Влияние экстрактов серпухи венценосной и пажитника сенного на устойчивость бактерий Escherichia coli к пероксидному стрессу

Безматерных Ксения Викторовна; Володин Владимир Витальевич; Володина Светлана Олеговна; Самойлова Зоя Юрьевна; Смирнова Галина Васильевна; Октябрьский Олег Николаевич

УДК 57.083.138.4

ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТОВ СЕРПУХИ ВЕНЦЕНОСНОЙ И ПАЖИТНИКА СЕННОГО НА УСТОЙЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COII К ПЕРОКСИДНОМУ СТРЕССУ

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь 2Институт биологии Коми научного центра УрО РАН, Сыктывкар

Поступила 01.06.2013

Исследовалось влияние экстрактов серпухи венценосной, пажитника сенного и экдистероидсодержащей субстанции Серпистен на экспрессию стрессовых генов и устойчивость бактерий Е. coli к действию перекиси водорода. Установлено, что все изученные субстанции вызывают экспрессию антиоксидантных генов liatG и sodA, кодирующих каталазу-гидропероксидазу I и Мп-супероксиддисмутазу, соответственно. Экстракты серпухи и пажитника проявляли протекторный эффект от бакгериостатических доз перекиси водорода, в то время как Серпистен не влиял на устойчивость бактерий к пероксидному стрессу. Защитное действие экстрактов, по-видимому, было обусловлено содержанием в них полифенолов, обладающих радикалсвязывающей, хелатирующей и прооксидантной активностью.

Ключевые слова: экстракты растений, экдистероиды, полифенолы, антиоксидантные гены, бактерии Escherichia coli, пероксидный стресс.

чевое, гематопротекторное, стресс-протекторное, нейротропное, противодиабетическое и гиполипи-демическое действие Серпистена [2]. В то же время необходимы дополнительные исследования фито-экдистероидов, чтобы подтвердить их безвредность для человека. С этой точки зрения представляется актуальным исследование влияния экдистероидсо-держащих субстанций на микробиоту человека, которая в последние годы рассматривается как полноценный орган, выполняющий важные метаболические функции. Целью данной работы являлось изучение влияния экстрактов серпухи венценосной и пажитника сенного, а также субстанции Серпистен на экспрессию стрессовых регулонов и устойчивость к пероксидному стрессу у обычного обитателя кишечника бактерии Е. coli.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Используемые в работе штаммы Е. coli NM3021 СkatGrlacZ), NM3041 (rpoSrlacZ) и NM3031 (katEr.IacZ) созданы на основе штамма BW25113 (дикий тип) путем трансформации плазмид рКТЮЗЗ (katGrlacZ) (получена в дар от К. Тао, Япония), pRS415 katl-5 (rpoSrlacZ) и pRSkat/A6 {katEr.IacZ) (дар проф. А.Эйзенштарка, США), несущих слияния промоторов изучаемых генов со структурным геном (З-галактозидазы. Штамм NM3001 (sodAr.IacZ) сконструирован путем транс-дукции фагом Р1 хромосомного слияния sodAr.IacZ из штамма QC772 (проф. Д. Тоуати, Франция) в штамм BW25113. Бактерии выращивали на среде М9 с добавлением 2 г/л глюкозы, 0.2% казамино-вых кислот и 10 мкг/мл тиамина. За ростом бактерий следили путем измерения оптической плотности культуры при длине волны 600 нм.

Устойчивость бактерий к пероксидному стрессу определяли следующим образом. Ночную культуру выращивали в термостате при 37°С. Клетки из ночной культуры центрифугировали и переносили в

1567

Растения способны синтезировать широкий спектр биологически активных соединений разнообразной химической природы, функции большинства из которых до настоящего времени недостаточно изучены. Большой научный и практический интерес представляют исследования фитоэкдисте-роидов, структурно идентичных или близких гормонам линьки членистоногих. Предполагается, что в растениях фитоэкдистероиды выполняют экологическую функцию, участвуя во взаимоотношениях между растениями и растительноядными беспозвоночными и регулируя численность фитофагов. Экдистероиды непосредственно не взаимодействуют с рецепторами стероидных гормонов млекопитающих, однако проявляют высокую биологическую активность, положительно влияя на обменные процессы в организме и повышая устойчивость к различным стрессовым воздействиям [1]. На основе экстрактов растений, богатых экдистероидами, созданы препараты, обладающие адаптогенными свойствами. К ним относится экдистероидсодер-жащая субстанция Серпистен, разработанная коллективом лаборатории биохимии и биотехнологии Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Серпистен получен из надземных частей серпухи венценосной (Serratilla coronata ) и представляет собой смесь 20-гидроксиэкдизона (20Е) и инокостерона (In), являющегося структурным изомером 20Е, в соотношении 8:1. Продемонстрировано противолу-

Безматерных Ксения Викторовна, инженер, аспирант, е-mail: hydrargyram(a!iegm.ra; Володин Владимир Витальевич, д.б.н., проф., заведующий лабораторией, e-mail: volo-din(a!ib.komisc.ra; Володина Светпана Олеговна, к.б.н., старший научный сотрудник, e-mail: volodina(a!ib.komisc.ru; Самойлова Зоя Юрьевна, к.б.н., научный сотрудник, e-mail: samzu(a)mail.ru; Смирнова Галина Васильевна, д.б.н., ведущий научный сотрудник, e-mail: smirnova(a!iegm.ra; Октябрьский Олег Николаевич, д.б.н., проф., заведующий лабораторией, e-mail: oktyabr(a!iegm.ra.

колбы объемом 250 мл, содержащие 100 мл среды М9, до начальной СЮбоо=0.1 и выращивали на качалках при скорости вращения 140 об/мин и температуре 37°С до СЮбоо=0.6. Далее культуру центрифугировали и ресуспендировали в 8 мл среды М9. В ячейки иммунологического планшета добавляли по 5 мкл исследуемых экстрактов, 5 мкл концентрированных клеток (до конечной СЮбоо=0.1) и среду М9 до общего объема 200 мкл. СЮбоо измеряли до и после добавления клеток, чтобы учесть цветность экстракта. Планшеты культивировали на качалках (140 об/мин, температура 37°С) 20 мин, измеряли СЮ бои и в опытные ячейки вносили Н2О2 до концентрации 0.1 мМ и 4 мМ. Культивирование продолжали в течение 30 мин, после чего измеряли СЮ 600 на микропланшетном спектрофотометре ВюЯас! хМагк. Удельную скорость роста (ц) рассчитывали по формуле ц = 1п (Ы \Мч)/^ -Ь. где N0 и N1 - оптическая плотность культуры во время ^ ни, соответственно.

Уровень экспрессии генов определяли путем измерения активности (З-галактозидазы в штаммах, несущих слияния с геном 1ас2. Активность (3-галактозидазы измеряли по методу Миллера [3], модифицированному для иммунологических планшетов [4]. Также определяли радикалсвязывающую активность [5], металл-хелатирующую способность экстрактов [6] и содержание полифенолов в испытуемых экстрактах [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты экспериментов по влиянию исследуемых субстанций на экспрессию стрессовых генов и устойчивость бактерий к пероксидному стрессу представлены в таблице 1.

Все экстракты и Серпистен при концентрации в среде культивирования 0.4 мг и 0.1 мг сухого вещества на 1 мл среды, соответственно, не оказывали существенного влияния на скорость роста бактерий. Исключение составлял экстракт пажитника сенного, который в трех штаммах из четырех изученных ингибировал рост на 20%. Присутствие экстрактов серпухи и пажитника в среде культивирования приводило к 1.5-2-кратному повышению уровня экспрессии генов каКт и .тс/А, кодирующих каталазу-гидропероксидазу I и Мп-супер-оксиддисмутазу, соответственно. Серпистен также повышал экспрессию генов каКт в 1.6 раза и .тс/А в 1.3 раза. Экстракты серпухи и Серпистен не оказывали существенного влияния на экспрессию генов гроН и ка1Е. Экстракт пажитника индуцировал экспрессию гена гроБ в 1.24 раза и гена ка/Е - в 1.37 раза. Ген гроН кодирует о8 субъединицу РНК-полимеразы (ЯроБ), которая контролирует экспрессию большого числа генов общего стрессового ответа, индуцируется при замедлении роста и обеспечивает устойчивость ко многим стрессам. Ген к^Е находится под контролем ЯроБ и кодирует гидро-пероксидазу II. Индукция гроН и кМЕ в присутст-

вии экстракта пажитника может быть связана с его ингибирующим влиянием на рост бактерий, которое наблюдалось в наших экспериментах.

Внесение перекиси водорода в среду культивирования сопровождается полной остановкой роста бактерий, возобновление роста происходит при снижении концентрации пероксида в среде под действием внутриклеточных катал аз. Величина удельной скорости роста бактерий через 30 мин экспозиции к Н2О2 может служить мерой устойчивости бактерий к пероксидному стрессу [8, 9]. Предобработка бактериальных культур всех изученных штаммов экстрактами серпухи и пажитника до добавления 4 мМ Н2 О2 приводила к 2-3-кратному возрастанию скорости роста по сравнению с культурой, предобработанной диметилсульфоксидом, который использовался в качестве растворителя для экстрактов. Таким образом, экстракты проявляли адаптогенное действие, повышая устойчивость бактерий к перекиси водорода. Серпистен в изученной концентрации не оказывал защитного влияния на рост бактерий.

Ген katG индуцируется в ответ на повышение концентрации эндогенной и экзогенной перекиси водорода. В наших экспериментах внесение Н2О2 в среду приводило к повышению экспрессии гена katG, как в контрольной культуре, так и в культурах, предобработанных исследуемыми субстанциями. Причем в культурах, предобработанных экстрактами, экспрессия katG была значительно выше, чем в культурах, предобработанных Серпи-стеном. Экспрессия гена кatE, кодирующего гидро-пероксидазу II, после внесения Н2О2 возрастала примерно одинаково и в контрольной, и во всех опытных культурах. Следовательно, повышенный уровень каталазы-гидропероксидазы I, кодируемой геном katG, может быть одной из основных причин защитного действия экстрактов при пероксидном стрессе.

Ранее мы показали, что растительные полифенолы защищают бактерии Е. coli от пероксидного стресса благодаря повышению экспрессии гена katG и, соответственно, активности каталазы HPI [10]. Механизм действия полифенолов включал как их прооксидантные эффекты (способность к ауто-окислению с образованием Н2 СЬ ), так и способность хелатировать внутриклеточное железо, уменьшая производство токсичных гидроксильных радикалов. Продукция низких доз Н2О2 при ауто-окислении полифенолов способствует развитию адаптивного ответа, который снижает повреждающее действие перекиси водорода при последующем добавлении ее более высокой дозы. Мы измерили уровни полифенолов, а также радикалсвязывающую и хелатирующую активность экстрактов и Серпистена (табл. 2).

1568

Таблица 1. Влияние исследуемых субстанций на экспрессию стрессовых генов и устойчивость бактерий Е. coli к действию 4 мМ Н2О2

Штамм и Контроль (ДМСО) S. Coronata (IS) S. coronata (2S) Trigonella foemim-graecum Серпистен

условия

Р- Р- Р- Р- Р-

ц, час 1 галакто-зидаза час 1 галакто-зидаза час 1 галакто-зидаза час 1 галакто-зидаза ц, час 1 галакто-зидаза

кмО::1ас2 0.94±0.0 109 0.91±0.0 171 ±11 *(1.57) 0.93±0.0 157 1.0±0.05 229 0.93±0.0 171 ±12 *(1.57)

ДО Н2О2 5 ±14(1.0) 4 3 ±16(1.44) ±18*(2.1) 3

кмО::1ас2 0.29 0.59 0.54 0.55 0.27±0.0 4(0.93)

30 мин по- ±0.04 177±22 ±0.04 411±44* ±0.05 398±36* ±0.03 383±30* 285±46

сле Н2О2 (1.0) *(2.03) *(1.86) *(1.9)

,юс1Л::1ас2 0.97±0.0 104 0.98±0.0 209 0.99±0.0 161 0.73±0.0 197 ±15 *( 1.89) 0.93±0.0 136

ДО Н2О2 4 ±5(1.0) 3 ±20*(2.0) 4 ±9*(1.54) 3 6 ±7*(1.31)

,юс1Л::1ас2 0.31 0.75±0.0 4*(2.42) 0.61 0.63 0.39

30 мин по- ±0.02 280±18 406±34* ±0.04 367±13* ±0.04 457±26* ±0.03 299±22

сле Н2О2 (1.0) *(1.97) *(2.03) (1.26)

гро&::1ас2 ДО Н2О2 0.88±0.0 3 330±19 0.94±0.0 6 381±30 0.79±0.0 6 378±41 0.72±0.0 3 408±45 0.75±0.0 7 403±38

гро&::1ас2 0.18 0.67 0.59 0.61 0.18

30 мин по- ±0.02 535±20 ±0.04 410±23* ±0.07 367±26* ±0.02 391±29* ±0.02 508±23

сле Н2О2 (1.0) *(3.72) *(3.28) *(3.39) (1.0)

кМЕ::1ас2 ДО Н2О2 0.93±0.0 3 693±29 0.93±0.0 3 752±43 1.0±0.03 747±60 0.77±0.0 2 950±100 * 0.93±0.0 2 702±54

кМЕ::1ас2 0.29 0.66 0.56 0.45 0.32

30 мин по- ±0.02 1102±35 ±0.02 1046±80 ±0.04 1119±90 ±0.04 1208±66 ±0.03 1171±71

сле Н2О2 (1.0) *(2.28) *(1.93) *(1.55) (1.1)

Прим. Культуры Е. соИ 1ЯМ3021 (ШО::1асГ), ЫМ3001 (эос14::1асг), ЫМ3041 (гро5::1ас7?) и №N/13031 (кшЕ::1ас2) выращивали 20 мин в присутствии ДМСО или исследуемых субстанций, а затем обрабатывали 4 мМ перекиси водорода. Степень защитного действия субстанций оценивали по скорости роста бактерий через 30 мин после добавления ЕЬСЬ. Уровень экспрессии генов определяли по активности Р-галакгозидазы в штаммах, несущих слияние промотора исследуемого гена со структурным геном Р-галактозидазы. В скобках представлены отношения величин удельной скорости роста или активности Р-галактозидазы в присутствии субстанций к контрольным значениям. Статистически значимые отличия отмечены звездоч-

Таблица 2. Содержание полифенолов, радикалсвязывающая (по ЭРРН) и хелатирующая активность в исследуемых субстанциях

Экстракты Полифенолы мкг/мг сух. экстракта Связывание DPPH % Хелатирование %

S. coronate (1S) 17.5 ±0.2 52 ±3 7 ± 0.1

S. coronate (2S) 14.4 ±0.4 38 ±2 33 ±5

Т. foemim-graecum 28.2 ±0.2 53 ±2 45.5 ± 1.7

Серпистен 6.3 ±0.2 1.4 ±0.5 0

Прим. 25 мг сухого экстракта растворяли в 1.5 мл ДМСО.

Для определения полифенолов использовали 10 мкл этих растворов.

Для определения хелатирующей способности - 60 мкл этих растворов.

Для определения радикал связывающей активности (по БРРН) - 100 мкл этих растворов.

Значения для полифенолов приведены в эквивалентах галловой кислоты.

Экстракты содержали значительное количество полифенолов и существенно превышали Серпистен по способности к связыванию радикалов DPPH и хелатированию железа. В целом протекторное действие экстрактов серпухи и пажитника при перок-сидном стрессе у бактерий Е. coli может быть в большей степени связано с содержанием полифенолов, чем экдистероидов, что согласуется с ранее

полученными данными [11]. Авторы цитируемой работы показали, что флавоноидсодержащая фракция экстракта 5". согопа1а была более эффективна в качестве антиоксиданта при перекисном окислении липидов, чем экдистероидсодержащая фракция. Вместе с тем известно, что экдистероиды могут проявлять антиоксидантные свойства, снижая пе-рекисное окисление липидов у крыс и повышая ак-

1569

тивность ферментов антиоксидантной защиты организма - каталазы и супроксиддисмутазы [12]. Интересно, что, несмотря на различия в используемой модели (бактерии и крысы), мы также наблюдали повышение экспрессии генов, кодирующих катала-зу и супероксиддисмутазу при обработке бактерий Серпистеном. 20-гидроксиэкдизон в 1.33 раза повышал экспрессию гена katG, но не индуцировал экспрессию гена sodA. Механизмы повышения экспрессии антиоксидантных генов при действии эк-дистероидов нуждаются в дальнейших исследованиях.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, соглашение 8114, гранта Президента РФ МК-1763.2012.4 для молодых ученых, а также гранта №12-И-4-2072 по Программе интеграционных проектов Президиума УрО РАН.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lafont R. Recent Progress in Ecdysteroid Pharmacology // Теор. прикл. экология. 2012. № 1. С. 6-12.

2. Володин В.В., Матаев С.И. Экдистероидсодержащие растения - источники новых адаптогенов // Вест, био-тех. физ-хим. биологии. 2011. Т. 7. № 2. С. 52-59.

3. Miller J.H Experiments in Molecular Genetics. New York: Cold Spring Harbor. 1972.

4. Smimova G., Samoilova Z., Muzvka N., Oktyabrsby O. Influence of plant polyphenols and medicinal plant extracts on antibiotic susceptibility of Escherichia coli II J. Appl. Microbiol. 2012. V. 113. P. 192-199.

5. Kim H.-J., Chen F., WangX., Chung H.Y., Jin Z. Evaluation of antioxidant activity of vetiver (Vetiveria zizanioides L.) oil and identification of its antioxidant constituents // J. Agrie. FoodChem. 2005. V. 53. P. 7691-7695.

6. Shviir L.-F. Tsung J.-H., Chen J.-H., Chin C.-Y., Lo C.-P. Antioxidant properties of extracts from medicinal plants popularly used in Taiwan // hit. J. Appl. Sci. Eng. 2005. V. 3. P. 195-202.

7. Wu L.-C., Hsu H.-W., Chen Y.-C., Chin C.-C., Lin Y.-I., Ho J.A. Antioxidant and antiproliferative activities of red pitaya // Food Chem. 2006. V. 95. P. 319-327.

8. Smimova G.V., Vvsochina G.I., Muzvka N.G., Samoylova Z.Y., Kukushkina T.A, Oktyabrsliy O.N. Evaluation of antioxidant properties of medicinal plants using microbial test systems // World J. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 26. P. 2269-2276.

9. Oktyabrsliy O., Vvsochina G., Muzvka N, Samoilova Z., Kukushkina Т., Smimova G. Assessment of antioxidant activity of plant extracts using microbial test systems // J. Appl. Microbiol. 2009. V. 106. P. 1175-1183.

10. Smimova G.V., Samoylova Z.Y., Muzvka KG., Olüyabrslty O.N. Influence of polyphenols on Escherichia coli resistance to oxidative stress // Free Radie. Biol. Med. V. 46. P. 759768.

11. Barthoria M, Zupkotb I., Hunyadia A., Gatcsnet-Baitzc E., Dinyac Z., Fotgord P. Monitoring the antioxidant activity of extracts originated from various Serratilla species and isolation of flavonoids from Serratilla coronata И Fitoterapia. 2004. V. 75. P. 162-167.

12. Хушбактова 3.A., Царук A.B., Гукасов B.M., Сыров В.H. Экспериментальная оценка действия фитоэкдистерои-дов на процессы перекисного окисления липидов печени крыс при проведении опытов in vitro и in vivo // Теор. прикл. экология. 2012. № 1. С. 31-34.

THE INFLUENCE OF SERRATULA CORONATA AND TRIGONELLA FOENUM-GRAECUM EXTRACTS ON RESISTANCE OF BACTERIA ESCHERICHIA COII

TO PEROXIDE STRESS

institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural branch of RAS, Perm 2 Institute of Biology, Komi Sci. Centre, Ural branch of RAS, Syktyvkar

The influence of Seiratula coronata and Trigonella foenum-graecum extracts and ecdisteroid-containing substance Serpisten on stress gene expression and resistance of bacteria E. coli to action of hydrogen peroxide was investigated. All the substances studied were shown to increase expression of antioxidant genes liatG and sodA, encoding catalase-hydroperoxidase I and Mi-superoxidedismutase, respectively. The extracts of S. coronata and T. foenum-graecum protected bacteria against bacteriostatic doses of hydrogen peroxide, while Serpisten did not affect bacterial resistance to peroxide stress. Apparently, the observed protection was due to the extracts' content of polyphenols which demonstrated radical-scavenging, metal-chela ting and prooxidant activities.

Key words: plant extracts, ecdisteroids, polyphenols, antioxidant genes, bacteria Escherichia coli, peroxide stress.

Ksenia Bezmaternykh, engineer, postgraduate student, e-mail: hydrargyrum(S!iegm.ru; lladimir Volodin, Doctor of Biology, professor, head of laboratory, e-mail: volodin(S)ib.komisc.ru; Svetlana Volodina, Candidate of Biology, senior researcher, email: volodina(S)ib.komisc.ru; Zoya Samoilova, Candidate of Biology, researcher, e-mail: samzu(S)mail.ru; Galina Smimova, Doctor of Biology, leading researcher, e-mail: smirnova(S!iegm.ru; Oleg Olityabrsliy, Doctor of Biology, professor, head of laboratory, e-mail: oktyabr(S)iegm.ru

1570

THE INFLUENCE OF SERRATULA CORONATA AND TRIGONELLA FOENUMGRAECUM EXTRACTS ON RESISTANCE OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI TO PEROXIDE STRESS

Текст научной работы на тему «Влияние экстрактов серпухи венценосной и пажитника сенного на устойчивость бактерий Escherichia coli к пероксидному стрессу»