CC BY
98
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2011. Вып. 2. С. 334-345 Биология
УДК 579.844:62854
Генетическая модификация синтеза полигидроксибутирата у Methylobacterium extorquens *
Б.Ц. Ешинимаев, А. А. Лапин, А. П. Бесчастный, Ю. А. Троценко
Аннотация. Гетерологичная экспрессия гена aceA из Escherichia coli К12 под промотором метанолдегидрогеназы Methylobacterium extorquens G10 и AM1 сопровождалась появлением активности изоцитратлиазы (15 нмоль/мин/мг белка) и повышенным синтезом ПГБ в клетках трансформантов по сравнению с исходными штаммами. Мутанты M. extorquens G10, несущие ген aceA E. coli в хромосоме, также имели более высокий уровень ПГБ в клетках. Введение гена phaC, кодирующего полигидроксибутират (ПГБ)-синтазу M. extorquens AM1 в M. extorquens G10 сопровождалось появлением у трансформанта более высокой активности ПГБ-синтазы и изменением динамики накопления биополимера.
Ключевые слова: полигидроксибутират, биосинтез, клонирование, полигидроксибутиратсинтаза, изоцитратлиаза, Methylobacterium extorquens.
Введение
Многие прокариоты синтезируют и запасают в цитоплазматических гранулах поли-3-гидроксибутират (ПГБ) при несбалансированных условиях роста (дефицит азота, фосфатов, магния или кислорода) [1, 2]. ПГБ и его сополимер с валератом (ПГБВ) обладают биоразлагаемостью, биосовместимостью, термопластичностью и рассматриваются в качестве заменителей пластмасс, получаемых из нефтепродуктов. Среди метилобактерий способность накапливать в клетках ПГБ/ПГБВ особенно четко выражена у организмов с сериновым путем фиксации формальдегида [2, 3]. Метилобактерии, использующие для роста и синтеза ПГБ/ПГБВ дешевое непищевое сырье — метанол, являются наиболее перспективными
* Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России на 2009-2011 годы» (гос. контракт № 14.740.11.0111).
продуцентами биодеградируемых биопластиков [4, 5]. Секвенирование геномов нескольких штаммов «сериновых» метилобактерий [6, 7], в том числе наиболее изученного в плане синтеза ПГБ и ПГБВ M. extorquens AM1, даёт возможность конструирования рекомбинантных штаммов метилотрофов с увеличенной продуктивностью ПГБ из метанола.
M. extorquens АМ1 ассимилирует Ci-соединения сериновым путем, в котором первичным акцептором формальдегида служит глицин, образующийся из глиоксилата, но при этом отсутствует изоцитратлиаза (ИЦЛ) [8]. Недавно показано, что у метилотрофов в ИЦЛ варианте серинового цикла ацетил-КоА окисляется в глиоксилат в этилмалонатном пути, начальные этапы которого катализирует в-кетотиолаза, осуществляющая конденсацию двух молекул ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, и НАДФН-зависимая ацетоацетил-КоА-редуктаза, образующая (R)-3-гидроксибутирил-КоА, причем последний превращается в кротонил-КоА
— ключевой интермедиат в этилмалонатном пути, или направляется на биосинтез ПГБ с участием ПГБ-синтазы [9, 10, 11]. Таким образом, реакции, катализируемые в-кетотиолазой и ацетоацетил-КоА-редуктазой, являются общими для биосинтеза ПГБ и цикла регенерации глиоксилата. Учитывая эти факты и принимая во внимание дискретное расположение гена phaC, кодирующего ПГБ-синтазу вне кластера генов phbAB, мы предположили, что биосинтез ПГБ у M. extorquens регулируется на уровне транскрипции/трансляции ПГБ-синтазы и, возможно, связан с уровнем глиоксилата в клетках. Соответственно, для генетической модификации метаболизма метилобактерий с целью повышения продукции ПГБ в данной работе впервые использовали два подхода: 1) увеличение уровня глиоксилата в клетках путем введения гена изоцитратлиазы (aceA) и 2) увеличение копийности гена ПГБ-синтазы (phaC).
Материалы и методы
Штаммы и условия культивирования. Для генетической модификации метаболизма использовали два штамма метилобактерий — M. extorquens AM1 (ATCC 14718) и M. extorquens G10 [12]. Культуры выращивали в жидкой или агаризованной минеральной среде «К» [13] при 28°С в аэробных условиях с метанолом (0.5 об%). Для изучения динамики накопления ПГБ использовали ту же среду, но без источника азота. Клетки штаммов E. coli XL1-blue, JM-109 и S17-1 культивировали при 37°C в жидкой или агаризованной (1.5% агара «Difco») стандартной среде LB.
Выделение геномной и плазмидной ДНК. Геномную ДНК выделяли по методу Мармура [14] и очищали экстракцией фенолом [15]. Плазмидную ДНК из клеток штаммов E.coli XL1-blue и JM-109 выделяли с использованием набора Wizard MiniPrep «Promega» (США).
ПЦР -амплификация. Реакционная смесь (30 мкл) содержала: 75 мМ Трис-HCl pH 8.8, 20 мМ (NH4)2SO4, 0.01% Твин 20, 2.5 мМ MgCl2, по 0.5 мкМ
прямого и обратного праймеров, 0.2 мкМ дНТФ, 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы и 50-100 нг ДНК.
ПЦР проводили в следующем режиме: 95°С — 1 мин, 1 цикл; затем 25 циклов: денатурация — 94°С 30 с, отжиг — 40 с (при соответствующих Тт, указанных в табл. 1), элонгация — 72 °С 1.5 мин, и достройка — 72°С 1 мин, 1 цикл.
Таблица 1
Нуклеотидные последовательности праймеров
Праймер Последовательность (5' - 3') Ген Температура отжига
Acea1f GGT ACC ATA ACT ATG GAG CAT CTG CAC aceA 53
Acear GAA TTC GTT GTT GCT TAG AAC TGC GA aceA 53
P-AM1f GGT ACC AAC GAT CAC TCC ACC GGG TT phaC 58
P-AM1r GTC GAC TGT TGC AAC GCG CTT CTA TC phaC 58
Праймеры были синтезированы в ЗАО «Синтол» (г. Москва). Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Элюцию фрагментов из агарозного геля проводили, используя набор Wizard SV Gel (Promega, США) согласно рекомендациям фирмы-производителя.
Конструирование плазмид для экспрессии изоцитратлиазы и ПГБ -синтазы. Для экспрессии изоцитратлиазы в метилобактериях получали плазмиду pACE, содержащую ген aceA из E. coli K-12 под контролем регулируемого промотора метанолдегидрогеназы (Pm^aF). Фрагмент ДНК из E. coli K-12 (NCBI GenBank NP_418439.1), содержащий ген aceA размером 1304 п.н., амплифицировали при помощи ПЦР с Taq-полимеразой и праймерами Aceafl/Acearl. Фрагмент клонировали в вектор pTZ57R/T (Fermentas, Литва) по «А-Т» сайтам. Затем из полученного вектора pTZ57R/T-aceA вырезали фрагмент ДНК, содержащий ген aceA, по сайтам EcoRI и KpnI и субклонировали в плазмидном векторе pCM 1б0 [1б], линеаризованном этими же рестриктазами.
Для экспрессии ПГБ-синтазы в M. extorquens G10 использовали плазмиду pPHA, несущую ген phaC c собственной промоторной областью. Соответствующий фрагмент ДНК (1817 п.н.), содержащий ген phaC и промоторную область (NCBI GenBank YP_002964321.1), амплифицировали из геномной ДНК M. extorquens AM1 при помощи ПЦР с Taq-полимеразой и парой праймеров P-AM1f/P-AM1r, и клонировали в вектор pTZ57R/T по «А-Т» сайтам. Затем данный фрагмент ДНК вырезали из вектора pTZ57R/T-phaC по сайтам EcoRI и субклонировали в плазмидном векторе pCM 1б0, линеаризованном этой же рестриктазой.
Для введения гена aceA E. coli в хромосому M. extorquens G10 использовали плазмиду pTnACE, которую получали на основе вектора pTn-modOKm. Данный вектор является пласпозоном, способным к
единичному переносу генетического материала между репликонами [17]. Для конструирования рТпАСЕ плазмиду рАСЕ, содержащую ген аоеА под контролем РтхаР, гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Упе1, обрабатывали Т4 ДНК-полимеразой в присутствии дНТФ для получения тупых концов, затем гидролизовали эндонуклеазой рестрикции КИе1 и полученный фрагмент помещали в вектор рТп-тоёОКт, линеаризованный по сайтам 8тИ и 8ре1.
Гидролиз ДНК проводили, используя для каждой эндонуклеазы рестрикции соответствующий буфер и температурный режим. Полученные генетические конструкции для генов phaC и аоеА трансформировали в штамм Е.оаИ ХЫ-Ыие. Наличие генов в трансформантах проверяли ПЦР. Далее рекомбинантные плазмиды рАСЕ, рРНА и рТпАСЕ трансформировали в коньюгативный штамм Е. оаИ 817-1. Анализ уровня экспрессии клонированных белков у полученных колоний проводили стандартным электрофорезом по методу Лэммли [18].
Приготовление компетентных клеток и трансформация Е. еоИ. Компетентные клетки штаммов Е. оаИ и их трансформацию проводили модифицированным кальциевым методом [19]. Отбор трансформантов осуществляли на агаризованных средах с добавлением канамицина (50 мкг/мл).
Коньюгативный перенос плазмидной ДНК из Е. еоИ в метилобактерии. Клетки Е.оаЫ 817-1, несущие плазмидный вектор со вставкой, выращивали при 37°С в течение 24 ч с добавлением канамицина (50 мкг/мл). Для коньюгации отбирали 1 мл культуры и центрифугировали (4000 об/мин, 30 мин) для осаждения клеток. Осадок промывали 1 мл среды «К» и суспендировали в 1 мл этой среды.
Параллельно выращивали метилобактерий до ОП6оо = 0.2 — 0.3 на среде «К» (30 мкг/мл). Клетки из 30 мл культуры собирали центрифугированием (4000 об/мин х 30 мин). Осадок ресуспендировали в 2 мл среды «К» и переносили в пробирку с 1 мл отмытых клеток Е. оаИ. После перемешивания суспензию фильтровали через нитроцеллюлозный фильтр (НуЪопё, АтегеИат, Англия) с размером пор 0.45 мкм. Фильтр помещали на агаризованную среду «К», добавляя 0.1% метанола и 0.02% протеозного пептона, и инкубировали в течение 1 сут. при 28°С. Далее клетки смывали с фильтра 2 мл среды «К» с 0.5% метанола, 20 мкг/мл налидиксовой кислоты и 50 мкг/мл канамицина, суспендировали и высевали по 100 мкл на ту же агаризованную среду. Чашки инкубировали при 28°С до появления индивидуальных колоний. Выросшие колонии метилобактерий очищали от Е. оаЫ, повторно пересевая на ту же среду.
Определение активности ферментов. Клетки в экспоненциальной фазе роста центрифугировали при 6000g 30 мин и отмывали 0.05 М Трис-НС1 буфером рН 7.5 ресуспендировали в том же буфере и разрушали ультразвуком на дезинтеграторе М8Е (Англия) при 20 кГц (6х30 с) на холоду. После центрифугирования (15000g, 30 мин) полученный супернатант
диализовали в течение 1 сут в Трис-HCl буфере 50 мМ, pH 7.5. Активности ферментов определяли при 30° C. Концентрацию белка в бесклеточном экстракте определяли по методу Лоури. Изоцитратлиазу (КФ 4.1.3.1) определяли спектрофотометрически по образованию комплекса фенилгидразона с глиоксилатом при 324 нм [20]. Реакционная смесь содержала (мкмоль/мл): Трис-HCl (pH 7.5) — 50, цистеин-HCl — 2, MgCl2 • 6H2O — 10, фенилгидразин-HCl (pH 8.0) — 10.5, L-изоцитрат натрия — 5, экстракт. ПГБ-синтазу (КФ 2.3.1.-) определяли спектрофотометрически при 412 нм [21]. Реакционная смесь содержала (мкмоль/мл): Трис-HCl (pH 7.5) - 25, 5,5’-дитиобис-2-нитробензойную кислоту (ДТНБ) — 0.1, гидроксибутирил-КоА — 3, экстракт.
Количественный анализ ПГБ. Содержание ПГБ в биомассе определяли методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «LKB» (Швеция) [22]. Все количественные данные представляют среднюю арифметическую из не менее трех измерений.
Результаты и их обсуждение
Клонирование гена изоцитратлиазы aceA из E. coli в M. extorquens. Поскольку увеличение в клетках метилотрофных бактерий уровня глиоксилата, являющегося предшественником глицина — первичного акцептора С1-соединений в сериновом пути, могло позитивно влиять на скорость роста и выход биомассы метилобактерий, ожидалось, что экспрессия гена aceA E. coli в штамме-продуценте ПГБ M. extorquens AM1 усилит образование ацетил-КоА в сериновом цикле. При этом ацетил-КоА будет накапливаться в виде ПГБ.
Трансформация вектора pACE, несущего ген aceA E. coli, в M. ex-torquens AM1 привела к появлению в клетках активности изоцитратлиазы на уровне 15 нмоль/мг белка мин. ПААГ-электрофорез цитоплазматических белков трансформанта выявил дополнительную белковую полосу, которая по молекулярной массе соответствовала изоцитратлиазе (рис. 1).
У трансформанта M. extorquens AM1 выявлено изменение динамики роста и увеличение накопления ПГБ, по сравнению с контрольным штаммом (рис. 2А). Обнаружены два пика накопления ПГБ: в начале фазы активного роста и в стационарной фазе.
По-видимому, снижение уровня ПГБ в фазе активного роста связано с необходимостью дополнительного расхода углерода для роста и деления трансформированных клеток. Аналогичные трансформанты по гену ace изоцитратлиазы были получены для M. extorquens G10 с близкими ростовыми параметрами, но более высоким накоплением ПГБ (рис. 2Б).
Поскольку в промышленном масштабе продуцент, несущий необходимый ген на векторе, может оказаться малоэффективным из-за необходимости добавления антибиотика в среду и проблем с элиминацией плазмид в процессе культивирования, целевой ген необходимо встроить в хромосому.
М 1 2 3
кДа 94 66
45
31 шИ
21 ]
14 ЩМ
Рис. 1. 12% ДСН-ПААГ-электрофорез клеточных белков M. extorquens AM1: 1 — исходного штамма; 2 — клеток, трансформированных плазмидой pCM160 (контроль); 3 — клеток, несущих плазмиду pACE с геном изоцитратлиазы; М — маркеры
После коньюгативного переноса pTnACE из E. coli в M. extorquens G10 на тестовой среде с канамицином выросло 65 колоний.
Полученные штаммы ICL, представляющие собой M. extorquens G10 с встроенным в хромосому геном aceA, экспрессировали данный фермент, что выявил электрофорез тотальных клеточных белков (рис. 3).
Наличие вставки в геноме проверяли геномной гибридизацией по Саузерну, где в качестве маркерной последовательности использовали фрагмент гена aceA (рис. 4).
На основании критерия скорости роста были отобраны 4 штамма ICL, у которых определяли накопление ПГБ в стационарной фазе роста на полной среде «К» или на среде без источника аммонийного азота. В результате физиологических экспериментов был отобран наиболее активный штамм M. extorquens ICL35, который накапливал 61% ПГБ, что существенно выше, чем у исходного штамма G10 (табл. 2).
Таблица 2
Уровни накопления ПГБ (в % от веса сухой биомассы) трансформантами M. extorquens G10 со встроенным геном aceA
Условия роста M. extorquens G10 ICL8 ICL21 ICL35 ICL36
Стационарная фаза 30 44 45 50 40
Лимит по азоту 46 45 35 61 45
Клонирование гена ПГБ-синтазы M. extorquens AM1 в M. extorquens G10. Для увеличения в M. extorquens G10 копийности
Рис. 2. Накопление ПГБ (% от сух. веса) у М. ехЬотдиепв АМ1 (А) и 010 (Б). 1 и 3 — ОДбоо и содержание ПГБ у контрольных культур (клетки трансформированы вектором рСМ160); 2 и 4 — ОД600 и содержание ПГБ у штаммов, несущих ген изоцитратлиазы (клетки трансформированы
плазмидой рАСЕ)
гена рНаС, кодирующего ПГБ-синтазу, использовали ген рНаС из М. вх^тдивпв АМ1, так как его полная последовательность известна (www.ncbi.nlm.nih.gov МС_012808). Электрофорез цитоплазматических белков штамма, трансформированного плазмидой рРНА, несущей ген рНаС и его промоторную область (1817 п.н.), показал, что уровень экспрессии рНаС не отличался от контрольного штамма С10, трансформированного вектором рСМ160 без гена рНаС. Однако активность ПГБ-синтазы в бесклеточном экстракте трансформанта была выше и составляла 1.4 нмоль/мг белка мин, по сравнению с экстрактом контрольного штамма (0.48 нмоль/мг белка мин).
В клетках М. вхЬощивпв С10, трансформированных вектором рРНА из М. вхЬощивпв АМ1 или рСМ160 (без гена рНаС), выявлены различия в уровне и динамике накопления ПГБ, при этом скорость роста этих трансформантов была практически одинакова (рис. 5).
кДа
66
45
Рис. 3. 10% ДСН-ПААГ — электрофорез цитоплазматических белков М. ехЛощиепв 010 (контроль) и штаммов М. ех^щиепв 1СЬ8, М. ех^щиепв ТСЬ35, несущих в хромосоме ген асеА; М — маркеры
1 2 3 4 5 6
Рис. 4. Гибридизация 33Р-меченного зонда на ген aceA: 1 — с геномной ДНК M. extorquens G10 (дикий тип), обработанной рестриктазой BamH I; 2
— с ДНК штамма M. extorquens ICL35, обработанной рестриктазами BamH I; 3 — Sac I; 4 — EcoR I; 5 — Xma I; 6 — Xba I
Максимальное накопление ПГБ у штамма с дополнительным геном phaC происходило в конце логарифмической фазы роста и достигало 75%, в отличие от контрольного штамма, максимально накапливающего ПГБ в стационарной фазе.
Заключение
Таким образом, клонирование генов aceA и phaC в M. extorquens G10 и AM1 привело к повышению уровня синтеза ПГБ метилобактериями, при этом скорость роста трансформантов практически не изменилась. Описанные приемы генной модификации метаболизма потенциального
D600 ПГБ, %
1,5 ♦ 1 120
1,25 2 100
1 80
0,75 У > 60
0,5 /к 40
0,25 —V 20
0 4
0 25 50 75 100 125
Рис. 5. Кривые роста (1, 2) и накопления ПГБ (3, 4) M. extorquens G10, трансформированной векторами pCM160 (1, 3 — контроль) и pPHA (2, 4 —
несущие ген ПГБ-синтазы)
продуцента ПГБ M. extorquens G10 и дальнейшие исследования свойств ПГБ-синтаз метилобактерий могут представить интерес при конструировании продуцента ПГБ из метанола.
Авторы признательны д.б.н. Хмелениной В.Н. за помощь в подготовке статьи и к.х.н. Шляпникову М.Г. (ИБФМ РАН) за секвенирование ДНК.
Список литературы
1. Anderson A.J., Dawes E.A. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates // Microbiol Rev. 1990 V.54, №4. P.450-472.
2. Говорухина Н.И., Троценко Ю.А. Содержание поли-^-оксибутирата у метилотрофных бактерий с различными путями первичной ассимиляции метанола // Прикл. биохимия и микробиол. 1991. Т.27, №1. С.98-101.
3. Короткова Н.А., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Биосинтез сополимера 3-оксибутирата/3-оксивалерата метилобактериями с сериновым путем метаболизма // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т.33, №4. С.398-403.
4. Suzuki Т., Yamane Т., Shimizu S. Mass production of poly-^-hydroxybutyric acid by fully automatic fed-batch culture of methylotroph // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. V.23. P.322-329.
5. Короткова Н.А., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Биосинтез сополимера
3-гидроксибутирата/3-гидроксивалерата Methylobacterium extorquens:
метаболизм пропанола, пропионата и валерата // Микробиология. 1999. Т.68, №3. С.351-359.
6. Methylotrophy in Methylobacterium extorquens AM1 from a genomic point of view / L. Chistoserdova [et al.] // J. Bacteriol. 2003. V.185. P.2980-2987.
7. Genome of Methylobacillus flagellatus, molecular basis for obligate methylotrophy, and polyphyletic origin of methylotrophy / L. Chistoserdova [et al.] // J. Bacteriol. 2007. V.189. P.4020-4027.
8. Anthony C. The Biochemistry of Methylotrophs. London: Academic, 1982. P.113-114.
9. Korotkova N, Lidstrom M.E., Chistoserdova L. Identification of genes involved in the glyoxylate regeneration cycle in Methylobacterium extorquens AM1, including two new genes, meaC and meaD // J. Bacteriol. 2005. V.187. P.1523-1526.
10. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway / T.J. Erb [et al.] // PNAS. 2007. V.104, №25. P.10631-10636.
11. Korotkova N, Lidstrom M.E. Connection between poly-beta-hydroxybutyrate biosynthesis and growth on C(1) and C(2) compounds in the methylotroph Methylobacterium extorquens AM1 // J. Bacteriol. 2001. V.183. P.1038-1046.
12. Nunn D.N., Lidstrom M.E. Isolation and complementation analysis of 10 methanol oxidation mutant classes and identification of the methanol dehydrogenase structural gene of Methylobacterium sp. strain AM1 // J Bacteriol. 1986. V.166. P.581-590.
13. Attwood M.M., Harder W. A rapid and specific enrichment procedure for Hyphomi-crobium sp // Ant. Leeuwenhoek. 1972. V.38. P.369-377.
14. Marmur J.A. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms // J. Mol. Biol. 1961. V.63. P.1208-1218.
15. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 c.
16. Marx C.J., Lidstrom M.E. Development of improved versatile broad-host-range vectors for use in methylotrophs and other Gram-negative bacteria // Microbiology (UK). 2001. V.147. P.2065-2075.
17. Dennis J.J., Zystra G.J. Plasposons: modular self-cloning minitransposon derivatives for rapid genetic analysis of Gram-negative bacterial genomes // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64, №7. P.2710-2715
18. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V.227. P.680-685.
19. Inoue H, Nojima H, Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. V.96. P.23-28.
20. Kornberg H.L., Krebs H.A. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modified tricarboxylic acid cycle // Nature. 1957. V.179. P.988-991.
21. Valentin H.E., SteJnbucheJ, A. Application of enzymatically synthesized short-chain-length hydroxy fatty acid coenzyme A thioesters for assay of polyhydroxyalkanoic acid synthases // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V.40. P.699-709.
22. Определение поли-3-оксибутирата и сополимера 3-оксибутирата-3-оксивалерата в микробной биомассе методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии / Н.А. Короткова [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. 1997. Т.33. С.339-343.
Ешинимаев Булат Цыденжапович (eshinimaev@gmail.com), к.б.н., научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Лапин Александр Александрович (lapin.alexander@rambler.ru), аспирант, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Путино.
Бесчастный Александр Павлович (beschastny@ibpm.pushchino.ru), к.б.н., научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Путино.
Троценко Юрий Александрович (trotsenko@ibpm.pushchino.ru), д.б.н., профессор, зав. лабораторией, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Genetic modification of polyhydroxybutyrate synthesis in Methylobacterium extorquens
B.C. Eshinimaev, A.A. Lapin, A.P. Beschastny, Yu.A. Trotsenko
Abstract. Heterologous expression of the aceA gene from Escherichia coli К12 under methanol dehydrogenase promoter into the Methylobacterium extorquens GlO and AMl accomplish of the isocitrate lyase activity appearance (l5 nmol/min/mg protein) and of the PHB synthesis increment in the transformant cells in comparison with an original strains. Mutants with inserted the aceA E. coli gene into M. extorquens GlO chromosome also had higher level of the PHB in cell. The phaC gene encoding the polyhydroxybutyrate (PHB) synthase of the M. extorquens AMl introduction into M. extorquens GlO resulted in increasing activity of PHB-synthase and in alteration of the biopolymer accumulation.
Keywords: polyhydroxybutyrate, biosynthesis, cloning, polyhydroxybutyrate synthase, isocitrate lyase, Methylobacterium extorquens.
Eshinimaev Bulat (eshinimaev@gmail.com), candidate of biological sciences, research scientist, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Lapin Alexander (lapin.alexander@rambler.ru), postgraduate student, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Beschastny Alexander (beschastny@ibpm.pushchino.ru), candidate of biological sciences, research scientist, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Trotsenko Yuri (trotsenko@ibpm.pushchino.ru), doctor of biological sciences, professor, head of laboratory, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Поступила 21.10.2010
