CC BY
98
БИОТЕХНОЛОГИЯ, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 579.861.2 : 615.919 -083.12
А. Б. Беклемишев, Р. Тлеулиева, Н. Ю. Номоконова, Н. Н. Беляев
ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКИХ И АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ АЛЬФА-ТОКСИНА Staphylococcus aureus
ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина, Алматы, Казахстан
Ген hla стафилококкового альфа-токсина (САТ) был клонирован в двух вариантах в клетках E.coli в составе экспрессирующего вектора pREB-6His. В результате были получены четыре рекомбинантных штамма E.coli. Два из них продуцировали полипептидные предшественники САТ, как содержащие, так и не содержащие 6-ти гистидиновую аминокислотную последовательность в С-концевой области. Два других продуцировали химерные полипептиды, состоящие из аминокислотной последовательности сигнала секреции нуклеазы Serratia marcescence в N-концевой области цепи, состыкованной с последовательностью зрелого САТ. Полипептидные предшественники САТ, но не химерные белки, претерпевали нормальный процессинг, секретировались в периплазму и культуральную среду и обладали гемолитической активностью. Моноклональные антитела D3, полученные к природному САТ, специфически реагировали с рекомбинантным САТ. На основе рекомбинантного САТ и моноклональных антител D3 сконструирован прототип иммуноферментной тест-системы для определения САТ в жидкостях.
Ключевые слова: Staphylococcus aureus, рекомбинантный альфа-токсин, ген hla, клонирование, экспрессия, моноклональные антитела, ELISA
Введение
Золотистый стафилококк вызывает различные инфекции у человека, включая эндокардиты, остеомиелиты, артриты, раневые сепсисы, кожные абсцессы, маститы, кератиты и является причиной более 40 % случаев госпитальных инфекций. Известно, что одним из основных факторов патогенности золотистого стафилококка является альфа-токсин (САТ), обладающий рядом активностей: цитолитической, иммуномодулирующей, дермонекротической и летальной [1]. Накоплен большой объем экспериментального материала, свидетельствующий о том, что в основе патогенного действия (летальной активности) САТ лежит способность этого белка образовывать поры в плазматической мембране клетки-мишени [1-4]. Однако далеко не все типы клеток млекопитающих подвержены цитолитическому действию САТ. Установлено. что только клетки периферической нервной системы, эндотелиальные клетки микрососудов, а также тромбоциты, периферические Т-лимфоциты, полиморфно-ядерные лейкоциты и кератиноциты человека являются высокочувствительными мишенями для цитолитического действия САТ [1, 3, 4]. В последние годы начинают проясняться молекулярные механизмы, лежащие в основе патологического действия САТ на клетки различных тканей в инфицированном организме [5-8], изучаются механизмы регуляции экспрес-
сии гена САТ в процессе стафилококковой инфекции [9]. Однако вопрос о молекулярных механизмах, лежащих в основе избирательного связывания САТ с определенными типами клеток остается открытым. По-видимому, с САТ эффективно связываются клетки, имеющие специфические для него рецепторы. Роль таких рецепторов могут выполнять как поверхностные структурные белки [1, 3], так, вероятно, и некоторые ферменты плазматических мембран. В таком случае связывание с соответствующими рецепторами различных типов клеток будет, по-видимому, определяться различными сайтами полипептидной цепи САТ. В случае же, если рецепторами для САТ служат некоторые локализованные на поверхности плазматической мембраны ферменты, можно ожидать прямого ингибирования или стимуляции их активности при связывании с токсином.
Малоизученным остается и вопрос, обладает ли САТ какими-либо ферментативными активностями, наряду с ранее обнаруженными [10], и каково их значение в патогенезе. Какую роль в патогенезе инфекции играет САТ, секретируемый некоторое время стафилококком, опсонизированным фагоцитарными клетками макроорганизма? В последнем случае САТ, вероятно, может проявлять как собственную ферментативную активность, так и ингибировать или акти-
вировать ферменты фагоцитарной клетки. Одним из подходов в решении всех этих вопросов и в исследовании локализации функционально значимых участков полипептидной цепи САТ является получение и анализ высокоочищенных препаратов как нативного, так и мутантных форм рекомбинантного САТ (рСАТ) и использование моноклональных антител, полученных к их различным эпитопам.
Кроме того, получение рСАТ представляет интерес и для сугубо практических целей. Известно, что септические состояния стафилококкового происхождения сопровождаются появлением в крови САТ, который используют в качестве этиологического маркера сепсиса. Между тем в настоящее время отсутствуют коммерческие тест-системы, позволяющие надежно и быстро определять этиологическую природу сепсиса.
В связи с вышеизложенным, целью работы явилось получение рекомбинантных форм САТ, изучение локализации этих белков в клетках E.coli, их гемолитической активности, получение стабильных гиб-ридомных линий, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к нативной молекуле САТ, и оценка их способности распознавать эпитопы рСАТ в различных вариантах иммуноферментного анализа.
Материалы и методы
Реактивы: акриламид, ^№-метилен-бисакрила-мид, додецилсульфат натрия (SDS), персульфат аммония, ^^№,№-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), бромфеноловый синий, 2-меркаптоэтанол, этиленди-аминтетрауксусная кислота (ЭДТА), глицерин, глюкоза, хлорамфеникол, ампициллин, Твин 20, Тритон Х-100, ПЭГ (м.в. 6000), Трис-гидроксиметиламинометан (Трис) фирмы «Serva» (Германия); агароза, бромистый этидий, дезоксирибонуклеозид-5’-трифосфаты, бычий сывороточный альбумин (БСА), минеральное масло фирмы «Sigma» (США); дрожжевой экстракт, бакто-триптон, агар фирмы «Difco» (Великобритания). Остальные реактивы квалификации «ХЧ» или «ОСЧ» производства «Реахим» (Россия). Ферменты: протеиназа К, ДНК-полимераза из Thermus aquaticus, ДНК-лигаза бактериофага Т4 фирмы «USB» (США), эндонуклеазы рестрикции: EcoRI, BamHI, BstEII фирмы «Сибэнзим» (Россия).
Бактериальные штаммы: штаммы Escherichia coli: C600, BL21(DE3), DH-5a, XL-Blue, JM 109; штаммы Staphylococcus aureus: Wood 46 и O15.
Векторные ДНК: pBluescript II SK(+), pBR322 («Stratagene», США) и сконструированный в лаборатории вектор pREB-6His для прямой экспрессии генов в клетках E.coli на основе pBR322, содержащей регуляторную область гена recA Proteus mirabilis.
Выделение геномной ДНК из клеток S.aureus. Для
выбора оптимального метода выделения ДНК из клеток S. aureus использовали три различных способа предварительного разрушения клеток: детергентный, щелочной и метод, основанный на лизисе клеток ли-зостафином, с последующей фенол-хлороформной депротеинизацией ДНК и ее преципитацией 70 %-м этанолом.
Амплификация гена hla S.aureus методом ППР. Выбор олигонуклеотидных праймеров для амплификации структурной области гена альфа-токсина (hla)
S.aureus проводили с помощью программы «OLIGO» (версия 3.3). Нуклеотидные последовательности этих праймеров приведены ниже:
PR22F: 5’- GGAATTCATGAAAACACGTATAGTC-3’ PR23R: 5’ -AGGATCCTTAATTTGTCATTTCTTCTT-3' PR31R: 5’ -AGGTCACCATTTGTCATTTCTTCTTTTTC-3'
Праймер PR22F (прямой) и обратные праймеры PR23R и PR31R предназначены для амплификации и последующей встройки структурной области гена hla S.aureus в экспрессирующий вектор pREB-6His по сайтам EcoRI (PR22F) и BamHI (PR23R) или BstEII (PR31R). В случае применения праймера PR31R обеспечивалась состыковка гена с нуклеотидной последовательностью вектора, кодирующей 6-ти гисти-диновую аминокислотную последовательность в С-концевой области экспрессируемого белка.
ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 50 мкл. К 5 мкл ДНК S.aureus, денатурированной под вазелиновым маслом при 100oC 2 мин добавляли 45 мкл смеси компонентов. Конечная реакционная смесь содержала 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris-HCl (pH 8,8), 2,5 mM MgCl2, 0,01 % Tween 20, по 0,05 mM каждого из четырех dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), по 0,2 мкМ каждого из праймеров, 10 % глицерина, и по 2,5 ед. Taq- или Tet-Z- ДНК-полимеразы. Реакцию проводили в пробирках объемом 0,5 мл («QSP», USA) на многоканальном термоциклере МС2 («ДНК-техно-логия», Москва) в режиме активного регулирования температуры реакционной смеси. Реакцию вели при следующих температурных режимах: денатурация ДНК при 950С 2 мин на первом цикле и при 94оС 0,5 мин на последующих 35 циклах; отжиг праймеров с матрицей-мишенью при 450С 1 мин на первых 5-ти циклах и при 60оС 1 мин на последующих циклах; полимеризация цепи ДНК при 720С 1 мин. Время полимеризации цепи на последнем цикле составляло 10 мин. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 5 %-м ПААГ или в 2 %-м агарозном геле.
Обработка ДНК ферментами. Гидролиз ДНК рестриктазами и сшивку фрагментов ДНК при помощи ДНК-лигазы фага Т4 проводили согласно прилагаемым к препаратам ферментов инструкциям фирм-
производителей.
Электрофорез ДНК в ПААГ и агарозном геле проводили по общепринятым методикам [11].
Экстракция ДНК из геля агарозы. Смесь фрагментов ДНК разделяли электрофорезом в агарозном геле. Полоску агарозного геля, содержащую целевой фрагмент ДНК, растворяли при 60оС в равном объеме 8 М №СЮ4. В раствор, содержащий ДНК, вносили суспензию мелкодисперсного оксида кремния «Силика». Емкость сорбента составляла 2,5 мкг ДНК на 1 мг оксида кремния. Сорбцию ДНК на поверхности частиц оксида кремния проводили в растворе 4 М №СЮ4 в течение 15 мин при комнатной температуре. Сорбированную ДНК элюировали дистиллированной водой или ТЕ-буфером при 56оС.
Метод трансформации клеток Е.соН с использованием электропорации. Трансформацию клеток Е.соН плазмидными ДНК проводили в строгом соответствии с руководством фирмы-производителя элек-тропоратора «PeqLab, Biotechnologie GmbH». После электропорации трансформированные клетки быстро переносили в 3 мл среды SOC, содержащей 20 % глицерина и инкубировали 1 ч при 370С. Подращенные трансформированные клетки концентрировали центрифугированием при 1000§ на настольной центрифуге и рассевали на агаризованной среде LB с соответствующим антибиотиком. Уровень трансформации в среднем составлял 1х109 - 5х109 колоний на 1 мкг ДНК плазмиды pBR322.
Выделение плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК выделяли из клеток Е.соН с помощью щелочного лизиса клеток [11].
Быстрое выделение плазмидной ДНК из колоний Е.соН. Часть колоний Е.соН, выращенных на селективной среде, при помощи стоматологического шпателя соскребали, стараясь не зацепить агар, переносили в 50 мкл ТЕ-буфера и суспендировали при помощи шейкера. Суспензию клеток инкубировали 5 мин на водяной бане. По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием 1-2 мин при 10000§. Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, использовали для быстрого, скринингового ПЦР-анализа.
Скрининг клонов E.coli на продукцию рекомбинантных форм САТ
Колонии Е.соН, содержащие рекомбинантные плазмиды, пересевали в 1 мл LB-среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и растили на шейкере при 37оС до оптической плотности Е590 0,7-0,8. Затем в культуру вносили налидиксовую кислоту до концентрации 50 мкг/мл в качестве индуктора, активирующего ген гесА, и продолжали выращивание клеток ещё 3-5 ч. После завершения культивирования клетки осаждали центрифугированием при 5000g 10 мин. Осадок кле-
ток лизировали кипячением 3 мин в 100 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl (pH 6,8), 100 мМ DTT, 2 % SDS, 0,1 % BPB, 10 % глицерин и 10-50 мкл лизата анализировали электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях по методу Лэммли.
Культивирование клеток для препаративной наработки рекомбинантного САТ проводили по аналогичной схеме в 100-500 мл LB-среды.
Выделение рекомбинантного САТ методом аффинной хроматографии в нативных условиях. Разрушение бактериальных клеток проводили либо путем многократной заморозки-разморозки, либо при помощи ультразвука. В первом варианте собранные центрифугированием клетки E.coli суспендировали в буфере, содержащем 0,1 М Трис-HCl с pH 6,8, 0,01 % Тритон Х-100 и лизоцим в концентрации 5 мг/мл из расчета 3-5 мл буфера на 100 мл культуральной среды. Суспензию подвергали многократному (8-10 раз) замораживанию-оттаиванию. ДНК разрушали обработкой ДНК-азой I. Лизат центрифугировали при 20000g 30 мин и рекомбинантную форму САТ, содержащего в С-концевой области 6-ти гистидино-вую аминокислотную последовательность, выделяли методом аффинной хроматографии на колонке с Ni2+-NTA-сефарозой^В согласно инструкции фирмы-изготовителя аффинного сорбента.
Электрофорез белков в пластинах полиакриламидного геля в денатурирующих условиях проводили по методу Лэммли. После электрофореза белки в геле окрашивали кумасси G-250.
Определение гемолитической активности рекомбинантных форм САТ. Определение гемолитической активности САТ проводили по методу [12].
Определение внутриклеточной локализации рекомбинантного САТ. Получение субклеточных фракций E.coli проводили согласно [13].
Получение моноклональных антител к нативной форме САТ. Для иммунизации мышей, а также для тестирования гибридом использовали 70 %-й чистоты препарат САТ, любезно предоставленный профессором О.В.Красильниковым (Институт физиологии, Ташкент). По данным SDS-электрофореза САТ был гомогенен и имел М.м около 34 кДа. Для получения высокоактивного иммуногена и снижения токсичности САТ конъюгировали с активированной целлюлозой по методу, описанному в [14]. Шесть мышей линии BALB/c иммунизировали по следующей схеме: 20 мкг САТ в смеси с целлюлозой внутрибрюшинно трехкратно с интервалом две недели. Бустерную инъекцию проводили через две недели по 7 мкг чистого САТ в хвостовую вену. Слияние клеток проводили на 3-й день по методу [15], с небольшими модификациями. Для культивирования клеток использовали среду
1 2 3 4 5 б 7 S 9 10 11 12 Мм,
кДа
г ори» їв» «■V»
бб
45
1 2 3 4 5 б 7 S 9 10 11 12 13 14 Мм,
кДа
бб
45
24
• *
24
Рис. 1. Электрофореграмма белков лизатов клеток клонов №6 (S-SAT) и № 9 (SA) E.coli BL21, содержащих в составе рекомбинантной плазмиды pREB-6H кодирующую область гена предшественника САТ (клон №9) или кодирующую область зрелого САТ, состыкованную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный полипептид нуклеазы Seratia marcescense (клон №6). Дорожки: 1 и 12 - маркерные белки; 2 и 3, лизаты клеток E.coli BL21, индуцированных (3) и не индуцированных (2) налидиксовой кислотой в течение 3-х ч; 4 и 5 - лизаты клеток клона №1, содержащего вектор pREB-6H, индуцированных (5) и неиндуцированных (4) налидиксовой кислотой в течение 3-х ч; 6 и 7 лизаты клеток клона №6 индуцированных (7) и неиндуцированных (6) налидиксовой кислотой в течение 3-х ч; 8 и 9, рекомбинантные формы САТ клона №6 (8) и клона №9 (9), очищенные аффинной хроматографией на Ni-NTA-sepharose 6B; 10 и 11, лизаты клеток клона №9 индуцированных (11) и неиндуцированных (10) налидиксовой кислотой в течение 3-х ч.
RPMI 1640, содержащую 20 % фетальной сыворотки коров и соответствующих компонентов. Клонирование гибридом проводили трижды методом лимитирующих разведений. Наработку антител стабильно продуцирующим моноклоном производили in vitro. Антитела осаждали насыщенным раствором сульфата аммония с последующим диализом против фосфатного буферного раствора. Для скрининга гибридом, анализа и разработки тест-системы были использованы различные варианты иммуноферментного анализа. Мышиные иммуноглобулины выявляли пероксидаз-ным конъюгатом антител кролика против IgG мыши («БИОС», Новосибирск) или антител козы против IgG мыши («BioRad», США). Для определения субкласса полученных МКА использовали антиизотипические сыворотки («Sigma», США).
Рис. 2. Электрофореграмма белков различных фракций клеток клона М9 (SA) E.coli BL21, содержащего в составе рекомбинантной плазмиды pREB-6H кодирующую область гена предшественника CAT.
Дорожки: 1 и 14, маркерные белки; 11 - 1З, лизаты клеток клона М9, неиндуцированных (1З) и индуцированных налидиксовой кислотой ЗО мкг/мл в течение З ч (12) и 16 ч (11); З, 8 - 10 и 2, З - У, белки субклеточных фракций клеток клона М9, индуцированных налидиксовой кислотой ЗО мкг/мл в течение З ч (З, 8 - 10) и 16 ч (2, З - У), где: У и 10 - культуральная жидкость, 6 и 9 - периплазматическая фракция, З и 8 - цитоплазматическая фракция, 2 и З - белки телец включения; 4, рекомбинантный CAT клона М9, очищенный аффинной хроматографией на Ni-NTA-sepharose 6B
Результаты
Для получения рСАТ структурную область гена САТ S.aureus штамма Wood 4б клонировали в клетках E.coli в составе сконструированного нами ранее экспрессирующего вектора pREB, предназначенного для прямой экспрессии генов прокариот под контролем регуляторной области гена recA Proteus mirabilis. Было проведено два варианта встройки нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид-предшественник зрелого САТ. Первый вариант предусматривал встройку гена по сайтам EcoRI и BamHI, в результате которой продуктом экспрессии должен был быть предшественник САТ без дополнительных аминокислотных остатков как с N-, так и с С-концов молекулы. По второму варианту встройки, осуществляемому по сайтам EcoRI и BstEII, продуктом экспрессии должен был быть предшественник САТ, содержащий в С-концевой области б-ти гистидиновую аминокислотную последовательность, предназначенную для аффинной очистки рекомбинантного САТ.
Для получения секретируемой формы рекомбинантного САТ клонирование проводили еще одним
способом: последовательность ДНК, соответствующую зрелому токсину, состыковывали с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид нуклеазы Serratia marcescence. Предполагалось, что химерный полипептид будет претерпевать процессинг и секретироваться в периплазму. Было проведено исследование динамики накопления обоих рекомбинантных белков САТ (полноразмерного и химерного) в субклеточных фракциях Е.соН и проанализирована их гемолитическая активность. При индукции трансформированных клеток Е.соН нали-диксовой кислотой или митомицином С наблюдался высокий уровень синтеза двух рекомбинантных форм САТ (—15-20 % суммарного клеточного белка) (рис. 1), причем полноразмерный предшественник токсина, в отличие от химерного, претерпевал процессинг и эффективно секретировался в периплазму, а затем в культуральную среду (рис. 2). Синтезированный рекомбинантный САТ обладал высокой гемолитической активностью, сравнимой с таковой у нативного САТ из S.aureus. Этот факт свидетельствует о корректном процессинге чужеродного для Е.соН белка, являющегося типичным секреторным белком грамположительных бактерий. Эффективная экспрессия гена САТ в клетках Е.соН, сопровождающаяся секрецией токсина в периплазму и культуральную среду, обусловлена, по-видимому, использованием в векторе регуляторной области гена RecA, который, как известно, играет основную роль в активации SOS-ответа, включение которого сопровождается активацией синтеза ряда секреторных белков [16].
Рекомбинантный САТ, содержащий дополнительную С-концевую 6-ти гистидиновую последовательность, очищали методом аффинной хроматографии на №2+-ША-сефарозе-6В и использовали для анализа иммунохимической идентичности с нативным САТ.
Мышиные МКА к нативному САТ получали с помощью стандартной гибридомной технологии. В результате слияния лимфоцитов из селезенки и региональных лимфоузлов с миеломными клетками линии X63.Ag8.653 получили высокий выход гибридом. Эффективность гибридизации (процент ячеек с гиб-ридомами) составила свыше 90 %, а специфическая эффективность - 6 % (процент антителопродуцирующих гибридом от общего их количества). 11 гибридом подвергли криоконсервации. Однако после размораживания и культивирования у гибридом наблюдалось уменьшение продукции антител вплоть до их полного исчезновения. Удалось получить только одну гибридому ф3), которую клонировали 5 раз, затем подвергали препаративному накоплению в культуральной среде. Гибридома показывала хорошие ростовые свойства и продукцию антител в титре 1/78000,
определяемую с помощью непрямого ИФА. По данным изотипического анализа МКА D3 относились к классу IgG1.
Специфичность полученных МКА D3 исследовали в непрямом ИФА, используя в качестве гетероло-гичных антигенов стафилококковые энтеротоксины А, В и белки сыворотки человека. Анализ показал высокую специфичность МКА D3 к нативному САТ (нСАТ), что также было подтверждено в иммуноблот-тинге, в котором МКА D3 связывались с полосой, соответствующей нСАТ. Таким образом, были получены МКА, специфически распознающие эпитоп нативного САТ.
Для оценки способности связывания МКА D3 с рСАТ мы использовали непрямой и ингибиторный варианты ИФА. В непрямом ИФА рСАТ сорбировали на полистирольном планшете при различных рН и установили, что рСАТ в концентрации 5 мкг/мл хорошо сорбировался на пластике при любом рН, а культуральная среда, содержащая МКА D3, специфичные к нСАТ, показывала высокий сигнал связывания с рСАТ. При титровании МКА D3, содержащихся в сульфатной фракции культуральной среды гибридомы D3, на иммобилизованном рСАТ было установлено, что антитела связываются с ним в диапазоне от 0,18 до 6 мкг/мл (рис. 3).
Для подтверждения антигенной идентичности рекомбинантного и нативного САТ мы провели ингибиторный ИФА, принцип которого заключается в способности свободного антигена подавлять связывание МКА с иммобилизованным на твердой фазе антигеном. По степени подавления этой реакции можно количественно судить о наличии его в пробе. Для этого свободный рСАТ в различных концентрациях инкубировали в ячейках с иммобилизованным рСАТ (3 мкг/мл) совместно с МКА D3 (0,35 мкг/мл). После 2-х ч инкубации связавшиеся с иммобилизованным рСАТ антитела выявляли антивидовым конъюгатом. По степени торможения реакции связывания судили о наличии рСАТ в растворе. Как видно на рис. 4, свободный рСАТ дозозависимо ингибировал связывание МКА D3 с фиксированным на твердой фазе рСАТ.
Заключение.
В результате проведённых исследований нами были получены рекомбинантные формы стафилококкового альфа-токсина (САТ), продуцируемые клетками Е.соН. Впервые было показано, что рекомбинантный САТ (рСАТ) обладает высокой гемолитической активностью, сравнимой с таковой у нативного САТ из S.aureus. рСАТ секретировался в периплазму и в культуральную жидкость. Эти факты свидетельствуют о корректном процессинге чужеродного для Е.соН белка, являющегося типичным секреторным белком
Рис. 3. Титрование моноклональных антител D3 в непрямом иммуноферментном анализе при использовании в качестве антигена рекомбинантного САТ.
Контроль - фоновая реакция антител в отсутствии рСАТ, опыт - связывание антител с иммобилизованным
рСАТ.
грамположительных бактерий. Рекомбинантный САТ, очищенный аффинной хроматографией на Ni2+-NTA-сефарозе-6В, использовали для конструирования диагностической тест-системы на основе ингибиторного ИФА.
Ранее мы получали МКА к САТ при использовании метода иммунизации in vitro [17]. Однако эти антитела имели IgM изотип и показывали высокую полиспецифичность. Кроме того, полученные гиб-ридомы, продуцирующие IgM, оказались нестабильными и через несколько пассажей потеряли антите-лопродукцию.
Получение МКА на нСАТ иммунизацией in vivo связано с некоторыми трудностями в виду его значительной токсичности. В связи с этим требовалось применение особой формы предъявления нативной молекулы САТ в качестве иммуногена. В данной работе мы конъюгировали нСАТ к активированной целлюлозе. При использовании этого иммуногена мыши не погибли даже после длительной иммунизации. С помощью непрямого варианта ИФА и иммуноблот-тинга нами было доказано, что полученные МКА D3 оказались высокоспецифичными как к нативной, так и рекомбинантной формам САТ, что позволило нам сделать вывод о приемлемости использования рСАТ для разработки иммуноферментной диагностической тест-системы. Ввиду того, что нам удалось получить только одно антитело, распознающее общий для нативного и рекомбинантного САТ эпитоп, мы попытались сконструировать тест-систему на основе ингибиторного ИФА. В модельном эксперименте МКА D3 оказалось эффективным в распознавании молекулы рСАТ в жидкой фазе в концентрации до
0,3-0,6 мкг/мл.
Рис. 4. Ингибиторный иммуноферментный анализ рекомбинантного САТ при использовании моноклональных антител D3.
Контроль - связывание МКА с иммобилизованным рСАТ в отсутствии свободного рСАТ; опыт - ингибирование связывания МКА с иммобилизованным рСАТ в присутствии свободного рСАТ.
Таким образом, рекомбинантный САТ и моноклональное антитело D3, полученные нами, могут быть пригодными для разработки диагностической тест-системы для выявления нативного САТ в стафилококковых культурах, высеваемых от инфекционных больных, а также в сыворотке крови больных при стафилококковом сепсисе.
Авторы выражают благодарность Камыниной Т.П. за оказанную помощь в клонировании гена САТ.
STUDY OF HEMOLYTIC AND ANTIGENIC PROPERTIES OF THE RECOMBINANT FORMS OF Staphylococcus aureus ALPHA-TOXIN
Beklemishev A.B., Tleulieva R., Nomokonova N.N., Belyaev N.N..
The hla gene of staphylococcal alpha-toxin (SAT) was cloned in two variants in expressive vector pREB-6His in E.ooli. Four recombinant clones of E^oli have been obtained. Two of them produced polypeptide precursors of SAT, both containing, and not containing hexa-histidine sequence in the С-termini. Two others produced the chimerical polypeptides consisting of signal polypeptides of Serratia marcescence nuclease at the N-termini of chains, joined with the sequences of mature SAT. The polypeptides-precursors of SAT, but not chimerical proteins, underwent normal processing, were secreted in the periplasm and culture medium and possessed hemolytic activity. The monoclonal antibody D3 obtained to natural SAT, reacted with recombinant SAT specifically. The prototype of ELISA test for determination of SAT in liquids is designed on a basis of recombinant SAT and monoclonal antibody D3.
Литература
1. Bhakdi S., Tranum-Jensen J. Alpha-toxin of Staphylococcus aureus // Microbiol. Rev. 1991. 55. 4. 733-751.
2. Park P.W., Foster T.J., Nishi E., et al. Activation of syndecan-1 ectodomain shedding by Staphylococcus aureus alpha-toxin and beta-toxin // J. Biol. Chem. 2004. 279. 1. 251-258.
3. Harshman S., Sugg N. Bacterial Protein toxins // Zentral blatt fur Bacteriologie Microbiologie und Hygiene I. Abteilung. Suppl. 15. / Ed. by Falmagne et al., Stuttgart; N.Y: Gustav Fisher. 1986.
4. Jonas D., Walev I., Berger T., et al. Novel path to apoptosis: small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T lymphocytes evoke internucleosomal DNA degradation // Infect. Immun.1994. 62. 4. 1304-1312.
5. Essmann F, Bantel H., Totzke G., et al. Staphylococcus aureus alpha-toxin-induced cell death: predominant necrosis despite apoptotic caspase activation // Cell Death Differ. -2003. 10. 11. 1260 -1272.
6. Onogawa T. Staphylococcal alpha-toxin synergistically enhances inflammation caused by bacterial components // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2002. 33. 1. 15-21.
7. Grandel U., Reutemann M., Kiss L., et al. Staphylococcal alpha-toxin provokes neutrophil-dependent cardiac dysfunction: role of ICAM-1 and cys-leukotrienes // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2002. 282. 3. H1157-1165.
8. Rose F., Dahlem G., Guthmann B., et al. Such reactivity of the alveolar epithelial cells may be relevant for pathogenic sequelae in staphylococcal lung disease // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2002. 282. 2. L207-214.
9. Goerke C., Fluckiger U., Steinhuber A., et al. Impact of the regulatory loci agr, sarA and sae of Staphylococcus aureus on the induction of alpha-toxin during device-related infection resolved by direct quantitative transcript analysis // Mol. Microbiol. 2001. 40. 6. 1439-1447.
10. Kato I., Noda M. ADP-ribosylation of cell membrane proteins by staphylococcal alpha-toxin and leukocidin in rabbit erythrocytes and polymorphonuclear leukocytes // FEBS Lett. 1989. 255. 59-62.
11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Москва, 1984. 480 с.
Maniatis T., Frich E., Sembruk G. Methods of gene engineering. Molecular cloning. M. 1984. 480.
12. Bernheimer A.W. Assay of hemolytic toxins // Methods in Enzymology. 1988. 165. 213-217.
13. Randall L. L., Hardy S. J. S. Correlation of competence for export with lack of tertiary structure of the mature species: a study in vivo of maltose-binding protein in E. coli // Cell. 1986. 46. 921-928.
14. Лехтцинд Е.В., Гурвич А.Е. Синтез высокоемкого иммуносорбента на основе суспензии целлюлозы // Бюлл. экспер. биол. 1981. 7. 68-70.
Lekhtstind E.V., Gurvich A.E. Synthesis of high capacious sorbents on the basis of suspension cellulose //Bulletin of experimental biology. 1981. 7. 68-70.
15. Campbel A. Monoclonal antibody technology. Amsterdam: Elsevier, 1984. 265 p.
16. Ball T.K., Saurugger P.N., Benedik M.J. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli // Gene. 1987. 57. 183-192.
17. Беляев Н.Н., Закирьянова Г.К, Костин Г.О., и др. Получение моноклональных антител к стафилококковому а-токсину при использовании техники иммунизации in vitro // Бюлл. экспер. биол. 1991. 7. 73-75.
Belyaev N.N., Zakir'yanova G.K., Kostin G.O etc. Preparation of monoclonal antibodies to staphylococcal а-toxin using immunization technique in vitro - Bulletin of experimental biology. 1991. 7. 73-75.
