CC BY
21Journal of Siberian Federal University. Biology 2 (2016 9) 169-179
УДК 579.22+577.11
Cloning and Characterization of Polyhydroxybutirate Synthase from Methylobacterium extorquens AM1
Svetlana A. Zamakhaeva, Dmitry N. Fedorov*, Nina V. Doronina and Yuri A. Trotsenko
G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms RAS 5 Prospect Nauki, Pushchino, Moscow region, 142290, Russia Pushchino State Institute of Natural Sciences 3 Prospect Nauki, Pushchino, Moscow region, 142290, Russia
Received 00.12.2015, received in revised form 00.02.2016, accepted 00.06.2016 Multiple genes encoding putative PHB synthases (up to 5 in single strain) were found in Methylobacterium genomes. As a result of phylogenetic analysis proteins PhaCl, PhaC2, PhaC3 were identified as class I PHB synthases, PhaC4 proteins were identified as class III PHB synthases, while PhaC5 apparently belongs to uncharacterized class of PHB synthases. Firstly, the recombinant class IPBH synthase (EC 2.3.1.B2) encoded by phaCl gene from Methylobacterium extorquens AMI was purified and characterized. Molecular mass of enzyme monomer was 78 kDa. Michaelis constant (KJ for PhaCl was 1,3 mM and maximal reaction rate (Vmax) was 0,1 цmol min1mg1. The deletion mutant of Methylobacterium extorquens in the phaC gene was obtained which is promising for further study of peculiarities of methylobacteria's PHB biosynthesis.
Keywords: methylotrophs, polyhydroxybutyrate, PHB-synthase, Methylobacterium extorquens, phaC.
DOI:
© Siberian Federal University. All rights reserved
* Corresponding author E-mail address: fedorov@ibpm.pushchino.ru
Клонирование и характеристика полигидроксибутиратсинтазы из Methylobacterium extorquens AMI
С.А. Замахаева, Д.Н. Федоров, Н.В. Доронина, Ю.А. Троценко
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина РАН Россия, 142290, Московская область, Пущино, Проспект Науки, 5 Пущинский государственный естественно-научный институт Россия, 142290, Московская область, Пущино, Проспект Науки, 3
В результате поиска генов, кодирующих вероятные ПГБ-синтазы в геномах бактерий рода Methylobacterium, выявлены множественные (до пяти у одного штамма) гены ПГБ-синтаз. Филогенетическим анализом показано, что белки PhaCl, PhaC2, PhaC3 относятся к I классу ПГБ-синтаз, белки PhaC4 - к ПГБ-синтазам III класса, тогда как PhaC5, по-видимому, представляет неохарактеризованный класс ПГБ-синтаз. Впервые выделена и охарактеризована рекомбинантная ПГБ-синтаза I класса (КФ 2.3.1.B2) из Methylobacterium extorquens AM1, кодируемая геном phaCl. Молекулярная масса мономера фермента составила 78 кДа. Константа Михаэлиса (Km) для PhaCl из штамма AM1 составила 1,3 мМ, а максимальная скорость реакции (Vmax) - 0,1 мкмоль-мин'1-мг-1. Получен делеционный мутант Methylobacterium extorquens по гену phaC, перспективный для дальнейшего исследования особенностей биосинтеза ПГБметилобактериями.
Ключевые слова: метилотрофы, полигидроксибутират, ПГБ-синтаза, Methylobacterium extorquens, phaC.
Введение
Полигидроксиалканоаты - полиэфиры микробного происхождения, синтезируются прокариотами при несбалансированных условиях роста (лимит по одному из питательных веществ - азоту, фосфору, калию и другим при избытке углерода) и являются для клеток резервным субстратом эндогенного дыхания (Anderson, Dawes, 1990; Braubegg et al., 1998; Madison, Huisman, 1999). К настоящему моменту описано более 300 продуцентов ПГА и около 150 различных полигидроксиалка-новых кислот, однако наибольшую коммер-
ческую ценность представляет полигидроксибутират (ПГБ) (Steinbüchel, Valentin, 1995; Ezhov et al., 2013). Хотя ПГБ обладает рядом полезных свойств (термопластичность, био-разлагаемость и биосовместимость), высокая стоимость препятствует реализации процесса биосинтеза полимера в промышленных масштабах. Для повышения рентабельности ПГБ ведется поиск доступных по цене углеводородных субстратов и активных штаммов -продуцентов ПГБ (Doronina et al., 2008). В качестве основных ростовых субстратов для биосинтеза полимеров чаще всего использу-
ют углеводы. В то же время для РФ дешевым источником углерода служит метанол, производимый в стране крупнотоннажно (Ezhov et al., 2013).
Метанол, получаемый из возобновляемых ресурсов, обладает значительным потенциалом в качестве сырья для биотехнологических задач из-за большого разнообразия метилотрофных микроорганизмов, отличающихся путями метаболизма и поэтому являющихся ценным ресурсом для биоинженерии различных продуктов из метанола. Аэробные метилобактерии с сериновым путем Q-метаболизма синтезируют из метанола 40-80 % ПГБ от веса сухой биомассы, среди них наиболее широко изучен факультативный метилотроф Methylobacterium extorquens Urakami and Komagata 1984, способный также к росту на метаноле-сырце. За последние пятьдесят лет были изучены физиологические, биохимические, транскриптомные, протеогеномные аспекты метаболизма M. extorquens (Ochsner er al., 2015; Ezhov et al., 2013; Poroshina et al., 2014). Несмотря на это, недостаточно исследованы такие важные аспекты биосинтеза ПГБ, как разнообразие и распространение генов ПГБ-синтаз, а также биохимические свойства этих ферментов. Определение биохимических свойств ПГБ-синтазы актуально, поскольку основные свойства ПГБ - молекулярная масса, степень кристалличности - могут варьировать в достаточно широких пределах вследствие генетических особенностей продуцентов, условий синтеза и выделения полимеров (Anderson, Dawes, 1990). Вероятно, исследование свойств ферментов биосинтеза полимера позволит выявить связь между свойствами ПГБ-синтаз и различными физико-химическими особенностями ПГБ, что в дальнейшем даст возможность осуществлять направленный синтез биополимера с заданными характеристика-
ми. Направленный синтез ПГБ с заданными характеристиками - сложная теоретическая задача, решение которой требует фундаментальных знаний о закономерностях синтеза и влиянии структуры на физико-химические свойства полимера.
Целью данной работы было изучение биохимических свойств ПГБ-синтазы M. extorquens AM1 и разнообразия генов биосинтеза ПГБ у представителей рода Methylobacterium.
Материалы и методы
Векторы, бактериальные штаммы и условия их культивирования
Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе, перечислены в табл. 1. Methylobacterium extorquens AM1 (CIP 106787 = DSM 6343 = VKM B-2191) выращивали на среде «К» при 29 °С в колбах объемом 0.75 л на качалке (180 об/мин), в качестве источника углерода и энергии вносили СН3ОН (0,5 %) (Ivanova et al., 2001), сукцинат натрия (0,3 %) или ацетат натрия (0,3 %). При культивировании мутанта метилобактерий в среду добавляли гентамицин - 20 мкг/мл.
Штаммы Escherichia coli (табл. 1) культивировали на среде LB. Для выращивания трансформированных штаммов E. coli T0P10 и S17-1 в среду добавляли антибиотики (мкг/ мл): ампициллин - 100, канамицин - 30, ген-тамицин - 2.5, хлорамфеникол - 40.
Общие методы
Выделение геномной и плазмидной ДНК, эндонуклеазные реакции, лигирование, трансформацию штаммов E. coli проводили при помощи стандартных методов (Sambrook, Russell, 2001). Реакционная смесь полиме-разной цепной реакци (ПЦР) содержала (30 мкл): 1*буфер для Pfu-ДНК-полимеразы, по 150 мкM каждого из дезоксирибонуклеотид-171 -
Таблица 1. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе
Штамм/плазмида Генотип/ Характеристика Источник
Escherichia coli S17-1 thi pro recA hsdR [RP4-2Tc::Mu-Km::Tn7] Tpr Smr (Simon et al., 1983)
E. coli TOP10 mcrA,A(mrr-hsdRMS-mcrBC), Phi80lacZ(del) M15, AlacX74, deoR, recAl, araD139, A(ara-leu)7697, galU, galK, rpsL(SmR), endAl, nupG Invitrogen
E. coli Rosetta F-ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysSRARE (CamR) Novagen
Me thylobacte rium Штамм дикого типа VKM B-2064T (=NCIMB
extorquens AM1 9399T = JCM2802T = TK001T)
M. extorquens AM1 Нокаут-мутант AM1 по гену phaCl, Gmr Данная работа
AphaCJ
pHUE Вектор для экспрессии аутентичных рекомбинантных белков, Apr (Catanzariti et al., 2004)
pK18-mob Мобилизуемый суицидальный вектор для клонирования, Kmr (Schafer et al., 1994)
p34S-Gm Вектор, содержащий Gm'-кассету, Gmr, Apr (Dennis, Zylstra, 1998)
p7A-108 pHUE, содержащий Асс651/Ес(Ж1-фрагмент с геном phaC из M. extorquens AM1 Данная работа
p7A-112 pK18mob, содержащий 5'-концевой участок гена phaCl из M. extorquens AMI, Kmr «»
p7A-113 p7A-112, с клонированным З'-концевым участком гена phaCl из M. extorquens AM1, Kmr «»
p7A-114 Производная p7A-113, содержащая BamHI-фрагмент Gm'-кассеты из p34S-Gm, Kmr, Gmr «»
трифосфатов, по 200 нМ соответствующих праймеров, 100 нг геномной ДНК, 3 % (об/об) диметилсульфоксида (Sigma), 2 ед. Pfu-ДНК-полимеразы (СибЭнзим). Для всех комбинаций праймеров использовали следующий температурно-временной режим: начальная денатурация - 3 мин при 96 °C, с последующими 30-ю циклами 20 с при 94 °C, 20 с при 60 °C, 4 мин при 72 °C; конечная полимеризация - 5 мин при 72 °C. Все ПЦР-фрагменты очищали при помощи Zymoclean Gel DNA Kit (Zymo Research, США), согласно рекомендациям фирмы-производителя.
Филогенетический анализ
Для выявления генов, кодирующих ПГБ-синтазу, в хромосомах бактерий из рода Methylobacterium, полные геномные последо-
вательностикоторыхпредставленывОепВапк. применяли программу поиска аминокислотных последовательностей (Protein Blast) в пакете программ BLAST с использованием аминокислотной последовательности белка PhaC (номер доступа GenBank: WP_012753238.1) из Methylobacterium extorquens AM1. Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили при помощи программы ClustalW (Thompson et al., 1994). Для построения филогенетического дерева брали модель UPGMA (unweighted-pair group method with average linkages), реализованную в пакете программ MEGA (Tamura et al., 2007), для тестирования надежности построенного дерева использовали значения bootstrap (1000 повторностей). В дерево включены последовательности охарактеризованных ПГБ синтаз I класса из
Cupriavidus necator, II класса из Pseudomonas aeruginosa, III класса из Allochromatium vinosum и IV класса из Bacillus megaterium.
Получение нокаут-мутанта Methylobacterium extorquens AM1 по гену ПГБ-синтазы
Фрагмент ДНК, содержащий полную последовательность гена phaC1 из хромосомы Methylobacterium extorquens AM1, ампли-фицировали, используя праймеры phaC-F (SphI) 5 '-ATTATGCATGCTAGACCTTTGG GAGGACGTGTCG-3' и phaC-R (Acc65I) 5' -CACGGTACCTGTCGATCCCTCACACCTT CATG-3'. Полученный ПЦР-фрагмент длиной 1888 п.н., обработали рестриктазами SphI и BamHI, в результате чего получили фрагмент в 300 п.н. содержащий 5'-концевой участок гена ПГБ-синтазы. Далее фрагмент клонировали в векторе pK18mob (табл. 1), раскрытом по тем же сайтам. В результате получили вектор p7A-112 (табл. 1). Фрагмент гена phaC1, содержащий 3'-концевой участок, амплифицировали с помощью сочетания праймеров Mext-phaCBamHIF (BamHI) 5'-CCAGGATCCGCGGCAAGGTCGATTAC G-3' и phaC-R, который после обработки рестриктазами BamHI и Acc65I клонировали в векторе p7A-112, что дало плазмиду p7A-113. Затем в векторе p7A-113, раскрытом по сайту BamHI, клонировали BamHI-фрагмент плаз-миды p34S-Gm размером 865 п.н. Таким образом, получили вектор p7A-114, который содержит ген phaC, вместо центральной части которого находится кассета устойчивости к гентамицину. Плазмидой p7A-114 трансформировали клетки E. coli S17-1, которые использовали для конъюгативного переноса в клетки M. extorquens AM1, как описано ранее (Fedorov et al., 2010). Колонии трансконъ-югантов отбирали на агаризованной среде K с добавлением метанола и гентамицина, а
также дополнительно проверяли ПЦР на наличие мутантного аллеля.
Клонирование гена phaC в экспрессионном векторе
Открытую рамку считывания гена phaC амплифицировали из геномной ДНК M. extorquens AM1 с использованием пары праймеров (в скобках указаны сайты рестрикции) phaC-UpF (EcoRI) 5'-TGAATTCATGGGCACC GAGCGGACGAAC-3' и phaC-R. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в векторе pHUE, раскрытом по соответствующим сайтам, в результаты чего получена плазмида p7A-108 (табл. 1).
Очистка рекомбинантной ПГБ-синтазы
Для синтеза рекомбинантного белка PhaC клетки E. coli Rosetta, трансформированные плазмидой p7A-108, выращивали в 2 л среды LB с добавлением ампициллина и хлорамфеникола при 28 °C до ОП600 = 0.6-0.7. Синтез белка индуцировали добавлением 0.2 мМ изопропил-1-тио^-Э-галактопиранозида (ИПТГ); клетки инкубировали в течение ночи на качалке (180 об/мин) при 28 °C. Ре-комбинантный белок выделяли из суперпродуцента E. coli в соответствии с методиками фирмы Qiagen с небольшими изменениями (Henco, 1992). Клетки осаждали центрифугированием (7000 g, 15 мин) при 4 °C, осадок ресуспендировали в 30 мл 20 мМ Tris (pH 8.0), содержащий 0.5 М NaCl, 5 мМ имидазола. Ре-суспендированные клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE (Англия) (150 Вт, 10 Гц, 6 раз по 15 с с 1 мин интервалами) при охлаждении (лёд). Клеточный лизат центрифугировали (10000 g, 20 мин) при 4 °C, супернатнант наносили на колонку, содержащую 1 мл №2+-нитрилтриацетатной (НТА) агарозы (Invitrogen). После интенсивного про-
мывания буфером, содержащим 20 мМ Tris (pH 8.0), 0.5 M NaCl, 80 мМ имидазола, связанный рекомбинантный белок элюировали с колонки буфером следующего состава: 20 мМ Tris (pH 8.0), 0.5 M NaCl, 200 мМ имидазола. Белковые фракции по 0.5 мл проверяли при помощи ДСН-ПААГ (Laemmli, 1970). Концентрацию белка определяли спектрофото-метрически, с применением коэффициента экстинкции, рассчитанного по предсказанной аминокислотной последовательности в пакете программ Vector NTI Suite 9.1 (Invitrogen), а также методом Брэдфорда (Bradford, 1976).
Определение активности ПГБ-синтазы
Активность ПГБ-синтазы определяли при 30 °C непрерывным и дискретным методами. Для непрерывного исследования активности фермента реакционная смесь включала в себя (общий объем 200 мкл): 50 мМ Tris-HCl pH 8.0, от 0.005 до 0.8 мM D,L-ß-гидроксибутирил коэнзима A (3ГБ-КоА; Sigma), 0.124 мкг очищенного His6-PhaC, 20 hM дитионитробензоата (ДТНБ). Реакцию начинали добавлением ПГБ-синтазы. Активность определяли спектрофотометриче-ски («Shimadzu UV-1700»), по образованию тионитробензоата (ТНБ), продукта реакции освобожденного коэнзима А с ДТНБ, при длине волны 412 нм, учитывая молярный коэффициент экстинкции ТНБ (13600 M-1 см-1). Активность PhaC наблюдали в течение нескольких минут (Pfeiffer, Jendrossek, 2014).
Кроме того, активность ПГБ-синтазы определяли дискретным методом. Реакционная смесь (200 мкл) содержала: 50 мМ Tris-HCl pH 8.0; 0.5 мМ 3ГБ-КоА; 0.6 мкг His6-PhaC. Реакцию начинали добавлением фермента. Аликвоты реакционной смеси (20 мкл) отбирали сразу, через 2, 10 и 40 мин и после инкубации при 30 °C останавливали реакцию добавлением 40 мкл 10%-ный (в/об)
трихлоруксусной кислоты. После центрифугирования к 55 мкл супернатанта добавляли 145 мкл 1 мМ ДТНБ и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Концентрацию освободившегося в реакции полимеризации КоА определяли спектрофотометрически (Х=412 нм) по образованию ТНБ.
Результаты и обсуждение
ПГБ синтезируют природные и генетически модифицированные штаммы при лимите по одному из конструктивных элементов (азоту, кислороду, фосфору и т.д.) и избытке источника углерода (Braunegg et al., 1998). Известно, что цена источника углерода составляет около 40 % общей себестоимости пластика, поэтому важной задачей является подбор продуцентов, растущих на недорогом источнике углерода (Choi, Lee, 1997). Такими продуцентами служат метилобактерии, потребляющие дешевый непищевой субстрат -метанол, а также метанол-сырец (Poroshina et al., 2014). Среди метилотрофных продуцентов ПГБ наиболее известны представители рода Methylobacterium с сериновым путем Q-метаболизма, способные накапливать до 80 % ПГБ от сухой биомассы при росте на метаноле (Follner et al., 1997).
На данный момент ПГБ-синтазы, в целом, малоизучены. В базе данных BRENDA (http://www.brenda-enzymes.org) имеются сведения о нескольких ПГБ-синтазах I класса из Cupriavidus necator, Pseudomonas sp., Aeromonas caviae. Несмотря на многочисленные исследования, направленные на оптимизацию условий культивирования и увеличение выхода ПГБ и его сополимеров, разнообразие и распространение генов биосинтеза полигидроксибутирата и биохимические свойства ПГБ-синтаз у представителей Methylobacterium исследованы недостаточно.
Используя программу BLAST, мы провели поиск генов, кодирующих вероятные ПГБ-синтазы в геномах представителей рода Methylobacterium. В качестве исходной была взята аминокислотная последовательность белка PhaC из M. extorquens AM1. В результате поиска и последующего филогенетического анализа в геномах метилобактерий выявлены от одного до пяти паралогов ПГБ-синтаз, обозначенных нами PhaC1, PhaC2, PhaC3, PhaC4 и PhaC5 (рис. 1).
Степень аминокислотной идентичности PhaC из M. extorquens AM1 с белками PhaCl остальных представителей рода составляла 100 - 64 %, с PhaC2 - 47 %, с PhaC3 - 43 %, c PhaC4 - 25 % и с ПГБ-синтазами PhaC5 -21 %. Внутри каждого типа уровень аминокислотной идентичности варьировал от 72 до 83 %. На филогенетическом дереве аминокислотные последовательности ПГБ-синтаз PhaCl, PhaC2, PhaC3, PhaC4 и PhaC5 образуют отдельные ветви. Гены, кодирующие
4
100t 100_j
100
99 72
г
100 43 38
98 54
100
98 71
Methylobacterium extorquens AM 1 (WP_012753238.1) Methylobacterium extorquens DM4 (WP_015823333.1) Methylobacterium extorquens PA1 (WP_012254404.1) Methylobacterium extorquens CM4 (WP_015951541.1) Methylobacterium sp. MB200 (WP_026105803.1) Methylobacterium populi BJ001 (WP_012455154.1) Methylobacterium sp. 88A (WP_018044441.1) Methylobacterium sp. 77 (WP_019904632.1) Methylobacterium sp. GXF4 (EIZ82534.1) Methylobacterium sp. GXF4 (WP_039903873.1) Methylobacterium mesophilicum SR1.6/6 (EMS42986.1) Methylobacterium oryzae CBMB20 (AIQ93532.1) Methylobacterium radiotolerans JCM_2831 (ACB27029.1) Methylobacterium nodulans ORS2060 (WP_015932447.1) Methylobacterium sp. 4-46 (WP_012335469.1) Methylobacterium aquaticum DSM_16371 (WP_048466217.1) Methylobacterium aquaticum MA-22A (BAQ44629.1) Methylobacterium platani JCM 14648 (WP_048432524.1) Methylobacterium tarhaniae DSM25844 (WP_048453117.1) Methylobacterium variabile DSM16961 (WP_048443556.1) Methylobacterium nodulans ORS 2060 (WP_015931270.1) Methylobacterium sp. 4-46 (WP_012331829.1) Methylobacterium oryzae CBMB20 (WP_052083893.1) Methylobacterium tarhaniae DSM25844 (WP_048452295.1) Methylobacterium extorquens DM4 (WP_012779095.1) Methylobacterium nodulans ORS2060 (WP_015927164.1) Methylobacterium sp. 4-46 (WP_012335755.1) Cupriavidus necator N-1 (WP_013956451.1) Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WP_003115652.1) Bacillus megaterium ATCC 11561 (WP_013055939.1)
Allochromatium vinosum DSM180 (WP_012969309.1) _
Methylobacterium sp. 4-46 (WP_012330752.1) Methylobacterium sp. GXF4 (EIZ83843.1) Methylobacterium oryzae CBMB20 (WP_051045109.1) Methylobacterium radiotolerans JCM2831 (WP_012319368.1) Methylobacterium mesophilicum SR1.6/6 (EMS42083.1) Methylobacterium nodulans ORS2060 (WP_015929861.1) Methylobacterium sp. 4-46 (WP_050777451.1)
PhaCl
PhaC2
PhaC3
PhaC4 PhaC5
—i-1-1-1—
0.6 0.5 0.4 0.3
4
Рис. 1. Филогенетическое дерево ПГБ-синтаз
100
100
100
100
72
65
49
80
100
99
98
100
100
белки PhaC1, были обнаружены у всех представителей рода Methylobacterium, геномы которых опубликованы на данный момент, поэтому ПГБ-синтаза PhaC1 является ключевым ферментом биосинтеза полигидрокси-алканоатов у данного рода. На дендрограмме кластер PhaC1 делится на две большие ветви, что коррелирует с филогенетическим деревом, построенном на основе последовательностей гена 16S рРНК. Это свидетельствует о том, что у метилобактерий основной фермент биосинтеза ПГБ наследуется вертикально.
Поскольку аминокислотные последовательности белков PhaC1, PhaC2, PhaC3 имеют наибольшее сходство с PhaC из Cupriavidus necator (WP_013956451.1) и формируют общую ветвь на дендрограмме, данные ферменты относятся к ПГБ-синтазам I класса.
Филогенетический анализ показал, что белки PhaC4 наиболее близки к ПГБ-синтазам III класса, например к PhaC из Allochromatium vinosum DSM180 (WP_012969039.1), которая образует с синтазами PhaC4 общую ветвь на дендрограмме. ПГБ-синтазы III класса представляют собой гетеромерные ферменты, состоящие из двух субъединиц: PhaC и PhaE, молекулярная масса которых составляет ~40 кДа. Так, у пяти штаммов Methylobacterium, содержащих гены phaC4, в генетическом контексте, выше гена phaC, обнаружены гены phaE, что в совокупности с филогенетическими данными позволяет отнести белки PhaC4 к ПГБ-синтазам III класса.
Интересно, что ПГБ-синтаза PhaC5 встречается только у тех штаммов, в геноме которых обнаружены синтазы PhaC2. Аминокислотная последовательность белков PhaC5 не проявляет высокий уровень сходства ни с одним из описанных ранее классов ПГБ-синтаз (уровень аминокислотной идентичности ниже 21 % с остальными синтазами) и формирует отдельную ветвь на
дендрограмме. Помимо этого белки PhaC5 имеют нехарактерную молекулярную массу субъединицы 49 кДа. По-видимому, белки PhaC5 относятся к неописанному ранее классу ПГБ-синтаз.
На данный момент единственным штаммом, обладающим генами всех пяти типов ПГБ-синтаз, является Methylobacterium sp. 4-46. Практически все штаммы M. extorquens имеют ген только одной ПГБ-синтазы, PhaCl, за исключением M. extorquens DM4, в геноме которого есть также ген, кодирующий PhaC3. Вероятно, в этом случае дополнительная ПГБ-синтаза может участвовать в метаболизме данного деструктора дихлорметана.
Для детального изучения ПГБ-синтазы I класса ген phaCl из M. extorquens AM1 выбрали для клонирования и экспрессии в клетках E. coli Rosetta. Гетерологичный белок с полигистидиновой меткой на N-конце был выделен и очищен методом металл-хелатной хроматографии. Электрофорезом His6-PhaC1 в ДСН-полиакриламидном геле установлена молекулярная масса мономера, которая равна 78 кДа, что соответствует расчетному значению.
При непрерывном мониторинге активно -сти фермента в течение 5 мин после запуска реакции не была выявлена лаг-фаза. С другой стороны, при использовании дискретного метода, когда активность фермента измеряли через 0, 2, 10 и 40 мин, в первых трех пробах не наблюдали детектируемого изменения ОП. Возможно, в реакции полимеризации PhaC1 присутствует лаг-фаза, но, по-видимому, длительнее, чем у ранее описанных ПГБ-синтаз I класса (Song et al., 2000; Pfeiffer and Jendrossek, 2014).
Поскольку ПГБ-синтаза проявляла достаточно высокую активность в присутствии ГБ-КоА, были определены кинетические характеристики фермента. В результате анализа 176 -
зависимости активности фермента от концентрации субстрата выяснили, что синтаза PhaC подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен (рис. 2). Эффект кооперативности отсутствует, поскольку при тестировании уравнением Хилла коэффициент равен единице.
Максимальная скорость реакции исследуемого фермента 0.1 мкМ/мин/мг белка. Значение Константы Михаэлиса PhaCl составило 1.3 мМ 3-ГБ-КоА, что примерно в 7 раз больше Km ПГБ-синтазы I типа PhaC из C. necator (Km = 0.19 мМ) (Normi et al., 2005). Такое отличие в значениях можно объяснить значительными различиями в аминокислотных последовательностях этих белков, а также наличием аффинных меток на N-конце ПГБ-синтазы из M. extorquens AM1. Кроме того, известно, что на N-концевом участке ПГБ-синтаз нет консервативных последовательностей, что определяет уровень активности ПГА-синтазы (Grage et al., 2009).
Очевидно, что ПГБ-синтаза метилобак-терий, кодируемая геном phaCl, выполняет
основную функцию в биосинтезе ПГБ. Чтобы понять роль дополнительных ферментов в биосинтезе ПГБ у метилобактерий и оценить возможность комплементации мутации дополнительным геном, закодированным в геноме, необходимо получить мутант M. extorquens AM1 по гену phaCl. При помощи ПЦР, а также реакций клонирования и лигирования был получен вектор p7A-114, содержащий 5'- и З'-концевые участки гена phaCl, вместо центральной части которого клонирована кассета устойчивости к гента-мицину. Вектор для мутагенеза переносили при помощи конъюгативного переноса из штамма E. coli S17-1 в клетки штамма AM1 и отбирали мутантов метилобакте-рий с делецией в гене phaC на селективных средах с гентамицином и метанолом. Наличие мутантного аллеля гена phaCl в геноме M. extorquens AM1 подтверждено ПЦР-анализом.
Мутант M. extorquens по гену phaCl оказался не способен к биосинтезу ПГБ и имел
0,10
-S 0,08
И S
0,06
Я 0,04
с
а §
О
0,02
0,00
3 4
3-ГБ-КоА (мМ)
Рис. 2. График зависимости активности ПГБ-синтазы PhaC1 из Methylobacterium extorqens AM1 от концентрации субстрата ГБ-КоА
ростовые дефекты. Так, скорость роста M. extorquens AM1AphaC1 на среде "К" с метанолом в качестве источника углерода была крайне низкой. Ростовые характеристики улучшались при росте мутанта на среде с ацетатом или сукцинатом натрия. При продолжительном пересеве культуры на жидкую среду "К" с сукцинатом наблюдали увеличение скорости роста, что может быть связано с компенсацией мутации анаплеротическими биохимическими путями. Ранее мутант M. extorquens AM1AphaC1 был получен в лаборатории Лидстром (Korotkova, Lidstrom, 2001) и также характеризовался различными ростовыми нарушениями.
Мутант АрИаС1 планируется использовать для его комплементации генами ПГБ-синтаз для оценки свойств продуцируемого полимера.
Таким образом, нами впервые обнаружен полиморфизм генов биосинтеза ПГБ у метилобактерий, а также охарактеризована ПГБ-синтаза I класса из МеЛуЫа^епыт ех(огдиет АМ1, которая по своим структурным и биохимическим особенностям отличается от ранее описанных синтаз. Проведенная работа является основой для последующего изучения разнообразия и свойств ПГБ-синтаз метилобактерий, а также продуцируемых ими биополимеров.
Работа поддержана грантом РНФ №14-14-01045. Список литературы
Anderson A.J., Dawes E.A. (1990) Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiol. Rev., 54: 450-472
Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem, 72(1-2): 248-254
Braunegg G., Lefebvre G., Genser K.F. (1998) Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: physiological and engineering aspects. J.Biotechnol., 65(2-3): 127-161
Catanzariti A.M., Soboleva T.A., Jans D.A., Board P.G., Baker R.T. (2004) An efficient system for high-level expression and easy purification of authentic recombinant proteins. Prot. Sci., 13(5): 1331-1339
Choi J., Lee S.Y. (1997) Process analysis and economic evaluation for PHB production by fermentation. Bioprocess Eng., 17(6): 335-342
Dennis J.J., Zylstra G.J. (1998) Plasposons: modular self-cloning minitransposon derivatives for rapid genetic analysis of Gram-negative bacterial genomes. Appl. Environ. Microbiol., 64(7): 27102715
Doronina N.V., Ezhov V.A., Trotsenko Y.A. (2008) Growth of Methylosinus trichosporium OB3b on methane and poly-P-hydroxybutyrate biosynthesis. Appl. Biochem. Microbiol., 44(2): 182-185
Ezhov V. A., Doronina N.V., Trotsenko Y.A. (2013) Biosynthesis of polyhydroxybutyrate/valerate with different molecular weights during the growth of Methylobacterium extorquens G-10 on a methanol-pentanol mixture. Appl. Biochem. Microbiol., 49(2): 150-153
Fedorov D.N., Doronina N.V., Trotsenko Y.A. (2010) Cloning and characterization ofindolepyruvate decarboxylase from Methylobacterium extorquens AM1. Biochemistry, 75(2): 1435-1443
Follner C.G., Madkour M., Mayer F., Babel W., Steinbuchel A. (1997) Analysis of the PHA granule-associated proteins GA20 and GA11 in Methylobacterium extorquens and Methylobacterium rhodesianum. J. Basic Microbiol., 37(1): 11-21
Grage K., Jahns A., Parlane N., Palanisamy R., Rasiah I., Atwood J., Rehm B. (2009) Bacterial polyhydroxyalkanoate granules: biogenesis, structure, and potential use as nano-/micro-beads in biotechnological and biomedical applications. Biomacromolecules, 10(4): 660-669
Henco K. (1992) The QIAexpressionist: The High Level Expression and Protein Purification System. QIAGEN Press, Hamburg, 128 p.
Ivanova E.G., Doronina N.V., Trotsenko Y.A. (2001) Aerobic methylobacteria are capable of synthesizing auxins. Microbiology, 70: 392-397
Korotkova N., Lidstrom M.E. (2001) Connection between poly-P-hydroxybutyrate biosynthesis and growth on Q and C2 compounds in the methylotroph Methylobacterium extorquens AM1. J. Bacteriol., 183(3): 1038-1046
Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685
Madison L.L., Huisman G.W. (1999) Metabolic engineering of poly (3-hydroxyalkanoates): from DNA to plastic. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63(1): 21-53
Normi Y.M., Hiraishi T., Taguchi S., Abe H., Sudesh K., Najimudin N., Doi Y. (2005) Characterization and properties of G4X mutants of Ralstonia eutropha PHA synthase for poly(3-hydroxybutyrate) biosynthesis in Escherichia coli. Macromol. Biosci., 5(3): 197-206
Ochsner A.M., Sonntag F., Buchhaupt M., Schrader J., Vorholt J. (2015) Methylobacterium extorquens: methylotrophy and biotechnological applications. Appl. Microbiol. Biotechnol., 99: 517534
Pfeiffer D., Jendrossek D. (2014) PhaM is the physiological activator of poly (3-hydroxybutyrate) (PHB) synthase (PhaC1) in Ralstonia eutropha. Appl. Environ. Microbiol., 80(2): 555-563
Poroshina M.N., Doronina N.V., Ezhov V.A., Trotsenko Y.A. (2014) Comparative characteristics of biosynthesis of polyhydroxybutyrate from methanol by Methylobacteria extorquens G10 and Methyloligella halotolerans C2. Appl. Biochem., 50(3): 253-258
Sambrook J., Russell D.W. (2001) Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor, N.Y, Cold Spring Harbor Laboratory, 676 p.
Schafer A., Tauch A., Jager W., Kalinowski J., Thierbach G., Puhler A. (1994) Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene, 145(1): 69-73
Simon R., Priefer U., Puhler A. (1983) A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram-negative bacteria. Nature Biotechnol., 1: 784-791
Song J.J., Zhang S., Lenz R.W., Goodwin S. (2000) In vitro polymerization and copolymerization of 3-Hydroxypropionyl-CoA with the PHB synthase from Ralstonia eutropha. Biomacromolecules, 1(3): 433-439
Steinbuchel A., Valentin Y.E. (1995) Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids. FEMS Microbiol. Lett, 128(3): 219-228
Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. (2007) MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol, 24: 1596-1599.
Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. (1994) Clustal-W—improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680.
