветления вокруг колонии при культивировании в течение 14 суток при 30°С на агаризованной среде, содержащей 1% коллоидного хитина. Трансформированные клетки содержали рекомбинантную плазмиду pBluescript со вставкой EcoRI -фрагмента бактериальной хромосомы длиной 2.0 т.п.н. (Соколова и др., 1996).
Задачей настоящей работы было изучение биологических и биохимических свойств внеклеточного белка, экс-прессируемого полученным трансформантом E.coli DH 5а 44, с целью подтверждения того факта, что клонируемый нами ген действительно кодирует синтез одной из хитиназ исходного штамма S.marcescens 218.
Объектами исследований служили штамм бактерии S.marcescens 218 (коллекция типовых культур ВНИИСХМ), E.coli K12 DH 5а (rec AI lac Z, 1 - Amps) из коллекции микроорганизмов кафедры биофизики CПбГТУ, трансформант E.coli DH 5а p44, несущий рекомбинантную плазмиду pBluescript KS (+) со вставкой EcoRI - рестрикта хромосомы штамма-
Вестник защиты растений, 2, 2001 донора ДНК S.marcescens 218, предположительно кодирующего ген синтеза бактериальной хитиназы.
Анализ белков, экспрессируемых трансформантом, осуществляли методом электрофореза в 10% полиакриламидном геле в нативных и денатурирующих условиях. Внеклеточные белки экстрагировали из агара фосфатным буфером с рН 6.6, осаждали 10% трихлоруксусной кислотой (Laemmli, 1970; Остерман, 1981).
Идентификацию белковых компонентов проводили путем сравнения элек-трофоретических спектров белков в ли-затах генетически трансформированного штамма р44, штамма - реципиента E.coli DH 5а и внеклеточных белков бактериального штамма - донора ДНК (S.marcescens 218).
Изучение ингибирующего действия генетически модифицированного штамма на вегетативный рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum, изолят "ЛС" возбудителя корневой гнили и увядания растений огурца проводили методом агаровых блоков в нашей модификации (Соколова, 1995).
Результаты сравнительного электрофореза в нативной системе показали, что основная масса белка, продуцируемого рекомбинантным штаммом E.coli DH5а p44 при его культивировании на агари-зованной среде с коллоидным хитином, локализована в полосе, подвижность которой совпадает с подвижностью белкового компонента изоферментного спектра хитиназ штамма - донора ДНК (S.marcescens 218). По данным электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях с ДДС-Ма, белковый спектр внеклеточных белков трансформанта E.coli DH5а p44 характеризуется наличием компонента, отсутствующего в спектре штамма-реципиента E.coli DH5а и совпадающего по подвижности с одним из компонентов изоферментного спектра хитиназ штамма-донора ДНК
S.marcescens 218 (рис.). Так как генетически модифицированный штамм E.coli DH5а p44 отличается от исходного штамма - реципиента только тем, что со-
держит рекомбинантную плазмиду pBluescгipt КБ (+) 44, несущую фрагмент ДНК из бактерии S.marcescens 218, полученные результаты свидетельствуют о том, что этот компонент соответствует белку, экспрессируемому с одного из генов ее хитинолитического комплекса.
*л
13076 _
50 -
392717-
М / 2 3
Рис. Электрофореграммы в 10% ПААГ с ЫаДДС внеклеточных белков бактериальных штаммов при их культивировании на агари-
зованной среде с коллоидным хитином М - набор белков - маркеров молекулярного веса; 1 - S.marcescens 218, 2 - E.coli DH5а, 3 - E.coli DH5а p44
Согласно литературным данным (Fuchs et al., 1986), при анализе коммерческого препарата хитиназы S.marcescens было обнаружено 5 отдельных белков с хитиназной активностью, имеющих молекулярные массы 21, 36, 48, 54 и 57 кД соответственно. Электрофоре-тическое изучение белков, входящих в хитинолитический комплекс штамма 218 бактерии S.marcescens, показало наличие в нем 4-х белков с молекулярными массами 42, 48, 54 и 57 кД (рис., дорожка 1). Сравнительный анализ электрофоре-грамм внеклеточного белка, экспресси-руемого трансформантом E.coli DH5а p44 при культивировании на среде с коллоидным хитином, и белка, секретируемого исходным штаммом S.marcescens, выявил наличие в спектре генетического трансформанта компонента, по подвижности соответствующего одному из белков спектра этого штамма. Молекулярная масса этого белка, определенная в системе ПААГ - ДДСЫа с помощью набора стандартных белков, составила 57 кД.
Результаты изучения генетически модифицированного штамма E.coli DH5а
p44, а именно - наличие зоны просветления вокруг его колоний при культивировании на агаризованной среде с хитином субстратом для хитиназы; экспрессия трансформированными клетками белка с хитиназной активностью с молекулярной массой 57 кД, электрофоретически соответствующему одному из четырех хити-назных белков штамма - донора ДНК (S.marcescens 218), являются доказательством того, что сконструированный нами трансформант E.coli DH5а p44 несет ген синтеза хитиназы S.marcescens 218 с молекулярной массой 57 кД.
Изучение биологической активности трансформированного штамма E.coli DH5а p44 мы провели в опытах in vitro методом агаровых блоков по отношению к грибу F.oxysporum, штамм "ЛС', возбудителю корневой гнили растений огурца. Результаты экспериментов показали, что генетически модифицированный штамм р44 оказывает значительное ин-гибирующее действие на вегетативный рост мицелия патогена по сравнению с контролем (чистой средой) и исходным штаммом E.coli DH5а, не содержащим рекомбинантную плазмиду p44, что вы-
Вестник защиты растений, 2, 2001 ражается в существенном угнетении роста мицелия, его сильной изреженности, отсутствии пигментации обратной стороны колонии. Если развитие гриба в контроле принять условно за 3 балла, то состояние грибного мицелия в варианте с исходным штаммом - реципиентом E.coli DH5а соответствовало 2 условным баллам, а в варианте с генетически модифицированным штаммом E.coli DH5а р44 - 1 баллу. Поскольку эти штаммы отличаются только тем, что трансформированный штамм экспрессирует белок с хитиназ-ной активностью, полученные результаты свидетельствуют о том, что данный белок обладает определенной антигрибной активностью против одного из наиболее опасных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур.
Сконструированный нами генетически модифицированный штамм E.coli DH5а р44 представляет собой удобную модельную систему, которая позволит вычленить вклад хитиназы в механизм антагонистической активности бактерии S.marcescens по отношению к хитинсо-держащим фитопатогенам.
Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М., Наука, 1981, 278 с.
Соколова М.В. Методические подходы к созданию клонотеки фрагментов хромосомаль-ной ДНК бактерии Serratia marcescens как источника генов литических ферментов с антигрибной активностью. /Современная биотехнология в решении проблем защиты растений. Сб. научн. трудов ВИЗР, СПб., 1995, с.214-225.
Соколова М.В., Шелегедин В.Н., Попова Э.В. Клонирование гена хитиназы из бактерии Serratia marcescens в Escherichia coli.
Литература
/Биотехнология, 10, 1996, с.12-17.
Тютерев С.Л., Хацкевич Л.К., Соколова М.В., Попова Э.В. Применение хитинолитической бактерии Serratia marcescens для защиты растений огурца от почвенной фузариозной инфекции. /Доклады РАСХН, 2, 1995, с.22-24.
Fuchs R.L., McPherson S.A., Drahos D.J. Cloning of Serratia marcescens gene encoding chiti-nase. /Appl and Env.Microbiol., 51,1986,p.504-509.
Laemmli U.K. Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. /Nature, 227, 1970, р.680-685.
PROPERTIES OF THE PROTEIN, EXPRESSED BY THE E. COLI DH5A TRANSFORMANT CONTAINING THE RECOMBINANT PLASMID PBLUESCRIPT KS (+) WITH AN INSERT OF ECORI, A FRAGMENT OF DNA FROM THE BACTERIUM SERRATIA MARCESCENS E.V.Popova
The nature of the protein expressed by the E.coli DH5a transformant containing the recombinant plasmid pBluescript KS (+) with an insert of EcoRI, a fragment of S.marcescens 218 DNA was studied. This protein has been shown to be a chitinase with a molecular mass of 57 kDA and certain antifungal activity against Fusarium. oxysporum f. cucumerinum Schlechtendahl.
