CC BY
22
Вознесенский Николай Константинович, доктор медицинских наук, профессор, Институт атомной энергетики, ФГАОУ ВПО «Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ», Россия, 249040, г Обнинск, Студгородок, д. 1, тел. 8-910-917-18-31, е-mail: nikwo@mail.ru.
Сербин Игорь Павлович, заведующий нейрохирургическим отделением, Филиал № 1, ФГУ «1586 Окружной военный клинический госпиталь Московского военного округа» Министерства обороны РФ Россия, г. Москва, Яковоапостольский пер., д. 8, тел.: (495) 916-02-63.
Миронов Андрей Владимирович, врач-нейрохирург, МУЗ «Коломенская центральная районная больница», Россия, г. Коломна, ул. Октябрьской революции, д. 318, тел.: (4966) 12-26-27, e-mail: andremir@mail.ru.
Григорьев Эдуард Михайлович, врач-нейрохирург, МУЗ «Коломенская центральная районная больница», Россия, г. Коломна, ул. Октябрьской революции, д. 318, тел.: (4966) 12-26-27, e-mail: ivanopio@yandex.ru.
УДК 615.384:616.155.15
© К.К. Магомедов, М.М. Бакуев, Р.К. Шахбанов, М.А. Магомедов, 2013
К.К. Магомедов, М.М. Бакуев, Р.К. Шахбанов, М.А. Магомедов
ВЛИЯНИЕ ПЕРФТОРАНА НА ЭРИТРОЦИТЫ, НАХОДЯЩИХСЯ В СРЕДЕ АКТИВНОЙ ФОРМЫ КИСЛОРОДА
ГОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» Минздрава России
Изучено мембранопротекторное действие перфторана (ПФ) на эритроциты, находящихся в среде активной формы кислорода-перекиси водорода (H2O2) in vitro. Установлено, что в соотношении кровь/ПФ 10/1 резко уменьшает количество эхиноцитов при концентрации перекиси водорода 66 х 10-5 %. При этом в мазках крови не выявляются признаки гемолиза эритроцитов. В указанной концентрации H2O2 в среде кровь без ПФ количество эхиноцитов достигает 97 %. Предполагается, что защитное действие ПФ связано с влиянием препарата на структурно-функциональное состояние липидного бислоя мембран эритроцитов.
Ключевые слова: эритроциты, перфторан, перекись водорода, эхиноциты.
K.K. Magomedov, M.M. Bakuev, R.K. Shakhbanov, M.A. Magomedov
FLUOROCARBONE INFLUENCE ON ERYTHROCYTES BEING IN ACTIVE FORM OF OXYGEN
The membrane - protective influence of Fluorocarbon (FC) on erythrocytes from medium of active form oxygen-hydrogen-peroxide (H2O2 ) in vitro was studied. There was determined that correlation blood/FC/ 10/1 sharply decreased the quantity of echinocytes in concentration hydrogen-peroxide 66х105 %. The sings of hemolyze of erythrocytes were not determined in blood. In the concentration H2O2 in medium blood without Fluorocarbon, the quantity of echinocytes reached 97 %. The protective influence of Fluorocarbon was connected with influence of drug on structural-functional condition of lipid bi-layer membranes of erythrocytes.
Key words: erythrocytes, Fluorocarbon, hydrogen-peroxide, echinocytes.
Введение. Известно, что жидкие перфторуглеродистые соединения способны растворять большие количества газов (в том числе О2 и СО2). Достоинством их является также химическая инертность, что послужило фундаментом для разработки и создания на их основе кровезаменителя с функцией транспорта кислорода [4, 5].
В настоящее время в клинике и эксперименте чаще всего используется препарат - перфторан (ПФ).
Исследованиями последних лет обнаружено и мембранопротекторное действие ПФ от биоокислителей [6, 9]. Предполагается, что оно обусловлено изменением диффузионной подвижности примембранной воды клеток [3]. Этот слой, по-видимому, препятствует быстрой диффузии активных форм кислорода (АФК), в частности, перекиси водорода (Н2О2) в эритроциты и их разрушению.
Авторы [1, 2] считают, что, возможно, с этим связан механизм протекторного действия ПФ на клеточные мембраны.
По мнению ряда исследователей [7, 8], Н2О2 вызывает интенсификацию процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также изменение количества фосфолипидов. Эти данные дают основание для предположения о том, что Н2О2 вызывает глубокие изменения в структурно-функциональном
состоянии липидного бислоя мембраны. Рост концентрации Н2О2 в крови сопровождается изменениями в составе липидов мембран эритроцитов, а изменения количественного и качественного соотношения липидов и продуктов ПОЛ могут являться одной из причин, приводящей к лизису клеток. Поэтому защита мембран эритроцитов от повреждающего действия АФК актуальна и нуждается в поисках средств, предупреждающих, прежде всего, активацию свободнорадикального окисления.
В этой связи представляется важным изучить возможности защиты мембран эритроцитов от повреждающего действия Н2О2 использованием мембранопротекторных свойств ПФ.
Цель: исследовать влияние ПФ на морфофункциональное состояние эритроцитов, находящихся in vitro в среде с различной концентрацией H2O2.
Материалы и методы исследования. Для оценки влияния H2O2 на состояние эритроцитов, находящихся в среде с ПФ в соотношении 10/1, были выбраны следующие концентрации препарата : 66 х 10-4 % ; 33 х 10-4 % и 66 х 10-5 %.
Свежезаготовленную донорскую кровь, стабилизированную гепарином, в количестве 5 мл смешивали с ПФ (0,5 мл) и инкубировали в течение 1 часа при 37° С. По истечении этого срока в смесь добавляли H2O2 в указанных концентрациях.
Оценка влияния H2O2 на состояние мембраны эритроцитов осуществлялась по методике Л.В. Филева с соавторами путем подсчета эхиноцитов в мазке крови (в %), содержащихся в расчете на определенное число (1 000) эритроцитов [7].
Гемолиз эритроцитов после инкубации смеси кровь/ПФ с H2O2 оценивали в соответствии с инструкцией, принятой в Службе крови (1989), предусматривающей «отсутствие видимого гемолиза».
Результаты исследования и их обсуждение. При смешивании крови с ПФ в соотношении 10/1 количество эритроцитов со звездчатой формой - эхиноцитов уменьшается (табл.).
Таблица
Влияние ПФ на состояние эритроцитов, находящихся в среде перекиси водорода (H2O2) in vitro
Исследуемые среды Концентрация H2O2 Содержание эхиноцитов Число наблюдений Наличие гемолиза
Кровь Контроль 1,09 ± 0,15 22 Нет
Кровь/ПФ Без H2O2 0,80 ± 0,11 17 Нет
Кровь H2O2 66 х 10-5 % 93,00 ± 2,33*** 12 Гемолиз
Кровь/ПФ H2O2 66 х 10-5 % 3,30 ± 0,56* 15 Нет
Кровь/ПФ H2O2 33 х 10-4 % 37,00 ± 1,88** 17 Нет
Кровь/ПФ H2O2 66 х 10-4 % 97,00 ± 3,45*** 10 Слабо выражен
Примечание: * -p < 0,05; ** -p < 0,02; *** -p < 0,01.
В мазках крови четко видны дискоциты, окруженные капельками эмульсии; лишь единичные эритроциты имеют звездчатую форму. Состояние эритроцитов резко меняется при смешивании крови (без ПФ) с Н202 в концентрации 66 х 10-5 %, количество эхиноцитов достигает 93 % при подсчете на 1 000 эритроцитов. Параллельно имеет место и выраженный их гемолиз. В мазках крови почти все эритроциты сморщенные, с признаками их агрегации.
Однако при добавлении к смеси кровь/ПФ тех же доз перекиси (66 х 10-5 %) количество эхиноцитов по сравнению с контролем лишь несколько увеличено (3,30 ± 1,88), признаки гемолиза не выявляются.
Процентное содержание эхиноцитов в мазке резко возрастает (97,00 ± 3,45) при увеличении концентрации Н202 до 33 х 10-4 %. Значительное количество эритроцитов со звездчатой формой окружены капельками эмульсии.
Увеличение концентрации Н202 до 66 х 10-4 % приводит к изменению формы почти всех эритроцитов (97,00 ± 3,45). На поверхности клеток многочисленные зазубрины и капельки эмульсии. Однако полностью разрушенных эритроцитов мало, то есть признаки гемолиза слабо выражены.
Заключение. Н202 индуцирует существенные изменения оболочки эритроцитов. Эти данные подтверждают результаты приведенных выше исследований о том, что Н202 вызывает глубокие изменения в структурно-функциональном состоянии мембран эритроцитов, вероятно, за счет изменения состояния липидного бислоя мембраны. По-видимому, Н202 способствует интенсификации свободнора-
дикальных реакций в эритроцитарных мембранах и увеличивает вероятность разрушения клеток. Однако применение ПФ существенно снижает количество морфологически измененных клеток, то есть эхи-ноцитов, используемый препарат повышает стабильность эритроцитарных мембран. Это может оказать влияние на функционирование мембранных ферментов, рецепторов и ионных каналов. Можно предположить, что ПФ, растворяясь в липидной фазе мембран, вступает в неспецифическую связь с белок-липидным слоем мембраны эритроцитов и защищает их от повреждающего действия экзогенных АФК.
Список литературы
1. Жиров, А. А. Влияние некоторых лекарственных веществ на состояние водной среды / А. А. Жиров, В. А. Злобин, П. Е. Кузнецов и др. // Механизмы действия сверхмалых доз : тез. докл. III Международного симпозиума (Москва, 3-6 декабря, 2002 г.). - М. : Российская академия наук, 2002.- С. 225.
2. Кузнецов, П. Е. К вопросу о физической природе действия сверхнизких концентраций / П. Е. Кузнецов, В. А. Злобин, Г. В. Назаров и др. // Механизмы действия сверхмалых доз : тез. докл. III Международного симпозиума (Москва, 3-6 декабря, 2002 г.). - М. : Российская академия наук, 2002.- С. 229.
3. Кузнецов, П. Е. Влияние 1-(2'-гидроксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазола на состояние воды в примембранной области эритроцитов и их моделей / П. Е. Кузнецов, Э. Б. Попыхова, С. М. Рогаче-ва, К. И. Евлаков // Биомедицинская химия. - 2005. - Т. 51, № 6. - С. 649-655.
4. Кузнецова, И. Н. Биодоступность и биоэквивалентность эмульсий Перфторуглеродов разного состава в комплексной терапии критических состояний / И. Н. Кузнецова // Общая реаниматология - 2007. - Т. 3, № 3. - С. 17-24.
5. Моисеенко, О. М. Технология применения перфторана при лечении офтальмопатологии / О. М. Моисеенко, В. А. Средняков, С. И. Воробьева // Офтальмохирургия. - 2007. - № 2. - С. 46-49.
6. Софронов, Г. А. Новые кровезаменители полифункционального действия / Г. А. Софронов, Е. А. Селиванов // Вестник РАМН. - 2003. - № 10. - С. 48-51.
7. Филев, Л. В. Цитоспектрофотометрическое исследование гемоглобина в эритроцитах человека / Л. В. Филев, И. И. Захаров, Г. В. Селиванова и др. // Цитология. - 1989. - Т. XXXI, № 3. -С. 336-343.
8. Lowe, K. C. Second-generation perfluorocarbon emulsion blood substitutes / K. C. Lowe // Artf. Cells, Blood Substit., Immobil. Biotech. - 2000. - Vol. 28, № 1. - P. 25-28.
9. Sazontova, T. G. Regularity of the modulation of cell antioxidative status in response of the activation of free radical oxidation / T. G. Sazontova // Hypoxia Med. J. - 2002. - № 2. - Р. 2-9.
Магомедов Камиль Курбанович, старший научный сотрудник научно-исследовательского института экологической медицины, ГБОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» Минздрава России, Республика Дагестан, 367000, г. Махачкала, пл. Ленина, д. 1, тел.: 8-938-203-58-24, e-mail: dgma@list.ru.
Бакуев Максудин Маккидинович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, ГБОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» Минздрава России, Республика Дагестан, 367000, г. Махачкала, пл. Ленина, д. 1, тел.: (8722) 60-12-80, e-mail: dgma@list.ru.
Шахбанов Руслан Казбекович, кандидат медицинских наук, доцент кафедры гистологии, ГБОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» Минздрава России, Республика Дагестан, 367000, г. Махачкала, пл. Ленина, д. 1, тел: 8-960-419-52-22, e-mail: dgma@list.ru.
Магомедов Магомед Ахмедгаджиевич, кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической анатомии, ГБОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» Минздрава России, Республика Дагестан, 367029, г. Махачкала, ул. Ш. Алиева, д. 1, тел.: (8722) 67-59-70, e-mail: dgma@list.ru.
