CC BY
129
УДК 579.222
А. М. Марданова, Э. Х. Низамутдинова, Т. В. Ширшикова,
Л. Х. Камалетдинова, Е. О. Михайлова, М. Р. Шарипова,
Л. М. Богомольная
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ШТАММОВ SERRATIA MARCESCENS К ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА
Ключевые слова: Serratia marcescens, биоинформационный анализ, перекись водорода, чувствительность.
Проведен биоинформационный анализ генома Serratia marcescens с целью поиска и идентификации гомологов генов каталаз и пероксидаз Escherichia coli и Salmonella Typhimurium. Было показано, что в геноме S.marcescens, аналогично геному E.coli, присутствуют каталазы KatE и KatG, но не KatN. Однако, в отличие от E.coli у S.marcescens отсутствует пероксидаза AhpC, но присутствует пероксидаза TsaA, гомологичная соответствующей пероксидазе S.Typhimurium. Проведен анализ устойчивости разных штаммов S.marcescens к перекиси водорода и показано, что инактивация генов внеклеточной нуклеазы и системы рестрикции приводит к повышению чувствительности бактерий к активным формам кислорода.
Keywords: Serratia marcescens, bioinformatics, hydrogen peroxide, sensitivity.
Comparative bioinformatic genome analysis of Serratia marcescens, Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium revealed that, similar to E.coli, the genome of S. marcencens harbors genes for сatalases KatE and KatG, but not KatN. However, in contrast to E.coli, the peroxidase AhpC gene is absent from S. marcescens genome and has apparently been replaced by a putative homolog of S. Typhimurium peroxidase TsaA. Different strains of S.marcescens were tested for sensitivity to hydrogen peroxide. A restrictionless mutant strain lacking nuclease activity was found to display an elevated level of H2O2 sensitivity.
Введение
Аэробные бактерии в процессе эволюции приспособились к жизни в присутствии кислорода. Для защиты генетического материала от разрушительного действия активных форм кислорода (АФК) в клетках бактерий присутствуют такие ферменты как каталазы и пероксидазы [1].
Грамотрицательная бактерия ^етгайа тагсасвт' способна вызывать различные заболевания растений, насекомых, животных и человека[2]. В частности, было показано, что Бтагсвзсвт способна вызывать заболевания мочеполового тракта, сепсис, респираторные и глазные инфекции [2, 3]. З.тагса'свт' обладает различными факторами вирулентности. Известно, что вирулентность патогенных бактерий может регулироваться различными факторами и в частности гомосеринлактоном [4]. Важную роль в вирулентности могут играть различные эффлюкс-системы бактерий [5].
Секвенирование генома З.тагса'свт' позволило улучшить наше понимании биологии этого микроорганизма. Однако на данный момент в литературе отсутствуют данные о наличии у З.тагса'свт' генов каталаз и пероксидаз, а также о чувствительности З.тагса'свт' к перекиси водорода, одной из активных форм кислорода.
В данной работе был проведен биоинформационный анализ с целью идентификации генов каталаз и пероксидаз в геноме З.тагса'свт', а также проведен анализ устойчивости разных штаммов З.тагса'свт' к перекиси водорода.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы ^етгайа та^сгт ЯМб [6], 8Я41-8000 [7], и ТТ392 [8]. Бактерии культивировали на среде ЬБ (Ьипа Бейат) [9, 10] в колбах при соотношении среды к
объему колбы 1:5 на лабораторных качалках с интенсивностью качания 200 об/мин при температуре 37°С. Посевным материалом служил 18-часовой инокулят.
Оптическую плотность культур определяли на приборе xMark Microplate Spectrophotometer (BioRad) при длине волны 590 нм.
Для изучения влияния H2O2 на рост и жизнеспособность культур перекись водорода вносили в конечной концентрации 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ в среду культивирования и определяли динамику роста бактерий.
Концентрацию перекиси водорода в среде определяли с помощью коммерческого набора «Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit», Invitrogen, Англия. Контролем служила среда LB без бактерий.
Биоинформационный анализ геномов S. marcescens, Salmonella typhimurium, E.coli проводили с использованием различных баз данных и программ (BLAST, BLASP, NCBI, ASAP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov; https://asap.ahabs.wisc.edu/asap/home.php).
Математическую обработку данных проводили в программной среде «Microsoft Excel» путем расчета среднеквадратичного отклонения (ст). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении ст< 15%. В качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая P < 0.05 за достоверный уровень значимости.
Результаты и их обсуждение
Жизнь на Земле зародилась в атмосфере, лишенной кислорода. С повышением концентрации кислорода в среде микроорганизмы были вынуждены эволюционировать для приобретения механизмов, защищающих их от токсичного
действия кислорода, обусловленного присутствием активных форм кислорода (АФК). Внутриклеточные АФК образуются в результате переноса электронов по электрон-транспортной цепи. Образовавшиеся молекулы супероксид аниона и перекиси водорода далее превращаются в высокотоксичный гидроксил радикал, аккумуляция которого может привести к гибели клеток [1].
Бактерии семейства Enterobacteriaceae способны жить в аэробных условиях благодаря присутствию трех классов ферментов - супероксид дисмутаз, каталаз и пероксидаз. Супероксид анион является короткоживущим и быстро переходит в пероксид водорода. Пероксид водорода повреждает ДНК, а также железосодержащие белки, приводя к их инактивации. Каталазы и пероксидазы защищают клетки бактерий от таких повреждений. Так, в геноме E.coli присутствует две каталазы (KatE и KatG) и пероксидазы (AhpC и Tpx) [1]. Помимо внутриклеточного источника АФК бактерии также подвергаются дополнительному воздействию активных форм кислорода, источником которых являются другие бактерии, в частности молочнокислые бактерии, растения и макрофаги, фотохимические реакции и т.д. [11]. В связи с этим в геноме патогенной бактерии Salmonella enterica ser.Typhimurium присутствуют дополнительные каталаза (KatN) и пероксидазы (TsaA) [12, 13].
Для изучения разнообразия каталаз и пероксидаз у условно-патогенной бактерии S. marcescens был проведен биоинформационный анализ (таблица). Было показано, что в геноме
S.marcescens, аналогично геному E.coli, присутствуют каталазы KatE и KatG, но не KatN. Однако, в отличие от E.coli, у S.marcescens отсутствует пероксидаза AhpC, но присутствует пероксидаза TsaA, гомологичная соответствующей пероксидазе S. typhimurium.
Таким образом, в геноме S. marcescens идентифицированы 4 гена каталаз и пероксидаз, продукты которых обеспечивают бактериям
устойчивость к активным формам кислорода.
Следующий этап работы был посвящен исследованию чувствительности разных штаммов S. marcescens к перекиси водорода. Для этого необходимо было подобрать концентрацию Н2О2, которая бы эффективно ингибировала рост бактерий, но при этом культура не теряла жизнеспособности. С этой целью была исследована динамика роста разных штаммов S. marcescens на среде LB без Н2О2. Как видно из рисунка 1, все штаммы имеют сходный характер роста в данных условиях и выходят на стационарную фазу роста на 8-10 часы
культивирования. Обнаружены различия в плотности клеток на стационарной фазе роста
разных штаммов S. marcescens. Наибольшую
плотность (4 опт. ед) имел штамм S. marcescens SM6 на 14 час культивирования. Максимальная оптическая плотность штаммов S. marcescens TT392 и SR41-8000 достигала 3.2 и 3.7 опт. ед соответственно.
Таблица 1 - Биоинформационный анализ генома Serratia marcescens на наличие в нем генов каталаз и пероксидаз
S.marce scens FG194 S. typhimurium LT2 E.coli K12
Белок, позиция гена в геноме ген Гомология Гомология
по гену, % по белку, % по гену, % по белку %
Catalase 3234547 3235983 katE б7%* 42% б8%* 42%
Каталаз а/перок сидаза HP1 2104119 210б299 katG 78% 80% 7б% 79%
Нет katN нет нет нет Нет
Peroxire doxin 1039590 1040192 ahpC нет нет нет Нет
tsaA 82% 87% нет Нет
Peroxire doxin 2247922 2248842 5 tpx 74% 75% 80% 88%
короткие области гомологии
Чувствительность бактерий X marcescens 8М6 к различным концентрациям перекиси водорода изучали по ингибированию роста на среде ЬБ, в которую перед посевом инокулята добавляли 3% Н2О2 в конечной концентрации от 1 до 10 мМ. В течение 5-6 часов проводили измерение оптической плотности культуры (рис. 2).
Как видно из рисунка 2, присутствие перекиси водорода в культуральной среде приводит к пролонгированию ^-фазы культуры. Ингибирующий эффект зависит от концентрации перекиси водорода. Наибольшая разница в динамике роста X тагсе^сет 8М6 на контрольной среде и среде с 10 мМ перекиси водорода наблюдается на 34 часы культивирования. Перекись водорода в концентрации 10 мМ приводит к снижению оптической плотности культуры на 3 час роста на 50% и на 4 час - 40% от контроля. Однако на 5 час культивирования различие в оптической плотности культур, растущих при разных концентрациях Н2О2 значительно уменьшается и оптическая плотность достигает 1,1-1,25 опт. ед, что близко к контрольным значениям (рост на среде ЬБ). Это может быть связано с исчезновением перекиси водорода из среды в результате разложения этого короткоживущего соединения.
2 6 10 14 18 22 26 30 34
Время, ч
Рис. 1 - Динамика роста штаммов S. тигсенсеш 8М6 (1), & тагсехсп ТТ392 (2) и 8Я41-8000 (3) на среде ЬБ
Основываясь на полученных результатах для дальнейших сравнительных исследований чувствительности разных штаммов & тагсе^сеш к перекиси водорода была отобрана концентрация 10 мМ, поскольку при этой концентрации эффект подавления роста был максимален и вместе с тем, эта концентрация перекиси водорода не приводила к гибели культуры. На рисунке 3 представлены данные по изучению динамики роста разных штаммов & тагсе^'сет' в присутствии 10 мМ перекиси водорода.
Штаммы & тагсе^'сет' 8Я41-8000, &
тагсеі'сет' 8М6 и & тагсеі'сет ТТ392 различаются по чувствительности к перекиси водорода. Наиболее выражена разница в чувствительности между диким штаммом & тагсеі'сет' 8Я41-8000 и его производным мутантным ТТ392. Мутантный штамм & тагсеі'сет' ТТ392 практически полностью терял способность к росту в первые часы культивирования. Lag-период культуры
увеличивался до 4 часов. На 6 час роста оптическая плотность культуры штамма & тагсе^сет ТТ392 не превышала 0,26 опт.ед, что составляло не более 2025% от плотности культур диких штаммов.
Время, ч
Рис. 2 - Ингибирование роста культуры S. тагсе8сет 8М6 в присутствии 1 мМ (2), 5 мМ (3) и 10 мМ (4) перекиси водорода. 1- контроль (рост на среде LB)
Таким образом, в присутствии перекиси водорода происходит ингибирование роста культур. Исследуемые штаммы по-разному восстанавливают свою жизнеспособность. Это может быть связано с
Время, ч
Рис. 3 - Динамика роста штаммов S. тагсе8сеп8 8Я41-8000 (1), 8М6 (2), ТТ392 (3) на среде ЬБ в присутствии 10 мМ перекиси водорода
тем, что они способны с разной скоростью инактивировать перекись водорода. Определяли концентрацию перекиси водорода в среде культивирования с помощью набора «Атріех Яе&> (рис. 4). Показано, что в культуральной среде штамма & тагсе^сет 8М6 уже через час культивирования концентрация перекиси снижалась практически до нуля, в то время как в культуральной среде других штаммов перекись водорода исчезала только через 2 часа. За это время значительная часть культуры погибала, что и обуславливало более медленный рост культуры. Поскольку перекись водорода является нестабильным соединением и с течением времени может инактивироваться, в качестве контроля определяли ее концентрацию в среде ЬБ без бактерий. В этих условиях концентрация перекиси водорода в среде практически не изменялась в течение 4-5 часов. Это может свидетельствовать о том, что в среде культивирования исчезновение перекиси водорода связано с ее инактивацией бактериальными метаболитами.
Л 140
0 12 3 4 5
Время, ч
Рис. 4 - Концентрация перекиси водорода в культуральной среде штаммов S.marcescens 8М6 (1), 8Я41-8000 (2), ТТ392 (3). К - контроль
Таким образом, дикие штаммы &.тагсе^'сет' 8Я41-8000 и &.тагсеі'сет' 8М6 незначительно
различаются по чувствительности к перекиси водорода. Наиболее устойчивым к перекиси водорода оказался штамм & тагсе^сет 8Я41-8000. Устойчивость, видимо, связана с бактериальными
метаболитами, способными инактивировать перекись водорода в среде культивирования. Мутантный штамм S. marcescens TT392 значительно отличался от диких штаммов. Он был получен из штамма SR41-8000 и не обладает характерной для S. marcescens нуклеазной активностью и антибиотикоустойчивостью. Кроме того, в мутантном штамме отсутствует система рестрикции [8]. Мутации в геноме этого штамма, по-видимому, косвенно нарушают защитные механизмы бактерии от активных форм кислорода.
Работа поддержана Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2012-2013 гг. соглашение № 14.А18.21.0857.
Литература
1. J.A. Imlay, Annu. Rev. Biochem. 77, 755-776 (2008);
2. S. Mahlen, Clin Microbiol Rev. 24, 755-791 (2011);
3. E. Hume, M. Willcox, Archivos De La Sociedad Espanola De Oftalmologla. 79, 475-481 (2004).
4. Н.В. Белоногова, А.Б. Маргулис, В.Я. Понамарев, А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская, Вестник Казанского технологического университета, 15, 23, 109-112 (2012);
5. H.P. Schweizer, Expert. Opin. Drug Discov. 7, 7, P. 633642 (2012);
6. T.K. Ball, P.N. Saurugger, M.J. Benedik, Gene. 57, 183192. (1987);
7. H. Matsumoto, T. Tazaki, S. Hosogaya, Jpn. J. Microbiol. 17, 473-479 (1973);
8. T. Takagi, M. Kisumi, J. Bacteriol. 161, 1-6 (1985);
9. J. Sambrook, E.F. Fritsch, S.T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989, 2344 p.
10. Н.М. Замалютдинова, И.Р. Галиева, А.О. Арапова,
E.О. Михайлова, М.Р. Шарипова, А.М. Марданова, Вестник Казанского технологического университета, 16, 191-194 (2013)
11. S. Mishra, J. A. Imlay, Arch Biochem Biophys. 525, 145160 (2012);
12. S.A. Horst, T. Jaeger, L.A. Denkel, S.F. Rouf, M. Rhen,
F.C. Bange, J. Bacteriol. 192, 2929-2932 (2010);
13. V. Robbe-Saule, C. Coynault, M. Ibanez-Ruiz, D. Hermant, F. Norel,Mol. Microbiol. 39, 1533-1545 (2001).
© А. М. Марданова - к.б.н., доцент каф. микробиологии К(П)ФУ, mardanovaayslu@mail.ru; Э. Х. Низамутдинова - магистр той же кафедры; Т. В. Ширшикова - студ. той же кафедры; Л. Х. Камалетдинова - студ. той же кафедры; Е. О. Михайлова - к.б.н., доцент каф. БСМЭ КНИТУ, katyushka.glukhova@gmail.com; М. Р. Шарипова - д.б.н., проф. каф. микробиологии К(П)ФУ, marsharipova@gmail.com Л. М. Богомольная - к.б.н., асс. профессора Техасский аграрнотехнический университет, Техас, США, Bogomolnaya@medicine.tamhsc.edu.
