Морфо-функциональная оценка влияния перфторана на эритроциты человека in vitro в среде перекиси водорода Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 549.215:612.111:615.384

МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ПЕРФТОРАНА НАЭРИТРОЦИТЫ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO В СРЕДЕ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА

© гоп Магомедов К.К., Бакуев М.М., Шахбанов Р.К., Магомедов М.А.

Дагестанская государственная медицинская академия

Исследованы мембранопротекторные действия перфторана (ПФ) на эритроциты, находящиеся в среде активной формы кислорода-перекиси водорода (H2O2) in vitro. Установлено, что в соотношении кровъ/ПФ 10/1 резко уменьшается количество эхиноцитов при концентрации перекиси водорода 66*10-5%. При этом в мазках крови не выявляются признаки гемолиза эритроцитов. В указанной концентрации H2O2 в среде кровь без ПФ количество эхиноцитов достигает 97%. Предполагается, что защитное действие ПФ связано с влиянием препарата на структурно-функциональное состояние липидного бислоя мембран эритроцитов.

The authors of the article studied the membrane- protective influence of Perftoran (PF) upon erythrocytes in the medium of the active form oxygen-hydrogen-peroxide (H2O2) in vitro. They determined that in blood/ PF/ 10/1correlation the echinocytes quantity is sharply decreased while the hydrogen-peroxide concentration is 66*10~5%. At the same time the signs of the erythrocytes haemolysis are not determined in the blood smears. In that concentration H2O2 in the blood without PF medium the quantity of echinocytes reaches 97%. The authors suppose that the protective influence of PF is connected with the medicine influence upon the structural and functional condition of the lipid bi-layer of erythrocyte membranes.

Ключевые слова: эритроциты, перфторан, перекись водорода, эхиноциты.

Keywords: erythrocytes, Fluorocarbon, hydrogen-peroxide, echinocytes.

Эмульсия перфторана (ПФ) обладает способностью растворять большие количества газов, в том числе кислород и углекислый газ. Это послужило фундаментом для разработки и создания на его основе кровезаменителей с функцией транспорта кислорода [7, 9].

Следует отметить, что ПФ по отношению к целостному организму является чужеродным. Он имеет собственный объем и большую поверхность и в реальных клинических условиях циркулирует с клетками крови. Вследствие этого частицы ПФ могут оказывать влияние на специфическую активность форменных элементов крови [8, 14, 16].

Средний диаметр частиц эмульсии составляет 0,12-0,15 мкм, относительная

вязкость находится в интервале 1,24-1,60 и не превышает вязкости плазмы (1,571,75). Важно отметить, что названные физико-химические параметры в пределах погрешности их определения не меняются в течение 12 месяцев хранения эмульсий при +4°С. Показано, что ПФ обладает полифункциональными свойствами, а именно увеличивает

транспорт кислорода, улучшает

микроциркуляцию [1, 4].

В последние годы обнаружено

мембранопротекторное действие ПФ от биоокислителей [10, 15]. Предполагается, что протекторное действие препарата, препятствующее лизису эритроцитов, обусловлено изменением диффузионной подвижности примембранной воды клеток [6]. Обнаруженное снижение

подвижности воды в присутствии ПФ позволяет предположить, что его защитное действие, в том числе на резистентность эритроцитов к воздействию активных форм кислорода -АФК, связано с существованием приповерхностного слоя воды с пониженной диффузной подвижностью. Этот слой, по-видимому, препятствует быстрой диффузии АФК, в частности, перекиси водорода в эритроциты и их разрушению. Вероятно, с этим связан механизм протекторного действия ПФ на клеточные мембраны [2, 5].

Известно [3], что перекись водорода (Н202) вызывает интенсификацию процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также изменение количества фосфолипидов. Эти данные дают основания предположить, что Н202 вызывает глубокие изменения в структурно-функциональном состоянии липидного бислоя мембраны. По мнению авторов [12, 13], она приводит к

снижению насыщенных жирных кислот в эритроцитарных мембранах, в результате чего увеличивается вероятность разрушения клеток.

Таким образом, рост концентрации Н202 в крови сопровождается изменениями в составе липидов мембран эритроцитов, а изменения

количественного и качественного соотношений липидов и продуктов ПОЛ может являться одним из механизмов запуска процессов апоптоза клеток.

Исследования авторов [15] показали, что защита клеточных структур от повреждающего действия АФК, продуцирующихся внутри клетки (эндогенные АФК) и воздействующих извне (экзогенные АФК), организуется различным способом. В первую очередь это связано с неспособностью АФК проникать сквозь мембраны. В результате экзогенные АФК, в частности Н2О2, всегда воздействуют на клетку только опосредованно через стимуляцию ПОЛ в плазматической мембране.

Поэтому защита мембран эритроцитов от повреждающего действия АФК

актуальна и нуждается в поисках средств предупреждающих, прежде всего,

активацию реакций

свободнорадикального окисления.

В этой связи нам представлялось важным изучить возможность защиты мембраны эритроцитов от

повреждающего действия H2O2

использованием мембранопротекторных свойств ПФ.

Цель работы - исследование влияния ПФ на морфо-функциональное состояние эритроцитов, находящихся in vitro в среде с различной концентрацией H2O2.

Материалы и методы

Для оценки влияния H2O2 на состояние эритроцитов, находящихся в среде с ПФ в соотношении 10/1, были выбраны следующие концентрации

препарата: 66х10-4%, 33*10^% и 66*105%.

Свежезаготовленную донорскую кровь, стабилизированную гепарином, в количестве 5 мл смешивали с ПФ (0,5) и инкубировали в течение часа при 370С. По истечении этого срока в смесь добавляли H2O2 в указанных

концентрациях. Оценка влияния H2O2 на состояние мембраны эритроцитов осуществлялась по методике Л. В. Филева с соавторами путем подсчета эхиноцитов в мазке крови (в %), содержащихся на определенное число (1000) эритроцитов [11]. Гемолиз эритроцитов после инкубации смеси кровь/ПФ с H2O2 оценивали в соответствии с инструкцией, принятой в Службе крови (1989),

предусматривающей «отсутствие

видимого гемолиза».

Результаты и их обсуждение

Проведенные исследования показали, что при смешивании крови с ПФ в соотношении 10/1 количество

эритроцитов со звездчатой формой эхиноцитов уменьшается (табл. 1).

Таблица 1

Влияние ПФ на состояние эритроцитов, находящихся в среде перекиси водорода

(H2O2) «in vitro»

Исследуемые среды Концентрация Н2О2 Содержание эхиноцитов Число наблюдений Наличие гемолиза

Кровь Контроль 1,09±0,15 22 Нет

Кровь/ПФ Без Н2О2 0,8±0,11 17 Нет

Кровь Н2О2 66 X 10-5% 93±2,33*** 12 Гемолиз

Кровь/ПФ Н2О2 66 X 10-5% 3,3±0,56* 15 Нет

Кровь/ПФ Н2О2 33 х 10-4% 37±1,88** 17 Нет

Кровь/ПФ Н2О2 66 х 10-4% 97±3,45*** 10 Слабо выражен

Примечание: * - Р < 0,05; ** - Р < 0,02; *** -

В мазке крови (рис. 16) четко видны дискоциты, окруженные капельками эмульсии, лишь единичные эритроциты имеют звездчатую форму. Состояние эритроцитов резко меняется при смешивании крови (без ПФ) с Н2О2 в концентрации 66х10-5%, количество эхиноцитов достигает 93% при подсчете на 1000 эритроцитов. Параллельно имеет место и выраженный их гемолиз (рис. 2а).

На приведенном рисунке почти все эритроциты, сморщенные с признаками их агрегации.

Однако при добавлении к смеси кровь/ПФ тех же доз перекиси (66х10-5%) количество эхиноцитов по сравнению с контролем лишь несколько

Р < 0,01

увеличено (3,3±1,88), признаков

гемолиза не выявляется (рис. 26).

Процентное содержание эхиноцитов в мазке резко возрастает (97±3,45) при увеличении концентрации Н2О2 до 33х10-4%, значительно количество

эритроцитов со звездчатой формой; они окружены капельками эмульсии (рис. За).

Увеличение концентрации Н2О2 до 66х10-4% приводит к изменению формы почти всех эритроцитов (97±3,45). На поверхности клеток многочисленные зазубрины и капельки эмульсии. Однако полностью разрушенных эритроцитов

мало, то есть признаки гемолиза слабо выражены (рис. 36).

Рис. 1. Мазок крови; а - нормальные эритроциты - дискоциты; б - смесь кровь/ПФ, на поверхности эритроцитов капельки эмульсии

Рис. 2. Мазок крови; а - кровь (без ПФ) в среде Н202 (66х-10~5%), почти все эритроциты с измененной формой и признаками агрегации; б - смесь кровь/ПФ в среде Н202 (66х-10~5%), лишь небольшое количество эритроцитов морфологически

изменены

а

Рис. 3. Мазок крови; а - в среде Н202 (33*10~ %), значительное количество эритроцитов звездчатой формы; б - в среде Н202 (66*10~4%о), все эритроциты

с измененной формой

Заключение

Таким образом, Н202 индуцирует существенные изменения оболочки эритроцитов. Эти данные подтверждают результаты приведенных выше авторов о том, что Н2О2 вызывает глубокие изменения в структурно-функциональном состоянии мембран

эритроцитов, прежде всего, вероятно, за счет изменения состояния липидного бислоя мембраны. По-видимому, Н202

Примечания

способствует интенсификации

свободнорадикальных реакций в эритроцитарных мембранах и тем самым увеличивает вероятность разрушения клеток.

Однако применение ПФ существенно снижает количество морфологически измененных клеток, то есть эхиноцитов, и надо полагать, что используемый препарат повышает стабильность эритроцитарных мембран.

1. Голубев А. М. Перфторан - плазмозаменитель с функцией транспорта кислорода // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1998. Т. 125. № 5. С. 484-492. 2. Житков М. Ю., Орлов А. А., Григорьян А. С., Чупахин П. В. Изучение протекторного действия перфторана на кожный лоскут. // Стоматология. 2002. № 5. С. 11-15. 3. Калуев А. В. К вопросу о регуляторной роли активных форм кислорода в клетке // Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 9. С. 1305-1306. 4. Ковеленов А. Ю.

Перфторорганические соединения в биологии и медицине. Пущино, 2001. С. 70-76. 5. Кузнецов П. Е., Злобин В. А., Назаров Г. В. К вопросу о физической природе действия сверхнизких концентраций // Тезисы докладов III Международного симпозиума «Механизмы действия сверхмалых доз». М., 2002. С. 229. 6. Кузнецов П. Е., Попыхова Э. Б., Рогачева С. М., Евлаков К. И. Влияние 1-(2'-гидроксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазола на состояние воды в примембранной области эритроцитов и их моделей // Биомедицинская химия. 2005. Т. 51. № 6. С. 649-655. 7. Кузнецова И. Н. Биодоступность и биоэквивалентность эмульсий перфторуглеродов разного состава в комплексной терапии критических состояний // Общая реаниматология. 2007. № 3. С. 17-24. 8. Кузнецова И. Н. О воздействии эмульсии перфторуглеродов на организм. Перфторорганические соединения в биологии и медицине. Пущино, 2001. С. 70-76. 9. Моисеенко О. М., Средняков В. А., Воробьева С. И. Технология применения перфторана при лечении офтальмопатологии // Офтальмохирургия. 2007. № 2. С. 46-49. 10. Софронов Г. А., Селиванов Е. А. Новые кровезаменители полифункционального действия // Вестник РАМН. 2003. № 10. С. 48-5l. 11. Филев Л. В., Захаров И. И., Селиванова Г. В.

Цитоспекгрофотометрическое исследование гемоглобина в эритроцитах человека // Цитология. 1989. Т. XXXI. № 3. С. 336-343. 12. Broekhuyse R. M. // Biochem. Biophys. Acta. 1968. V. 260. P. 449-459. 13. Jabs T. // Biochem. Pharmacol. 1999. V. 57. P. 231-245. 14. Lowe K. C. Second-generation perfluorocarbon emulsion blood substitutes // Art. Cells, Blood Substit., Immobil. Biotech. 2000. V. 28. №. 1. P. 25-28. 15. Sazontova T. G. Regularity of the modulation of cell antioxidative status in response of the activation of free radical oxidation. Hypoxia Med. J. 2002. V 1-2. P. 2-9. 16. Spahn D. R., van Brempt R., Theilmeier G. et al. Perflubron emulsion delays blood transfusions in orthopedic surgery. Anesthesiology. 1999. V. 91. P. 11 95-1208.

Статья поступила вредакцию 10.10.2011 г.