CC BY
58
УДК 579.222
Л. Е. Матросова, И. В. Хиляс, Т. В. Ширшикова,
Л. Х. Камалетдинова, Ю. В. Данилова, Е. О. Михайлова, М. Р. Шарипова, Л. М. Богомольная
АНАЛИЗ МЕТАБОЛИТОВ SERRATIA MARCESCENS, СЕКРЕТИРУЕМЫХ
В УСЛОВИЯХ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА
Ключевые слова: Serratia marcescens, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тандемная масс-спектрометрия, перекись водорода, активные формы кислорода (АФК), метаболиты.
Проведен анализ секретируемых метаболитов Serratia marcescens в присутствии и отсутствии перекиси водорода с целью установления изменений в секретоме этих бактерий в ответ на оксидативный стресс. Было показано, что оптимальной концентрацией перекиси водорода для анализа метаболитов в среде является концентрация 6 мМ. В ответ на присутствие перекиси в среде наблюдается изменение профиля метаболитов S. marcescens на хроматограмме. Определено соотношение массы к заряду, а также установлены предполагаемые химические формулы для пяти образцов сред, содержащих метаболиты. Четыре пика из пяти обладают большей интенсивностью в препарате, полученном из культуры, выращенной без добавления перекиси.
Keywords: Serratia marcescens, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), LC-MS, hydrogen peroxide, reactive oxygen
species (ROS), sensitivity.
Comparative analysis of Serratia marcescens secreted metabolites was performed on bacterial cultures grown in the presence or absence of hydrogen peroxide. It was found that the optimal concentration of hydrogen peroxide for metabolite analysis is 6 mM. Exposure to hydrogen peroxide significantly altered metabolite profile. Mass to charge ratio (m/z) and the tentative chemical formula were determined for five major peaks. Four out offive peaks have higher intensity in the sample collected from the bacteria grown in the absence of hydrogen peroxide.
Введение
Многие заболевания человека и животных вызываются бактериями семейства Enterobacteriaceae, среди которых наиболее изученными являются такие известные патогены как Escherichia coli (штамм H157:O7), Salmonella enterica, Shigella dysenteriae и другие. Долгое время считалось, что Serratia marcescens не является патогеном человека, однако в последние годы стали появляться тревожные данные о том, что S. marcescens относится к опасным возбудителям внутрибольничных инфекций. Согласно результатам совместной американо-европейской программы SENTRY по наблюдению за внутрибольничными инфекциями за период 20092012 гг., S. marcescens была в числе десяти наиболее часто встречающихся изолятов, полученных от больных пневмонией [1]. У многих пациентов больничных стационаров S. marcescens может вызывать заболевания центральной нервной системы (менингит), инфекции мочеполовой системы, болезни дыхательных путей, эндокардит и сепсис [2]. Основной проблемой эффективного лечения больных, зараженных S. marcencens, является то, что этот патоген обладает устойчивостью к большинству классов антибиотиков.
Важную роль в развитии воспалительных заболеваний играют процессы свободнорадикального окисления: генерация активных форм кислорода (АФК), оксида азота, гипохлорита и других активных метаболитов фагоцитирующими клетками и перекисное окисление липидов. Продукция токсичных активных форм кислорода клетками иммунной системы (нейтрофилами и макрофагами) является одним из механизмов защиты организма-хозяина. Более того, применение антибактериальных препа-
ратов ассоциировано с генерацией АФК, особенно высокотоксичного гидроксильного радикала [3].
Целью исследования явилось изучение влияния перекиси водорода на изменения в репертуаре внеклеточных метаболитов культуры клеток Serratia marcescens SM6.
Материалы и методы
Объектом исследования являлся дикий штамм бактерий S. marcescens SM6. Для получения ночной культуры бактерии выращивали в LB-бульоне, содержащем (г/л): 10 г триптон, 5 г дрожжевой экстракт, 5 г NaCl при температуре 370C со скоростью перемешивания 250 об/мин. Ночную культуру S. marcescens SM6 дважды отмывали фосфатным буфером (рН 7.0) и вносили в соотношении 1:100 в минимальную среду М9, содержащую (г/л): 6.77 г Na2HPO4, 3 г KH2PO4, 1 г NH4Cl, 0.5 г NaCl, 0.246 г MgS04х7Н20, 0.011 г CaCl2, 3.6 г глюкозы, рН 7.0. Эксперименты проводили в присутствии перекиси водорода в концентрации 1-10 мМ. Культивирование S. marcescens SM6 в среде в отсутствии перекиси водорода использовали в качестве контроля. Жизнеспособность клеток S. marcescens SM6 определяли методом серийных разведений с подсчетом колониеобразующих единиц (КОЕ/мл).
Экстракцию метаболитов проводили из 4-часовой культуральной жидкости (400 мл) S. mar-cescens SM6, выращенной в присутствии/отсутствие перекиси водорода. Клетки отделяли от культураль-ной жидкости центрифугированием со скоростью 11000 мин-1 в течение 3 минут при комнатной температуре с использованием центрифуги Hettich Ro-tanta 460 RF (Великобритания). Полученный фугат дополнительно фильтровали, используя фильтр с размером пор 0.22 мкм (Millipore Express PLUS (PES) Stericup filter unit, Millipore, США) для удале-
ния остаточных бактериальных клеток и пропускали через картриджи для твердофазной экстракции Supelco Discovery DSC-18 (Supelco, США). Элюцию метаболитов проводили с использованием 100% метанола. Смесь метаболитов сконцентрировали и высушивали при комнатной температуре на вакуумном испарителе Concentrator plus/V acufuge plus, (Eppendorf, Германия). Высушенную смесь метаболитов перерастворяли в 100% метаноле для проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе UltiMate 3000 UHPLC system (Thermo Scientific, Dionex, США). Для разделения использовали обратно-фазную хроматографиче-скую колонку Acclaim® PolarAdvantage II (PA2) С18 (5 мкм, 250 х 4,6 мм). В качестве подвижной фазы использовали воду и 80 % ацетонитрил, содержащие 0.01 % трифторуксусную кислоту (ТФА). Скорость потока составляла 1 мл/мин. Детекцию метаболитов проводили при 210 нм.
Результаты и их обсуждение
Продукция активных форм кислорода является неизбежным следствием аэробного существования живых организмов. Супероксидный радикал, перок-сид водорода, гидроксильный радикал продуцируются в качестве побочных продуктов электронно-транспортной цепи в процессе окислительного фос-фолирирования [4]. Для защиты от токсического действия активных форм кислорода (АФК) в клетках бактерий синтезируются ферменты супероксид дисмутазы, каталазы и пероксидазы, которые способны нейтрализовать АФК путем ферментативного расщепления. В частности, по данным А.М. Марда-новой и соавторами [5] в геноме S. marcescens идентифицированы гены каталаз и пероксидаз (KatE, KatG, TsaA), продукты которых обеспечивают бактериям устойчивость к активным формам кислорода. Однако. помимо ферментов бактерии используют дополнительные способы защиты от АФК. В частности, часто в качестве молекулы-антиоксиданта бактерии используют кофактор НАД (никотинамидадениндинуклеотид), участвующий в окислительно-восстановительных реакциях
(NADH/NADPH pool), молекулы бета-каротина, альфа-токоферола, аскорбиновой кислоты и глюта-тиона [6]. У энтеробактерий, к которым относится S. marcescens, неферментативная защита от АФК чаще всего осуществляется при помощи глютатиона и тиоредоксина [7]. Тем не менее, все эти молекулы находятся внутри бактериальных клеток и то, каким образом бактерии реагируют на оксидативный стресс на уровне секретома, на данный момент остается неизвестным.
На первом этапе работы подбирали оптимальную концентрацию перекиси водорода, при которой эффект подавления роста S. marcescens был максимален и, вместе с тем, не приводил к скорой гибели культуры.
Ингибирующий эффект зависел от концентрации перекиси водорода. Как видно из рисунка 1, перекись водорода в концентрации 3 и 4 мМ не подавляла рост и не влияла на жизнеспособность культуры клеток S. marcescens SM6. Значительное снижение
жизнеспособности (в среднем на 21% и 23%) наблюдалось после 2 часов культивирования SM6 в присутствии 5 и 6 мМ Н2О2, соответственно. Продолжительное культивирование приводило к дальнейшему снижению жизнеспособности культуры marcescens, однако, после 24 часов инкубирования в среде, содержащей перекись водорода в концентрации 5 или 6 мМ, рост культуры восстанавливался. Для дальнейших исследований использовали куль-туральную жидкость marcescens SM6, полученную после 4 часов роста в присутствии 6 мМ Н2О2.
Рис. 1 - Жизнеспособность культуры клеток marcescens SM6 в присутствии различных концентраций перекиси водорода
Для исследования влияния активных форм кислорода на культуру клеток marcescens SM6 был проведен ВЭЖХ анализ среды, содержащей внеклеточные метаболиты. Было обнаружено, что перекись водорода влияет на состав метаболитов, продуцируемых marcescens SM6. Метаболиты со временем удерживания 18.0-18.2; 19.6-19.8; и 23.6-23.9 минут были обнаружены в среде только для marcescens SM6, выращенной в отсутствии перекиси водорода (рис. 2).
0 5 10 15 20 25 30 Time [mn]
|— IK18.5C3.01_1 308.d: BFC +All MS —IK19 GC401113 Bi BFC+All M6
Рис. 2 - ВЭЖХ хроматограмма внеклеточных метаболитов, продуцируемых S. marcescens SM6 в присутствии (№1) и отсутствие (№2) перекиси водорода
Дальнейший анализ хроматографических пиков позволил определить для каждого отношение массы к заряду (m/z) (табл.1). Наиболее значимыми для исследования явились пики, которые были обнаружены в обоих исследуемых образцах. Для соединения с m/z 274.2743 была определена формула Ci6H36NO2, а для соединения с m/z 409.1623 были
найдены формулы С22Н26№06 и С23Н22Ы4№02. Стоит отметить, что пик со временем удерживания 17.217.3 мин обнаружен в обоих образцах, однако интенсивность сигнала значительно ниже в среде для & marcescens SM6, выращенной в присутствии перекиси водорода (рис. 2, табл. 1).
Таблица 1 - Идентификация метаболитов, присутствующих в культуральной жидкости Serratia marcescens SM6
№ Время удерживания соединения, мин. m/z Формула соединения H2O 2
1 17.2-17.3 [M+H]+ 274.2743 Q6H36NO2 +/-
2 18.3-18.6 [M+Na]+ 409.1623 C22H26NaO6 C23H22N4NaO2 +/-
3 18.0-18.2 [M+H]+ 302.3047 Q8H40NO2 -
4 19.6-19.8 [M+H]+ 284.3306 478.3218 C19H42N C33H40N3
5 23.6-23.9 [M+H]+ 282.2797 563.552 896.6307 QsHaNO C36H71N2O2 C46H90NO15
По результатам данного исследования было установлено, что в присутствии перекиси водорода изменялся состав метаболитов, секретируемых & тагсе&'сет' SM6 в культуральную жидкость. В частности, на хроматограммах было обнаружено несколько пиков, которые исчезали из культуральной жидкости в услових оксидативного стресса. В дальнейшем планируется проведение анализа метаболи-
тов с использованием бактериальной культуры большего объема с целью идентификации метаболитов, появляющихся в культуральной жидкости в ответ на присутствие перекиси водорода.
Дальнейшие исследования, посвященные идентификации метаболитов, направлены на определение механизмов, которые используют бактерии для защиты от окислительного стресса.
Работа поддержана грантом РНФ 16-14-10200. Литература
1. Sader, H.S., et al., Antimicrobial susceptibility of Gramnegative organisms isolated from patients hospitalised with pneumonia in US and European hospitals: results from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 2009-2012. Int J Antimicrob Agents, 2014. 43(4): p. 328-34.
2. Mahlen, S.D., Serratia infections: from military experiments to current practice. Clin Microbiol Rev, 2011. 24(4): p. 75591.
3. Kohanski, M.A., et al., A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell, 2007. 130 (5): p. 797-810.
4. Gonzalez-Flecha, B. and B. Demple, Metabolic sources of hydrogen peroxide in aerobically growing Escherichia coli. J Biol Chem, 1995. 270(23): p. 13681-7.
5. Марданова, А.М., Э.Х.; Ширшикова, Т.В.; Камалетди-нова, Л.Х.; Михайлова, Е.О.; Шарипова, М.Р.; Богомольная, Л.М., Чувствительность штаммов Serratia marcescens к перикиси водорода Вестник Казанского технологического университета, 2013. 16(19): p. 215-219.
6. Cabiscol, E., J. Tamarit, and J. Ros, Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species. Int Microbiol, 2000. 3(1): p. 3-8.
7. Farr, S.B. and T. Kogoma, Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Microbiol Rev, 1991. 55(4): p. 561-85.
© Л. Е. Матросова, к.б.н., с.н.с. Института фундаментальной медицины и биологии К(П)ФУ, m.lilia.evg@yandex.ru; И. В. Хиляс, к.б.н., с.н.с. Института фундаментальной медицины и биологии К(П)ФУ; Т. В. Ширшикова, аспирант кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии К(П)ФУ, tatyana-shirshikova@yandex.ru; Л. Х. Камалет-динова, аспирант кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии К(П)ФУ, leysan92@gmail.com; Ю. В. Данилова, к.б.н., н.с. Института фундаментальной медицины и биологии К(П)ФУ, danilova146@mail.ru; Е. О. Михайлова, к.б.н., доцент каф. БСМЭ КНИТУ, katyushka.glukhova@gmail.com, М. Р. Шарипова, д.б.н., профессор кафедры микробиологии К(П)ФУ,, marsharipova@gmail.com; Л. М. Богомольная, к.б.н., в.н.с. Института фундаментальной медицины и биологии К(П)ФУ, LMBogomolnaya@kpfu.ru.
© L. E. Matrosova, PhD, research associate, Institute of Fundamental medicine and biology, Kazan (Volga river) federal university, m.lilia.evg@yandex.ru, I. V. Khilyas, PhD, research associate, Institute of Fundamental medicine and biology, Kazan (Volga river) federal university, irina.khilyas@gmail.com, T. V. Shirshikova, PhD student, Institute of Fundamental medicine and biology, Kazan (Volga river) federal university, tatyana-shirshikova@yandex.ru, L. Kh. Kamaletdinova, PhD student, Institute of Fundamental medicine and biology, Kazan (Volga river) federal university, leysan92@gmail.com, Yu. V. Danilova , PhD, research associate, Institute of Fundamental medicine and biology, Kazan (Volga river) federal university, danilova146@mail.ru, E. O. Mikhailova, PhD, associate professor of business statistics and mathematical methods in Economics (KNRTU), katyushka.glukhova@gmail.com, M. R. Sharipova, PhD, professor, Institute of Fundamental medicine and biology, Kazan (Volga region) federal university, mar-sharipova@gmail.com, L. M. Bogomolnaya, research associate, Institute of Fundamental medicine and biology, Kazan (Volga river) federal university, LMBogomolnaya@kpfu.ru.
